徐旭

歐前胡素下調(diào)MCL-1提高口腔鱗癌干細胞順鉑敏感性實驗研究

徐旭

目的探討中藥白芷活性成分歐前胡素增強順鉑對口腔鱗癌干細胞的殺傷活性及其機制。方法流式細胞術檢測歐前胡素和順鉑對Cal27細胞系的腫瘤干細胞種群比例的影響。MTT法和Annexin V染色法檢測歐前胡素對順鉑殺傷Cal27腫瘤干細胞能力的影響。利用Western blot方法驗證歐前胡素是否調(diào)節(jié)Cal27腫瘤干細胞MCL-1的表達。運用JC-1染色、Annexin V染色及Western blot方法研究歐前胡素影響順鉑療效的信號通路。結果順鉑組Cal27細胞系的腫瘤干細胞種群比例顯著高于對照組（19.4%比8.5%，P＜0.05），而順鉑聯(lián)合歐前胡素組后腫瘤干細胞種群比例下降至11.5%（P＜0.05）。順鉑聯(lián)合歐前胡素組對Cal27腫瘤干細胞的細胞活力的抑制率為（57.4± 3.4）%，凋亡誘導率為（36.7±2.1）%，均顯著高于歐前胡素組的（7.9±6.6）%與（4.2±0.4）%（P＜0.05）和順鉑組的（11.8±0.8）%與（8.4±0.5）%（P＜0.05）。順鉑聯(lián)合歐前胡素組Cal27腫瘤干細胞的線粒體膜電位顯著低于歐前胡素組和順鉑組（0.37±0.02比0.96±0.04、0.86±0.03，P＜0.05）。順鉑聯(lián)合歐前胡素組處理的Cal27腫瘤干細胞的caspase-9和caspase-3的活化水平分別為0.48±0.03、0.56±0.04，顯著高于歐前胡素組的0.03±0.01（P＜0.05）、0.03±0.01（P＜0.05）和順鉑組的0.10±0.02（P＜0.05）、0.12± 0.02（P＜0.05）。與對照組比較，歐前胡素處理后Cal27腫瘤干細胞的MCL-1表達水平顯著降低（0.29±0.02比0.89±0.05，P＜0.05），而順鉑對MCL-1的表達無影響（0.90±0.05比0.89±0.05，P＞0.05）。結論歐前胡素可通過下調(diào)MCL-1的表達提高口腔鱗癌干細胞對順鉑的敏感性。

口腔鱗癌干細胞；MCL-1；歐前胡素；順鉑；線粒體；凋亡

腫瘤干細胞是腫瘤組織中一小群具有高度致瘤性的細胞，它們具有干細胞樣的特征，能快速自我更新，導致腫瘤的術后復發(fā)且對化療有較強的抵抗性[1-2]?？谇击[癌是危害人類健康的常見腫瘤之一，盡管現(xiàn)在治療手段有了很大的進步，但該病預后仍不十分理想，患者的五年存活率仍很低[3]，對于不能進行手術的患者，化療是重要的治療手段，因此提高腫瘤細胞尤其是腫瘤干細胞對化療藥物的敏感性有十分重要的意義。本文目的在于研究歐前胡素是否能增強順鉑對口腔鱗癌干細胞的殺傷活性并研究其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 噻唑藍（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、歐前胡素、順鉑、Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒（美國 Sigma-Aldrich）。細胞蛋白提取液、髓細胞白血病基因1 （MCL-1）抗體、活化型半胱天冬酶-9（cleaved caspase-9）抗體、活化型半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）抗體和β-肌動蛋白（β-actin）抗體（美國Cell Signaling）。JC-1染料（江蘇碧云天生物科技有限公司）。CD44流式抗體 （美國 SantaCruz）。脂質(zhì)體 2000 （Lipofectamine 2000）（美國Invitrogen）。增強型化學發(fā)光底物（ECL）試劑盒（美國Pierce）。

1.2 細胞培養(yǎng) 人口腔鱗癌細胞系Cal27購于美國美國模式菌種收集中心（ATCC）。Cal27腫瘤干細胞用流式細胞儀進行分選，CD44陽性的Cal27細胞即為Cal27腫瘤干細胞[4]。所有腫瘤細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。

1.3 質(zhì)粒構建和轉(zhuǎn)染 將MCL-1基因cDNA全長序列（Gene ID：NM_001197320）以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構建成MCL-1重組真核表達質(zhì)粒[5]。使用Lipofectamine 2000按照試劑操作說明書步驟將2μg/mL MCL-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Cal27腫瘤干細胞中。

1.4 Cal27腫瘤干細胞所占比例測定 將Cal27細胞按1×106/孔接種在6孔板上，分為對照組、歐前胡素組、順鉑組、順鉑+歐前胡素組并按文獻所述進行處理[6]。對照組為Cal27細胞不加藥物培養(yǎng)48h，順鉑組在Cal27細胞中加入5μmol/L的順鉑培養(yǎng)48h，歐前胡素組在Cal27細胞中加入10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h，順鉑+歐前胡素組在Cal27細胞中加入5μmol/L的順鉑和10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后將細胞用生理鹽水洗滌兩次，加入CD44抗體在暗處孵育20min后將細胞用流式細胞儀進行分析，計算CD44陽性的Cal27細胞所占總的Cal27細胞的比例。

1.5 細胞活力檢測 Cal27腫瘤干細胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對照組、歐前胡素組、順鉑組、順鉑+歐前胡素組和順鉑+歐前胡素+MCL-1質(zhì)粒組。對照組為Cal27腫瘤干細胞不加藥物培養(yǎng)48h，順鉑組在Cal27腫瘤干細胞中加入5μmol/L的順鉑培養(yǎng)48h，歐前胡素組在Cal27腫瘤干細胞中加入10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h，順鉑+歐前胡素組在 Cal27腫瘤干細胞中加入 5μmol/L的順鉑和10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h，順鉑+歐前胡素+ MCL-1質(zhì)粒組先將 2μg/mL的 MCL-1質(zhì)粒用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入Cal27腫瘤干細胞培養(yǎng)24h，之后更換培養(yǎng)基再加入5μmol/L的順鉑和10 μmol/L的歐前胡素繼續(xù)培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后在培養(yǎng)體系中加入20μL 5g/L MTT再培養(yǎng)4h，棄去上清，往孔中加入150μL二甲亞砜，在570nm波長下用酶標儀檢測OD值，細胞活力抑制率用以下公式計算：抑制率=（OD對照組-OD治療組）/OD對照組×100%。

1.6 細胞凋亡實驗 Cal27腫瘤干細胞按2×106/孔接種在6孔板上，分為對照組、歐前胡素組，順鉑組、順鉑+歐前胡素組和順鉑+歐前胡素+MCL-1質(zhì)粒組。對照組為Cal27腫瘤干細胞不加藥物培養(yǎng)48h，順鉑組在Cal27腫瘤干細胞中加入5μmol/L的順鉑培養(yǎng)48h，歐前胡素組在Cal27腫瘤干細胞中加入10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h，順鉑+歐前胡素組在Cal27腫瘤干細胞中加入5μmol/L順鉑和10μmol/L歐前胡素培養(yǎng)48h，順鉑+歐前胡素+MCL-1質(zhì)粒組先將2μg/mL的MCL-1質(zhì)粒用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入Cal27腫瘤干細胞培養(yǎng)24h，之后更換培養(yǎng)基再加入5μmol/L的順鉑和10μmol/L的歐前胡素繼續(xù)培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后將細胞用生理鹽水洗滌兩次，按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入細胞中孵育20min，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比表示。

1.7 Western blot實驗 將Cal27腫瘤干細胞按2× 106/孔接種在6孔板上，分為對照組、歐前胡素組、順鉑組、順鉑+歐前胡素組和順鉑+歐前胡素+MCL-1質(zhì)粒組。對照組為Cal27腫瘤干細胞不加藥物培養(yǎng)48h，順鉑組在Cal27腫瘤干細胞中加入5μmol/L的順鉑培養(yǎng)48h，歐前胡素組在Cal27腫瘤干細胞中加入10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h，順鉑+歐前胡素組在 Cal27腫瘤干細胞中加入 5μmol/L的順鉑和10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h，順鉑+歐前胡素+ MCL-1質(zhì)粒組先將2μg/mL的MCL-1質(zhì)粒用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入Cal27腫瘤干細胞培養(yǎng)24h，之后更換培養(yǎng)基再加入5μmol/L的順鉑和10μmol/L的歐前胡素繼續(xù)培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后將細胞用生理鹽水洗滌兩遍并提取總蛋白質(zhì)。將蛋白提取液用12.5%SDS-PAGE進行電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用 MCL-1抗體、cleaved caspase-9抗體、cleaved caspase-3抗體或β-actin抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。蛋白灰度值分析用Image J軟件處理。目標蛋白的相對表達水平用其蛋白灰度值與βactin灰度值的比值表示。

1.8 線粒體膜電位測定 線粒體膜電位用JC-1染色進行測定[7]。將Cal27腫瘤干細胞按2×106/孔接種在6孔板上，分為對照組、歐前胡素組、順鉑組、順鉑+歐前胡素組。對照組為Cal27腫瘤干細胞不加藥物培養(yǎng)48h，順鉑組在Cal27腫瘤干細胞中加入5μmol/L的順鉑培養(yǎng)48h，歐前胡素組在Cal27腫瘤干細胞中加入10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h，順鉑+歐前胡素組在Cal27腫瘤干細胞中加入5μmol/L的順鉑和10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后將細胞用生理鹽水洗滌兩遍，加入JC-1染料在暗處孵育20min，再用生理鹽水洗滌兩遍后用流式細胞儀檢測JC-1的熒光強度。治療組的相對線粒體膜電位為各治療組的JC-1熒光強度與對照組熒光強度的比值。

2 結果

2.1 歐前胡素顯著提高順鉑對Cal27腫瘤干細胞的殺傷活性 流式細胞實驗結果表明，順鉑單獨治療可提高Cal27細胞系中的腫瘤干細胞種群比例，而聯(lián)用歐前胡素后，Cal27腫瘤干細胞的比例受到抑制而顯著下降（P＜0.05），見表1。細胞活力實驗和凋亡實驗結果表明聯(lián)用歐前胡素后，順鉑對Cal27腫瘤干細胞的殺傷活性顯著增強，見表2。

表1 歐前胡素減弱順鉑對Cal27腫瘤干細胞種群比例的影響（±s）

表1 歐前胡素減弱順鉑對Cal27腫瘤干細胞種群比例的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與順鉑+歐前胡素組比較，#P＜0.05

表2 歐前胡素顯著提高順鉑對Cal27腫瘤干細胞的抗腫瘤活性（±s）

表2 歐前胡素顯著提高順鉑對Cal27腫瘤干細胞的抗腫瘤活性（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與順鉑+歐前胡素組比較，#P＜0.05

組別對照組順鉑組歐前胡素組順鉑+歐前胡素組孔數(shù) 順鉑（μmol/L）歐前胡素（μmol/L）3 3 3 3 0 5 0 5 0 0 1 0 10細胞活力抑制率（%）0 11.8±0.8*#7.9±0.6*#57.4±3.4凋亡誘導率（%）2.1±0.3 8.4±0.5*#4.2±0.4*#36.7±2.1*

2.2 歐前胡素通過線粒體途徑提高Cal27腫瘤干細胞對順鉑的敏感性 實驗結果表明，歐前胡素能顯著增強順鉑對Cal27腫瘤干細胞線粒體膜電位的損傷，進而誘導Cal27腫瘤干細胞中caspase-9和caspase-3的活化，見表3。

2.3 歐前胡素通過下調(diào)MCL-1的表達水平增強Cal27腫瘤干細胞對順鉑的敏感性 實驗結果發(fā)現(xiàn)，歐前胡素能顯著下調(diào)Cal27腫瘤干細胞中抗凋亡蛋白MCL-1表達水平，而順鉑對MCL-1的表達無影響。將Cal27腫瘤干細胞用MCL-1質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染后再用順鉑聯(lián)合歐前胡素進行治療，發(fā)現(xiàn)MCL-1質(zhì)粒能顯著抑制順鉑聯(lián)合歐前胡素對Cal27腫瘤干細胞的殺傷活性和凋亡誘導效應，見表4。

3 討論

歐前胡素是從白芷根中提取的香豆素類天然活性物質(zhì)，據(jù)報道有一定的抗腫瘤效應，并且能提高化療藥物對腫瘤細胞的殺傷活性[6，8]，然而其對腫瘤干細胞的生物作用至今卻仍很少報道。本研究發(fā)現(xiàn)，歐前胡素能顯著提高口腔鱗癌干細胞對順鉑的敏感性，證實歐前胡素聯(lián)合化療藥物對腫瘤干細胞治療存在協(xié)同效應。

表3 歐前胡素通過線粒體途徑提高Cal27腫瘤干細胞對順鉑的敏感性（±s）

表3 歐前胡素通過線粒體途徑提高Cal27腫瘤干細胞對順鉑的敏感性（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.0；與順鉑+歐前胡素組比較，#P＜0.05；cleaved caspase：活化型半胱天冬酶

?

表4 歐前胡素通過MCL-1途徑提高順鉑對Cal27腫瘤干細胞的抗腫瘤活性（±s）

表4 歐前胡素通過MCL-1途徑提高順鉑對Cal27腫瘤干細胞的抗腫瘤活性（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.0；與順鉑+歐前胡素組比較，#P＜0.05。MCL-1：抗凋亡蛋白

組別對照組順鉑組歐前胡素組順鉑+歐前胡素組順鉑+歐前胡素+MCL-1質(zhì)粒組孔數(shù) 順鉑（μmol/L）歐前胡素（μmol/L）MCL-1質(zhì)粒（μg/mL）3 3 3 3 3 0 5 0 5 5 0 0 1 0 10 10 0 0 0 0 2 MCL-1相對表達水平0.89±0.05 0.90±0.05*#0.29±0.02* 0.31±0.02 0.97±0.06#細胞活力抑制率（%）0 12.0±0.8*#7.8±0.6*#58.6±3.3 18.4±1.1#細胞凋亡誘導率（%）2.2±0.3 8.5±0.6*#4.1±0.4*#37.3±2.2 9.9±0.7#

近期研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞的存在是引起腫瘤化療失敗的關鍵因素，腫瘤干細胞的高度自我更新能力和對化療藥物的抵抗性往往導致腫瘤的復發(fā)[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，當用順鉑單獨處理口腔鱗癌細胞系Cal27后，Cal27細胞系中CD44陽性的腫瘤干細胞比例顯著提高，這可能是因為腫瘤干細胞對順鉑的敏感性顯著低于非腫瘤干細胞，致使Cal27腫瘤干細胞在順鉑治療下存活下來從而引起所占比例的升高。當用歐前胡素進行聯(lián)合治療后，由于Cal27腫瘤干細胞在歐前胡素的作用下對順鉑的敏感性顯著提高，使腫瘤干細胞的占比顯著下降，表明歐前胡素能以腫瘤干細胞為靶點提高順鉑對口腔鱗癌的治療效果。

CL-1是Bcl-2抗凋亡蛋白家族成員，定位于線粒體外膜上，通過與一些促凋亡蛋白如Bim、Bak和NOXA等形成異二聚體使之失活從而穩(wěn)定線粒體外膜，它能阻斷細胞色素C等促凋亡物質(zhì)從線粒體中釋放進而發(fā)揮抗凋亡作用[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，MCL-1在多種腫瘤細胞中均高表達，且MCL-1的表達程度與腫瘤細胞對化療藥物的敏感性呈負相關[13-14]。在本研究中，歐前胡素在Cal27腫瘤干細胞中的直接靶點是MCL-1蛋白，它能顯著降低Cal27腫瘤干細胞中MCL-1的表達水平。當在口腔鱗癌干細胞中轉(zhuǎn)染MCL-1質(zhì)粒增加它的表達水平后，歐前胡素聯(lián)合順鉑對腫瘤干細胞線粒體的損傷作用受到顯著抑制，降低細胞活力抑制力和細胞凋亡誘導率。表明歐前胡素通過抑制MCL-1的表達發(fā)揮對順鉑的協(xié)同作用，這些結果均與文獻報道一致。

本研究結果顯示，歐前胡素能顯著提高口腔鱗癌干細胞對順鉑的敏感性。其機制為歐前胡素通過下調(diào)MCL-1的表達促進順鉑對腫瘤干細胞線粒體的損傷作用，進而誘導細胞caspase的活化和凋亡的發(fā)生。這些研究為如何提高順鉑治療效果提供了新的思路和理論依據(jù)。

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（收稿：2016-06-03 修回：2016-07-04）

Imperatorin Increased the Sensitivity of Oral Cancer Stem Cells to Cisplatin Via Down-regulating the Ex-pression of MCL-1

XU Xu.Department of Stomatology,Quzhou People's Hospital,Quzhou(324000),China

ObjectiveTo investigate the role of imperatorin in cisplatin-induced cell death in oral cancer stem cells and the underlying mechanism.MethodsThe percentage of cancer stem cell population in the Cal27 cell line treated with imperatorin and cisplatin was assessed by flow cytometry.MTT assay and Annexin V staining was performed to evaluate the effect of imperatorin on the cisplatin-induced cell death and apoptosis in the Cal27 cancer stem cells.ResultsThe Cal27 cancer stem cell population in single cisplatin treatment group was significantly higher than that in control group (19.4%vs 8.5%,P＜0.05),but lower than 11.5%of cisplatin plus imperatorin group(P＜0.05).The inhibitory rate of cell viability and the apoptotic rate of Cal27 cancer stem cells in cisplatin plus imperatorin group was 57.4%±3.4%and 36.7%±2.1%,respectively,which were significantly higher than those in single cisplatin group(7.9%±6.6%and 4.2%±0.4%,P＜0.05)and single imperatorin group(11.8%±0.8%and 8.4%±0.5%,P＜0.05).The mitochondrial transmembrane potential of Cal27 cancer stem cells in cisplatin plus im peratorin group was significantly lower than that in single cisplatin group and single imperatorin group(0.37±0.02 vs 0.96±0.04,0.86±0.03,all P＜0.05).The relative expression of cleaved caspase-9 and caspase-3 in cisplatin plus imperatorin group was significantly higher than that in single cisplatin group and imperatorin group (caspase-9：0.48±0.03 vs 0.03±0.01,0.10±0.02;caspase-3：0.56±0.04 vs 0.03±0.01,0.12±0.02;all P＜0.05).Treatment with im peratorin significantly decreased the expression of MCL-1(0.29±0.02 compared with 0.89±0.05 in control group,P＜0.05), whereas the cisplatin treatment did not change the MCL-1 level(0.90±0.05 vs 0.89±0.05,P＞0.05).Transfectionwith MCL-1 vector significantly impaired the synergistic effect of imperatorin on the cisplatin-induced cell death and apoptosis in the Cal27 cancer stem cells.ConclusionImperatorin increased the sensitivity of oral cancer stem cells to cisplatin via down-regulating the expression of MCL-1.

oral cancer stem cells;MCL-1;imperatorin;cisplatin;mitochondria;apoptosis

浙江省衢州市人民醫(yī)院口腔科（衢州 324000）