高 鑫，李云章

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

ZD制劑對非開放性軟組織損傷模型小鼠肌肉中IL-1β表達(dá)的影響

高 鑫，李云章

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

旨在評價(jià)ZD制劑對非開放性軟組織損傷模型小鼠肌肉中IL-1β表達(dá)的影響。利用文獻(xiàn)報(bào)道的方法，制備小鼠非開放性軟組織損傷模型。于造模后第2天開始進(jìn)行給藥治療，正常組和模型組小鼠不給予任何處理。于造模初期和治療期間觀察各組小鼠的精神活動(dòng)狀態(tài)及肉眼病理學(xué)變化。于造模第2天和第7天，運(yùn)用免疫組化法檢測各組小鼠損傷局部肌肉組織中IL-1β的表達(dá)情況。結(jié)果表明，模型組小鼠在造模初期出現(xiàn)精神沉郁、跛行等現(xiàn)象，損傷局部的肌肉組織出現(xiàn)腫脹和皮下淤血等現(xiàn)象。治療后，小鼠肌肉組織病變明顯減輕。造模第2天，模型組、陽性藥物對照組、ZD制劑治療組小鼠肌肉組織中的IL-1β表達(dá)量顯著高于正常組（P＜0.05）。造模第7天，陽性藥物對照組、ZD制劑治療組小鼠肌肉組織中的IL-1β表達(dá)量顯著低于正常組（P＜0.05）。綜上提示，ZD制劑對小鼠的非開放性軟組織損傷具有緩解作用，其作用機(jī)理可能與抑制炎性介質(zhì)的表達(dá)有關(guān)。

ZD制劑；小鼠；軟組織損傷；肌肉；免疫組化；IL-1β

軟組織損傷是指皮膚、皮下淺深筋膜、肌肉、肌腱、腱鞘、韌帶、關(guān)節(jié)囊、滑膜囊、椎間盤、周圍神經(jīng)血管等組織受到各種急性外傷原因造成的病理性損害。急性軟組織損傷的常規(guī)治療方法是冷敷，對減輕炎癥反應(yīng)、緩解疼痛、消除腫脹及早期功能恢復(fù)有一定的療效［1］，但是局部冷療的使用時(shí)間和溫度沒有一定的限制，持續(xù)冷療有凍傷的危險(xiǎn)，存在一定的風(fēng)險(xiǎn)性。ZD制劑作為一種治療軟組織損傷的復(fù)合中藥制劑，在臨床治療上獲得了較好的效果，但ZD制劑發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制目前還不明確。該研究旨在通過評價(jià)ZD制劑對軟組織損傷模型小鼠肌肉中IL-1β表達(dá)的影響，為闡明ZD制劑發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康昆明種小鼠48只，雌雄各半，體重 18～20 g，合格證件編號：SCXK（蒙）2002-0001。將48只小鼠隨機(jī)分成正常組、模型對照組、陽性藥物對照組和ZD制劑治療組，每組12只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于試驗(yàn)開始前一周進(jìn)行飼養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)，雌雄小鼠分籠飼養(yǎng)。采取自然光照，室溫25℃左右，自由攝食和飲水。水為清潔水，每日更換新鮮水。

圖1 造模第2天各組小鼠肌肉組織中IL-1β表達(dá)情況

1.2 主要試劑 免疫組化EliVision super試劑盒、加強(qiáng)型DAB顯色試劑，購自福州邁新生物開發(fā)有限公司。兔抗鼠IL-1β多克隆抗體，購自Abcam公司。

1.3 ZD制劑的制備 將乳香、沒藥、當(dāng)歸、紅花等12味中藥按照比例粉碎成粉末并進(jìn)行煎煮，先文火加熱，然后逐漸加大火力至沸騰，重復(fù)3次，每次40 min。將藥渣壓榨、過濾、濃縮，配成含1 g/mL生藥的中藥提取原藥藥液。取白凡士林、單硬脂酸甘油酯、硬脂酸及液體石蠟加熱融化為油相。將甘油、蒸餾水和藥液混合加熱，然后加入三乙醇胺和山梨酸鉀溶解為水相。將水相緩慢加入到油相中，然后加入透皮劑冰片和氮銅，在室溫下繼續(xù)攪拌，直至呈黃色半固體，冷凝后即得均勻細(xì)膩的W/O型含藥軟膏。制成的ZD制劑生藥含量為0.32 g/g［2］。

1.4 非開放性軟組織損傷模型的制備及治療 參照周國林等［3］報(bào)道的方法制備小鼠非開放性軟組織損傷模型，模型制備過程如下：于造模前1天，利用8%的硫化鈉對小鼠臀部及大腿部位進(jìn)行脫毛［4］，若有因脫毛損傷皮膚的小鼠，剔除不用；將小鼠側(cè)臥式固定在軟組織打擊器上，對準(zhǔn)大腿中部的外側(cè)軟組織，用50 g砝碼從15 cm高度自由下落，連續(xù)打擊10次，每只小鼠僅打擊1條右腿［5］。打擊后肉眼即可見打擊部位皮下出現(xiàn)淤血，數(shù)分鐘后，觸摸該部位可發(fā)現(xiàn)明顯的腫脹。

于造模第2天開始給藥，將按摩乳涂抹于陽性藥物對照組小鼠患處，將ZD制劑涂抹于ZD制劑治療組小鼠患處，每日2次，共治療5 d。正常組和模型對照組小鼠不給予任何處理。

1.5 小鼠精神活動(dòng)狀態(tài)及肉眼病理學(xué)觀察 于造模初期和治療期間觀察各組小鼠的精神活動(dòng)狀態(tài)，觀察指標(biāo)包括小鼠的精神狀態(tài)，對外界刺激反應(yīng)的敏感程度，采食、飲水量，自主活動(dòng)次數(shù)，毛色、毛質(zhì)等。同時(shí)肉眼觀察各組小鼠軟組織損傷局部的病理學(xué)變化，包括腫脹、淤血、切開后有無出血現(xiàn)象等。

1.6 免疫組化法檢測小鼠肌肉中IL-1β的表達(dá)于造模第2天和第7天的相同時(shí)間點(diǎn)，各組分別取6只小鼠處死，以打擊部位為中心，進(jìn)行肌肉取材，放入福爾馬林中固定［6］。肌肉組織用福爾馬林固定48 h后，采用常規(guī)方法進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片。然后使用二甲苯脫蠟，梯度酒精水化。用3%的H2O2溶液孵育15 min，PBS洗滌3次，每次5 min。滴加1∶500濃度的兔抗鼠IL-1β多克隆抗體，4℃過夜，PBS 洗滌 3 次，每次 5 min。 DAB 顯色［7］，PBS 充分洗滌。用蘇木素復(fù)染1 min，流動(dòng)水沖洗10 min常規(guī)脫水，用中性樹膠封片。

圖2 造模第7天各組小鼠肌肉組織中IL-1β表達(dá)情況

1.7 免疫組化結(jié)果觀察 用Olympus顯微成像系統(tǒng)對切片進(jìn)行觀察，低倍鏡下定位后，拍照采集圖像。采用IPP（Image-Pro Plus）6.0圖像分析軟件對IL-1β免疫組化染色的陽性表達(dá)進(jìn)行定量分析。將圖像中呈現(xiàn)黃色或棕黃色的區(qū)域作為AOI（area of interest）進(jìn)行光密度測定分析，測量平均光密度（AOD，average optical density）值［8］。 每只小鼠取 1塊肌肉進(jìn)行免疫組化染色，每塊肌肉均染色3張，從每個(gè)組織塊的免疫組化染色切片中隨機(jī)選取1張，使用Olympus倒置顯微鏡進(jìn)行圖像采集，每張切片隨機(jī)拍攝4個(gè)不重疊視野的照片（400×），并采用IPP 6.0軟件計(jì)算每個(gè)視野陽性染色的AOD值。每個(gè)觀察時(shí)間各組小鼠分別得到24組試驗(yàn)數(shù)據(jù)，均用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用SPSS 16.0軟件，利用單因素方差分析法對各組小鼠肌肉組織中IL-1β的表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Duncan氏法對各組平均數(shù)進(jìn)行多重比較，P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠精神活動(dòng)狀態(tài)的觀察 正常組小鼠無明顯變化。模型組小鼠在造模初期精神沉郁，對外界刺激反應(yīng)不敏感，采食量減少，自主活動(dòng)次數(shù)減少，毛色變暗、毛質(zhì)凌亂，跛行。治療后，陽性藥物對照組和ZD制劑治療組小鼠與模型組相比較，精神活動(dòng)狀態(tài)有所改善，自主活動(dòng)次數(shù)有所增加。

2.2 肉眼病理學(xué)變化的觀察 正常組小鼠肌肉組織的外觀和顏色均正常，未見充血、水腫。造模后，模型組小鼠肌肉組織出現(xiàn)明顯的腫脹和皮下淤血現(xiàn)象［9］，造模后24 h最明顯；肌肉切開后有血液。治療后，陽性藥物對照組和ZD制劑治療組小鼠肌肉組織腫脹逐漸消退，淤血逐漸消散，病變明顯減輕。

2.3 小鼠肌肉組織中IL-1β的表達(dá)情況 免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，正常組小鼠肌肉組織中的細(xì)胞間質(zhì)僅見少量的棕黃色顆粒。造模第2天，模型組小鼠的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中均可見棕黃色和褐色顆粒，陽性藥物對照組和ZD制劑治療組小鼠均可見大量的陽性著色細(xì)胞，模型組和2個(gè)藥物治療組的陽性著色細(xì)胞明顯多于正常組（見圖1A～D）。由表1可知，造模第2天，模型組、陽性藥物對照組、ZD制劑治療組小鼠的AOD值均顯著高于正常組 （P＜0.05），模型組、陽性藥物對照組、ZD制劑治療組小鼠的AOD值之間的差異均不顯著（P＞0.05），表明模型組、陽性藥物對照組、ZD制劑治療組小鼠肌肉組織中的IL-1β表達(dá)量顯著高于正常組（P＜0.05），但三者之間IL-1β的表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05）。由圖2和表1可知，造模第7天，模型組小鼠的AOD值顯著高于正常組（P＜0.05）、陽性藥物對照組和ZD制劑治療組，而陽性藥物對照組和ZD制劑治療組小鼠的AOD值雖高于正常組小鼠，但差異不顯著 （P＞0.05），提示ZD制劑和陽性對照藥物能夠顯著降低非開放性軟組織損傷模型小鼠肌肉組織的IL-1β表達(dá)量（P＜0.05）。此外，ZD制劑治療組小鼠的AOD值與陽性藥物對照組相比差異不顯著（P＞0.05），提示ZD制劑對于模型小鼠肌肉組織中IL-1β表達(dá)的抑制作用與陽性對照藥物相似。

表1 造模后不同時(shí)間各組小鼠肌肉組織中IL-1β免疫組化染色陽性AOD值

3 討論

軟組織發(fā)生損傷后，機(jī)體通過體液、神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等方面的調(diào)節(jié)，使內(nèi)環(huán)境能夠保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，這主要與損傷組織的自身修復(fù)有關(guān)，而軟組織的自身修復(fù)過程需要多種細(xì)胞核生長因子的參與。目前，對于軟組織損傷后組織修復(fù)情況的研究，最直接的方法是對損傷后的組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查［9］。免疫組化方法可以輔助病理診斷、指導(dǎo)治療、評估預(yù)后［10］，因此，應(yīng)用該方法能夠?qū)p傷的肌肉組織進(jìn)行有效的預(yù)后評價(jià)。石蠟切片在染色過程中不易掉片［11］，具有染色后細(xì)胞形態(tài)清晰、著色強(qiáng)度高、陽性斑塊顯色明顯、假陽性結(jié)果出現(xiàn)率較低等優(yōu)點(diǎn)［12］。

該研究采用免疫組化EliVision二步法對急性軟組織損傷后7 d內(nèi)2個(gè)時(shí)間點(diǎn)IL-1β的表達(dá)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，正常肌肉組織內(nèi)可見陽性細(xì)胞表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度較弱。損傷后的肌肉組織中陽性細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度較高，在造模第2天時(shí)，模型組的陽性信號表達(dá)量最高，損傷后的肌肉組織中陽性細(xì)胞表達(dá)量隨著時(shí)間的延長而減少。造模第7天，模型組、陽性藥物對照組、ZD制劑治療組小鼠肌肉組織中IL-1β的表達(dá)量較造模第2天有所下降。此外，造模第7天，陽性藥物對照組和ZD制劑治療組小鼠肌肉組織中IL-1β的表達(dá)量顯著低于模型組（P＜0.05），提示ZD制劑的體內(nèi)抗炎作用可能是通過抑制炎性介質(zhì)的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

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ZD Preparation Inhibits the Inflammation Caused by Closed Soft Tissue Injuries in Mice by Reducing the Expression of IL-1β

GAO Xin，LI Yun-zhang
（College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018， China）

This study was conducted to evaluate the effect of a traditional Chinese medicine compound ZD preparation on the expression of IL-1β in muscle of closed soft tissue injured mice.The soft tissue injured model in mice was prepared by the reported methods.The mice were treated by ZD preparation and positive control drugs at the 2ndday after modeling,but the mice in healthy group and model group

no treatment.The health situation and pathological changes of the mice were observed by naked eyes during the early stage of modeling and therapy.On days of 2 and 7 of modeling,the immunohistochemistry assay was employed to evaluate the expression of IL-1β in the injured muscle tissue.The results showed that the symptoms of depression and claudication were observed in mice of model group,and swelling as well as subcutaneous congestion was also observed in the injured muscle tissue.After treatment,the mice with soft tissue injuries achieved remission of symptoms.At the 2ndday of modeling,the expression of IL-1β in the injured muscle tissue of mice in model group,positive control drugs treatment group and ZD preparation treatment group was significantly higher than that in the normal muscle tissue of mice in healthy group（P＜0.05）.At the 7thday of modeling,significantly reduced expression of IL-1β in the injured muscle tissue of mice in positive control drugs treatment group and ZD preparation treatment group was found compared with that in the normal muscle tissue of mice in healthy group （P＜0.05）.The combined data suggests that ZD preparation inhibits the inflammation caused by closed soft tissue injuries in mice by reducing the expression of IL-1β.

ZD preparation；mice；soft tissue injuries；muscle；immunohistochemistry；IL-1β

S853.74

A文章順序編號：1672-5190（2016）04-0001-04

2016－04－05

項(xiàng)目來源：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31360629）。

高鑫（1989—），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橘愸R肢蹄病。

李云章（1956—），男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)橘愸R肢蹄病和奶牛疾病。

（責(zé)任編輯：趙俊利）