郭聰，吳海武，2，郭偉良，朱彥博，黃捷暢，周永燦，王世鋒，謝珍玉

（1.海南大學(xué)　海洋學(xué)院　海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　海南省水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南　?？?70228；2.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，海南　海口　571100）

適應(yīng)海南熱帶海洋環(huán)境產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件研究

郭聰1，吳海武1，2，郭偉良1，朱彥博1，黃捷暢1，周永燦1，王世鋒1，謝珍玉1

（1.海南大學(xué)海洋學(xué)院海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室海南省水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?70228；2.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，海南海口571100）

從海南熱帶海水中分離篩選得到10株產(chǎn)脂肪酶菌，其中菌株LD-1302產(chǎn)脂肪酶活性最高。根據(jù)16S rDNA序列分析和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，鑒定該菌為地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis。對(duì)該菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，在pH 8、溫度37℃、鹽度32的條件下，經(jīng)橄欖油誘導(dǎo)，起始濃度為3.75×105CFU/mL的LD-1302搖瓶發(fā)酵48 h時(shí)產(chǎn)脂肪酶活最高，脂肪酶活可達(dá)（34.97±1.45） U/mL。

脂肪酶；地衣芽孢桿菌；篩選；產(chǎn)酶條件

海南管轄海洋面積200多萬km2，海洋資源豐富；不過，當(dāng)前海水養(yǎng)殖產(chǎn)生的含大量殘餌、動(dòng)物殘?bào)w的養(yǎng)殖廢水及其它來源油脂性污水的任意排放，造成了該海區(qū)海洋環(huán)境的存在脂肪污染，嚴(yán)重影響當(dāng)?shù)睾Ｑ笊鷳B(tài)環(huán)境的健康（周永燦等，2013；Nejidat，2005）。因此，安全有效清除海南熱帶水產(chǎn)養(yǎng)殖和海洋環(huán)境中的脂肪是熱帶海洋生態(tài)環(huán)境修復(fù)和可持續(xù)利用的重要前提。脂肪酶是催化長(zhǎng)鏈脂肪酸甘油酯水解和合成的羧酸酯酶，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物，其中以微生物脂肪酶資源最為豐富；因其廣泛的底物特異性、在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定性好、易于大規(guī)模生產(chǎn)及純化等優(yōu)點(diǎn)而成為當(dāng)代酶工業(yè)最受矚目的酶種之一（李鑫玲等，2011；彭立鳳等，2006；閆云君等，2006），也是環(huán)境中脂肪降解的主要原動(dòng)力。

海南為我國(guó)唯一的熱帶沿海地區(qū)，在長(zhǎng)期自然進(jìn)化過程中，海南地區(qū)形成了獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu)，存在豐富的產(chǎn)脂肪酶芽孢桿菌資源，為安全解決海南熱帶水產(chǎn)養(yǎng)殖和海洋環(huán)境中脂肪污染問題奠定了重要基礎(chǔ)（朱彥博，2013；吳海武，2014）。不過，有關(guān)產(chǎn)脂肪酶芽孢桿菌的海南土著菌種的相關(guān)研究迄今尚未見報(bào)道。為此，本文試圖從海南熱帶海洋環(huán)境中篩選產(chǎn)脂肪酶芽孢桿菌并闡述其產(chǎn)酶條件，這對(duì)于應(yīng)用脂肪酶生物技術(shù)處理被油脂污染的熱帶海洋水體特別是熱帶養(yǎng)殖水體以及可持續(xù)發(fā)展熱帶海洋經(jīng)濟(jì)具有重大意義。

1　材料與方法

1.1材料

樣品：從海南省樂東縣球港、陵水縣新村港、東方市板橋和三亞市南山等地的熱帶海水養(yǎng)殖環(huán)境中采集10份水樣。

主要試劑：蛋白胨、橄欖油（主要脂肪酸鏈長(zhǎng)為C16-C18）、椰子油（主要脂肪酸鏈長(zhǎng)為C8-C20）、葵花籽油（主要脂肪酸鏈長(zhǎng)為C16-C22）、聚乙烯醇、蔗糖、4%聚乙烯醇（PVA）溶液、1 mg/mL羅丹明B溶液和橄欖油乳化液（4%PVA溶液：橄欖油=3:1，v/v）。

主要儀器：PCR儀 （型號(hào)：5331，德國(guó)Eppendorf股份公司）；冷凍離心機(jī)（型號(hào)：5180，德國(guó)Eppendorf股份公司）；食品勻漿機(jī)（型號(hào)：HFJ-10，上海楚定分析儀器有限公司）；倒置熒光相差微分?jǐn)?shù)碼顯微鏡（型號(hào)：DM2500，德國(guó)Leica儀器有限公司）。

1.2培養(yǎng)基

改良富集液體培養(yǎng)基：（NH4）2SO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO41 g/L，蛋白胨5 g/L，橄欖油乳化液100 mL/L，滅菌海水定容至1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

改良羅丹明B顯色初篩培養(yǎng)基：（NH4）2SO42g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，蛋白胨5 g/L，瓊脂15 g/L，橄欖油乳化液100 mL/L，滅菌海水定容至1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min；滅菌后冷卻至60℃加入6 mL羅丹明B溶液。

改良復(fù)篩固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，MgSO4· 7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，橄欖油乳化液100 mL/L，瓊脂15 g/L，滅菌海水定容至1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

生長(zhǎng)培養(yǎng)基：（NH4）2SO42 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，蛋白胨5 g/L，橄欖油乳化液100 mL/L，滅菌海水定容至1 L，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5g/L，瓊脂15g/L，滅菌海水1L，pH7.0，121℃滅菌20min。

改良產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，（NH4）2SO41 g/L，K2HPO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，橄欖油10g/L，pH7.0，滅菌海水定容至1L，pH7.0，121℃滅菌20 min。

1.3產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

吸取10mL水樣至100mL滅菌海水中，180r/min、30℃振蕩10 min；并在80℃下水浴15 min，取出、靜置。吸取10 mL上清菌液至100 mL富集液體培養(yǎng)基中，在180 r/min、30℃下培養(yǎng)。2 d后，吸取5 mL富集培養(yǎng)菌液至100 mL新鮮的富集液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行二次富集，如此連續(xù)富集培養(yǎng)3次。吸取1 mL第3次富集培養(yǎng)菌液至9 mL滅菌海水中，依次倍比稀釋至10-4；吸取100 μL稀釋度為10-4的菌液在羅丹明B顯色初篩培養(yǎng)基上涂布，挑選在羅丹明B顯色初篩培養(yǎng)基上水解圈較大且在350 nm紫外燈下橙黃色熒光亮斑較大的菌落為篩選分離菌株。挑取菌落繼續(xù)于羅丹明B顯色初篩培養(yǎng)基上重復(fù)3次劃線分離培養(yǎng)，直到菌落形態(tài)一致。挑取羅丹明B顯色初篩培養(yǎng)基上的單菌落至復(fù)篩固體培養(yǎng)基上重復(fù)劃線培養(yǎng)，直至單菌落不再染上羅丹明B顯色劑。挑選在復(fù)篩固體培養(yǎng)基上的單菌落至改良產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于200 r/min、30℃下振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定篩選得到菌株的產(chǎn)脂肪酶活性，以最優(yōu)產(chǎn)脂肪酶活性的菌株為目的菌株。

1.4菌株鑒定

1.4.1菌落形態(tài)及鏡檢

挑取純化單菌落于計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基上劃線，參照沈萍等的方法進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色（沈萍等，2005）。

1.4.216S rDNA序列測(cè)定和分析

單菌落振蕩培養(yǎng)18 h后，按照北京艾德萊生物科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒的說明提取目的菌株DNA，對(duì)菌株進(jìn)行16S rDNA序列的 PCR擴(kuò)增與測(cè)序 （徐先棟 等，2012）。

1.4.3生理生化鑒定

挑取純化單菌落，參照東秀珠的方法進(jìn)行VP測(cè)定、丙酸鹽、淀粉水解、明膠水解、V-P培養(yǎng)物終pH>7、檸檬酸鹽、55℃、pH 5.7、pH 6.8、NaCl 5%、NaCl 7%等理化指標(biāo)試驗(yàn)（東秀珠等，2001）。

1.5活菌總數(shù)計(jì)數(shù)

吸取6 mL目的菌株過夜培養(yǎng)液（于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-12 h）轉(zhuǎn)入盛有60 mL生長(zhǎng)培養(yǎng)基的三角瓶中，混勻后分別吸取5 mL混合液至標(biāo)記0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20的12支無菌大試管中。于30℃、250 r/min條件下培養(yǎng)，并于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)將標(biāo)有對(duì)應(yīng)時(shí)間的大試管取出，分別吸取1 mL各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)培養(yǎng)菌液至9 mL滅菌海水中，依次倍比稀釋至10-5。吸取100 μL稀釋度為10-5的菌液于計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基上涂布、計(jì)數(shù)。

1.6脂肪酶活力的測(cè)定

在40℃、pH 7.5條件下，以1 min催化水解反應(yīng)底物（橄欖油）釋放1 μmol脂肪酸的酶量定義為1個(gè)脂肪酶活力單位（U） （施巧琴，1998）。搖瓶發(fā)酵48 h后，吸取發(fā)酵上清液于8 000 r/min、4℃下離心5 min，吸取上清酶液備用，參照李建武等的方法測(cè)定所篩菌株的產(chǎn)脂肪酶活（李建武等，1994）

1.7產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

改良產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基瓶裝量為50 mL/250 mL時(shí)，根據(jù)接種量、碳源、pH、溫度、鹽度等影響產(chǎn)脂肪酶的因素，依次進(jìn)行LD-1302產(chǎn)脂肪酶活條件的優(yōu)化。

1.7.1接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

研究菌起始濃度為5×105CFU/mL的LD-1302的接種量分別為0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%時(shí)，對(duì)LD-1302產(chǎn)脂肪酶的影響，每隔24 h測(cè)定酶活一次，連續(xù)測(cè)定3次，篩選最適溫度接種量。

1.7.2碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

研究以1%的橄欖油、椰子油、葵花籽油為碳源時(shí)，對(duì)LD-1302產(chǎn)脂肪酶活性的影響，每隔24 h測(cè)定酶活一次，連續(xù)測(cè)定3次，篩選最適碳源。

1.7.3pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

研究改良產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH分別為5、6、7、8、9時(shí)，對(duì)LD-1302產(chǎn)脂肪酶的影響，每隔24 h測(cè)定酶活一次，連續(xù)測(cè)定3次，篩選最適pH。

1.7.4溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

研究改良產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵溫度分別為27℃、37℃、47℃時(shí)，對(duì)LD-1302產(chǎn)脂肪酶的影響，每隔24 h測(cè)定酶活一次，連續(xù)測(cè)定3次，篩選最適溫度。

1.7.5鹽度對(duì)產(chǎn)酶的影響

研究海水鹽度分別為28、30、32、34、36時(shí)，對(duì)LD-1302產(chǎn)脂肪酶的影響，每隔24 h測(cè)定酶活一次，連續(xù)測(cè)定3次，篩選最適鹽度。

1.8采用SPSS

18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，并采Tukey法對(duì)影響酶活的因素進(jìn)行分析比較。

2　結(jié)果

2.1產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

從羅丹明B初篩固體培養(yǎng)基上篩選得到10株水解圈較大的菌株，這些菌株在350 nm紫外燈下觀察，在菌落周圍均有明顯的橙黃色熒光圈（圖1）。重復(fù)3次搖瓶發(fā)酵后，10株菌的產(chǎn)脂肪酶活性存在一定的差異（表1），其中菌株LD-1302的產(chǎn)脂肪酶活性最高，酶活達(dá)（22.58±0.09） U/mL。發(fā)酵24 h后，LD-1302培養(yǎng)基表面存在不溶于水且浮在水面的絮凝狀乳白色蠟樣物質(zhì)，48 h后該絮凝狀乳白色蠟樣物質(zhì)消失。

圖1　350 nm紫外燈下產(chǎn)脂肪酶菌落周圍的橙黃色熒光圈

表1　10株產(chǎn)脂肪酶菌株的酶活

2.2菌株鑒定結(jié)果

2.2.1菌落形態(tài)及鏡檢

LD-1302菌落形狀不規(guī)則、凸面、白色不透明、邊緣為毛發(fā)狀；革蘭氏染色鏡檢呈紫色，為G+菌；芽孢染色鏡檢可觀察到綠色的芽孢、顯紅色的營(yíng)養(yǎng)體。

2.2.216S rDNA序列測(cè)定與分析

以菌株LD-1302的DNA為模版，經(jīng)細(xì)菌16SrDNA通用引物擴(kuò)增獲得序列長(zhǎng)度為1 512 bp的基因片段，對(duì)其測(cè)序并提交Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)。同源性分析結(jié)果表明，菌株LD-1302的16S rDNA基因序列與Genbank中的BCRC 15413等15株芽孢桿菌屬細(xì)菌的同源性達(dá)99.9%以上，利用MEGA 6.1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明該菌株與地衣芽孢桿菌B.licheniformis聚為一支（圖2）。初步鑒定菌株LD-1302為地衣芽孢桿菌。

2.2.3生理生化鑒定

菌株LD-1302可于55℃下生長(zhǎng)、淀粉水解試驗(yàn)菌落四周出現(xiàn)無色透明圈、明膠水解培養(yǎng)基出現(xiàn)液化現(xiàn)象、V-P試驗(yàn)培養(yǎng)基顯紅色、V-P試驗(yàn)培養(yǎng)基的終pH顯酸性、檸檬酸鹽及丙酸鹽培養(yǎng)基顯藍(lán)色、均可在NaCl 5%、NaCl 7%的肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、在pH5.7、pH6.8的肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，符合對(duì)地衣芽孢桿菌的描述（東秀珠等，2001）。結(jié)合革蘭氏染色、芽孢染色及16S rDNA序列測(cè)定與分析結(jié)果，鑒定菌株LD-1302為地衣芽孢桿菌。

圖2　菌株LD-1302的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3活菌總數(shù)計(jì)數(shù)

地衣芽孢桿菌LD-1302在以橄欖油為唯一碳源的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中延滯期較短，培養(yǎng)6 h活菌總數(shù)達(dá)到最高，為（94.67±3.21）×106CFU/mL，LD-1302在6～20 h內(nèi)生長(zhǎng)較為穩(wěn)定，表明該菌株可利用有機(jī)碳源橄欖油，并在6 h時(shí)將培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本消耗殆盡（圖3）。

圖3　菌株LD-1302的生長(zhǎng)曲線

2.4接種量對(duì)LD-1302產(chǎn)酶活性的優(yōu)化

由圖4可知：以橄欖油為碳源時(shí)，菌株LD-1302的最適接種量為1.50%，即菌株起始接種濃度為3.75×105CFU/mL時(shí)，產(chǎn)脂肪酶活性最高，酶活可達(dá)到（31.64±0.34） U/mL，且在最少接種濃度為1.25×105CFU/mL時(shí)，也存在較高的產(chǎn)脂肪酶活性。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)可知：接種量P=0.00<0.01、時(shí)間P=0.001<0.01，表明接種量、時(shí)間均對(duì)酶活影響極顯著；由接種量-酶活的同類子集結(jié)果可知：接種量為0.50%、2.50%時(shí)，酶活均值分別為15.35 U/mL、17.87 U/mL，在同一子集中，表明兩者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異；接種量為1.00%、2.00%時(shí)，酶活均值分別為20.68 U/mL、19.02 U/mL，在同一子集中，表明兩者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，但產(chǎn)酶效果優(yōu)于前兩者；接種量為1.50%時(shí)，酶活均值為26.53 U/mL，與前四者分屬不同子集，表明為接種量為1.50%時(shí)，產(chǎn)脂肪酶效果最好；由時(shí)間-酶活的同類子集結(jié)果可知：72 h時(shí)，酶活均值為17.72 U/mL，24 h、48 h時(shí)，酶活均值分別為21.35 U/mL、20.60 U/mL，在同一子集中，表明兩者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，但產(chǎn)脂肪酶活優(yōu)于前者。

2.5碳源對(duì)LD-1302產(chǎn)酶活性的影響

圖4　接種量對(duì)LD-1302利用橄欖油產(chǎn)脂肪酶的影

由圖5可知：最適接種量的LD-1302經(jīng)橄欖油、椰子油、葵花籽油誘導(dǎo)，最高產(chǎn)脂肪酶活分別為（23.42±0.84）U/mL、（10.76±0.51）U/mL、（9.77± 0.51）U/mL。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)可知：碳源、時(shí)間的P=0.00<0.01，表明碳源、時(shí)間均對(duì)酶活影響極顯著；由碳源-酶活的同類子集結(jié)果可知：以椰子油、葵花籽油為碳源時(shí)，酶活均值均為8.51 U/mL，在同一子集中，表明兩者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，而以橄欖油為碳源時(shí)，酶活均值為17.54 U/mL，與椰子油、葵花籽油分屬不同子集，表明以橄欖油為碳源時(shí)，產(chǎn)脂肪酶效果最好；由時(shí)間-酶活的同類子集結(jié)果可知：24 h、72 h時(shí)，酶活均值分別為10.84 U/mL、9.06 U/mL，在同一子集中，表明兩者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，48 h時(shí)，酶活均值為14.66 U/mL，與前兩者分屬不同子集，表明48 h時(shí)，產(chǎn)脂肪酶活效果最好；同時(shí)椰子油、葵花籽油也可誘導(dǎo)該菌株產(chǎn)生較高的酶活。

圖5　碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.6pH對(duì)LD-1302產(chǎn)酶活性的影響

接種量為3.75×105CFU/mL、橄欖油、椰子油、葵花籽油為有機(jī)碳源時(shí)，菌株LD-1302在pH 8下有最大脂肪酶活，分別為（29.97±0.33）U/mL、（19.98±0.23）U/mL、（19.98±0.67）U/mL。（圖6（a）、圖6（b）、圖6（c））。

圖6　pH對(duì)LD-1302產(chǎn)脂肪酶的影響

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)可知：pH、時(shí)間的P=0.00<0.01，表明pH、時(shí)間均對(duì)酶活影響極顯著。由圖6-1 pH-酶活的同類子集結(jié)果可知：pH 5、pH 6時(shí)，酶活均值分別為5.69 U/mL、8.21 U/mL，在同一子集中，表明兩者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異；pH 7、pH 9時(shí)，酶活均值分別為14.21 U/mL、13.84 U/mL，在同一子集中，表明兩者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，但產(chǎn)脂肪酶活效果優(yōu)于前兩者；pH 8時(shí)，酶活均值為22.87 U/mL，與pH 5、pH 6、pH 7、pH 9分屬不同子集，表明pH 8時(shí)，產(chǎn)脂肪酶活效果最好；由圖6（a） 時(shí)間-酶活的同類子集結(jié)果可知：24 h、48 h、72 h時(shí)，酶活均值分別為12.36 U/mL、17.65 U/mL、8.88 U/mL，分屬不同子集，表明三者對(duì)酶活的影響有明顯差異，且48 h時(shí)，產(chǎn)脂肪酶活效果最好。由圖6（b）pH-酶活的同類子集結(jié)果可知：pH 5時(shí)，酶活均值為3.18 U/mL；pH 6、pH 7、pH 9時(shí)，酶活均值分別為7.52 U/mL、8.80 U/mL、7.66 U/mL，在同一子集中，表明三者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，但產(chǎn)脂肪酶活效果優(yōu)于前者；pH 8時(shí)，酶活均值為15.98 U/mL，與pH 5、pH 6、pH 7、pH 9分屬不同子集，表明pH 8時(shí)，產(chǎn)脂肪酶活效果最好；由圖6（b） 時(shí)間-酶活的同類子集結(jié)果可知：24 h時(shí)，酶活均值為7.10 U/mL；48 h、72 h時(shí)，酶活均值分別為9.99 U/mL、8.79 U/mL，在同一子集中，表明兩者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，但產(chǎn)脂肪酶活優(yōu)于前者，且在48 h時(shí)酶活均值最大。由圖6（c）pH-酶活的同類子集結(jié)果可知：pH 5、pH 6時(shí)酶活均值分別為4.55 U/mL、6.03 U/mL，且在同一子集中，表明兩者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異；pH 7、pH 9時(shí)酶活均值分別為8.25 U/mL、9.51 U/mL，在同一子集中，表明兩者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，但產(chǎn)脂肪酶活效果優(yōu)于前者；而pH 8時(shí)酶活均值為14.95 U/mL，且與pH 5、pH 6、pH 7、pH 9分屬不同子集，表明pH 8時(shí)，產(chǎn)脂肪酶活效果最好；由圖6（c） 時(shí)間-酶活的同類子集結(jié)果可知：24 h時(shí)酶活均值為5.39 U/mL，48 h、72 h時(shí)酶活均值分別為10.92 U/mL、9.66 U/mL，在同一子集中，兩者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，但產(chǎn)脂肪酶活優(yōu)于前者，且在48 h時(shí)酶活均值最大。因此，菌株LD-1302的最適pH為8，且在pH 5～pH 9的培養(yǎng)條件下也存在一定的產(chǎn)脂肪酶活性。

2.7溫度對(duì)LD-1302產(chǎn)酶活性的影響

接種量為3.75×105CFU/mL、pH為8、以橄欖油、椰子油、葵花籽油為碳源時(shí)，菌株LD-1302在37℃條件下?lián)u瓶發(fā)酵48h后產(chǎn)脂肪酶活最高，依次為（30.97±0.58）U/mL、（20.98±1.2）U/mL、（20.31±0.58）U/mL；產(chǎn)脂肪酶活性跟溫度的關(guān)系均為37℃>27℃>47℃（圖7）。

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)可知：溫度、時(shí)間的P=0.00<0.01，表明溫度、時(shí)間均對(duì)酶活影響極顯著。由7（a）溫度-酶活的同類子集結(jié)果可知：27℃、47℃時(shí)酶活均值分別為16.17 U/ mL、16.35 U/mL，在同一子集中，表明兩者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異；37℃時(shí)酶活均值為25.97 U/ mL，且與前兩者分屬不同子集，表明37℃時(shí)，產(chǎn)脂肪酶活效果優(yōu)于前兩者；由7（a）時(shí)間-酶活的同類子集結(jié)果可知：24 h、72 h時(shí)酶活均值分別為18.54 U/mL、17.16 U/mL，在同一子集中，表明兩者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，而48 h時(shí)酶活均值為22.79 U/mL，且與前兩者分屬不同子集，表明培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，產(chǎn)脂肪酶活效果最好。由7（b）溫度-酶活的同類子集結(jié)果可知：27℃、47℃時(shí)酶活均值分別為10.02 U/mL、9.06 U/mL，在同一子集中，表明兩者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異；37℃時(shí)酶活均值為14.95 U/mL，且與前兩者分屬不同子集，表明37℃時(shí)，產(chǎn)脂肪酶活效果優(yōu)于前兩者；由7（b）時(shí)間-酶活的同類子集結(jié)果可知：24 h、72 h時(shí)酶活均值分別為9.95 U/mL、9.73 U/mL，在同一子集中，表明兩者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，而48 h時(shí)酶活均值為14.35 U/mL，且與前兩者分屬不同子集，表明培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，產(chǎn)脂肪酶活效果最好。由7（c）溫度-酶活的同類子集結(jié)果可知：27℃、37℃、47℃時(shí)酶活均值分別為7.69 U/mL、14.91 U/mL、10.84 U/mL，分屬不同子集，表明三者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活有明顯差異，且37℃時(shí)產(chǎn)脂肪酶活效果最好；由7（c）時(shí)間-酶活的同類子集結(jié)果可知：24h、48h、72 h時(shí)酶活均值分別為7.47 U/ml、15.39 U/ml、10.58 U/ml，分屬不同子集，表明三者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活有明顯差異，且培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，產(chǎn)脂肪酶活效果最好。因此，菌株LD-1302的最適產(chǎn)酶溫度為37℃，且在27℃、47℃的培養(yǎng)條件下也存在一定的產(chǎn)脂肪酶活性。

圖7　溫度對(duì)LD-1302產(chǎn)脂肪酶的影響

2.8鹽度對(duì)LD-1302產(chǎn)酶的優(yōu)化

由圖8可知：以橄欖油為有機(jī)碳源、接種量為3.75×105CFU/mL、pH 8、37℃時(shí)，菌株LD-1302在鹽度32時(shí)有最大脂肪酶活，為（34.97±1.45）U/mL。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)可知：鹽度、時(shí)間的P=0.00<0.01，表明鹽度、時(shí)間均對(duì)酶活影響極顯著；由鹽度-酶活的同類子集結(jié)果可知：鹽度36時(shí)酶活均值為22.88 U/mL；鹽度28、30、34時(shí)酶活均值分別為25.71U/mL、28.60U/mL、27.29U/mL，在同一子集中，表明三者對(duì)產(chǎn)脂肪酶活無明顯差異，但產(chǎn)脂肪酶活效果略優(yōu)于前者；鹽度32時(shí)酶活均值為30.59 U/mL，且與前四者分屬不同子集，表明鹽度32時(shí)，產(chǎn)脂肪酶活效果最好；由時(shí)間-酶活的同類子集結(jié)果可知：24 h、48 h、72 h時(shí)酶活均值分別為27.72U/mL、30.65U/mL、22.68U/mL，分屬不同子集，表明三者對(duì)酶活的影響有明顯差異，且培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，產(chǎn)脂肪酶活效果最好。隨著鹽度的增加或減少，菌株LD-1302的產(chǎn)脂肪酶活性都有一定程度的降低，尤其是隨鹽度的增加，脂肪酶活下降較為顯著。

圖8　鹽度對(duì)LD-1302利用橄欖油產(chǎn)脂肪酶的影響

3　討論

本研究采用高溫水浴法從海南熱帶海水中篩選得到產(chǎn)脂肪酶活性較高的地衣芽孢桿菌LD-1302。當(dāng)前，已報(bào)道的產(chǎn)脂肪酶芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌、芽孢桿菌B5-12、芽孢桿菌WF63、蠟樣芽孢桿菌B.cereus等（胡德朋 等，2008；劉秀花等，2006；黃鷺強(qiáng)等，2010；Akanbi et al.2010），其脂肪酶活依次為2.8 U/mL、24.8U/mL、6.33U/mL、2.51 U/mL，均低于菌株LD-1302的酶活。菌株LD-1302最適應(yīng)用于鹽度32、pH 8、溫度37℃的海水環(huán)境，在鹽度28～36、pH 5～9、27℃～47℃的海水條件下也存在較穩(wěn)定產(chǎn)脂肪酶活性，并可在蔗糖等速效碳源及橄欖油、椰子油和葵花籽油等有機(jī)碳源的誘導(dǎo)下產(chǎn)較高脂肪酶活，這與本研究基于海水環(huán)境下篩選產(chǎn)脂肪酶活性菌株并在該環(huán)境條件下闡述影響其產(chǎn)酶活性的主要環(huán)境因素直接相關(guān)。

有關(guān)學(xué)者篩選的產(chǎn)脂肪酶活性的菌株均是在淡水或者添加NaCl不超過10‰的環(huán)境下篩選的（李鑫玲等，2011；胡德朋等，2008；劉秀花等，2006；黃鷺強(qiáng)等，2010；Akanbi et al，2010；魏濤 等，2011；陳林林等，2010；劉秀花 等，2006；Eltayib et al，2010），盡管這些菌株也存在一定的產(chǎn)脂肪酶活性，但其對(duì)海水環(huán)境的適應(yīng)性尚未見報(bào)道。海水中含有Li+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Sr2+、Ba2+等多種離子，存在較高滲透壓，對(duì)芽孢桿菌等細(xì)菌產(chǎn)脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等活性存在抑制作用（曹煜成等，2005；朱彥博等，2013），導(dǎo)致眾多在鹽度很低及不含上述離子條件下存在產(chǎn)脂肪酶活較高的菌株的產(chǎn)酶活性大大降低甚至消失。從菌株LD-1302的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹可知，雖然菌株LD-1302與Genbank中其他菌株的同源性均為99.9%，卻沒有明顯地高度聚為一支，由此我們推斷菌株LD-1302很可能為海南熱帶海洋環(huán)境中的地衣芽孢桿菌菌株，比目前常用的芽孢桿菌對(duì)熱帶海水環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力。這可能是在長(zhǎng)期的歷史進(jìn)化過程中，海南獨(dú)特的熱帶沿海地理環(huán)境形成了獨(dú)特的微生物細(xì)菌地理種群。

橄欖油的主要成分為棕櫚酸C16H32O2、亞油酸C18H32O2、油酸 C18H34O2、硬脂酸C18H36O2等的甘油三酯（湯富彬等，2013），菌株LD-1302產(chǎn)生的脂肪酶可將這些甘油三酯分解為C16-C18的游離高級(jí)脂肪酸，這些游離高級(jí)脂肪酸不溶于水浮于水的表面形成絮凝狀乳白色蠟樣物質(zhì)，這是菌株LD-1302發(fā)酵24 h后在三角瓶中產(chǎn)生的浮于培養(yǎng)基表面的絮凝狀乳白色蠟樣物質(zhì)的原因，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，這些絮凝狀乳白色蠟樣高級(jí)脂肪酸的混合物逐漸消失，推測(cè)菌株LD-1302除了產(chǎn)脂肪酶外，還可能產(chǎn)生烴類水解酶等其它酶類，將絮凝狀乳白色蠟樣物質(zhì)分解為水溶性物質(zhì)或小分子氣體。石油是一類以C6-C20的烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴類為主的油質(zhì)，近年來，我國(guó)海面溢油與深海溢油事件時(shí)有發(fā)生，這嚴(yán)重破壞了海洋生態(tài)環(huán)境，一定程度上制約了海洋經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)健康發(fā)展（馬麗等，2013；廖國(guó)祥等，2011；楊建強(qiáng)等，2011），而微生物修復(fù)技術(shù)因高效安全、環(huán)境友好、無二次污染等優(yōu)勢(shì)，被逐漸應(yīng)用于修復(fù)溢油、深海水產(chǎn)養(yǎng)殖等造成的海洋環(huán)境污染（王麗娜等，2013；鄭天凌等，2001），所以菌株LD-1302很可能對(duì)被石油污染的熱帶海洋環(huán)境存在較好的修復(fù)作用，當(dāng)然，這還有待進(jìn)一步的深入研究。

Akanbi T O,Kamaruzaman A L,Abu Bakar F,et al,2010.Highly thermostable extracellular lipase-producing Bacillus strain isolated from a Malaysian hotspring and identified using 16S rRNA gene sequencing.International Food Research Journal,(17):45-53.

Eltayib H A,Tripti R,Datta M A,2010.Thermostable Alkaline Lipase from a Local Isolate Bacillus subtilis EH 37:Characterization, Partial Purification,and Application in Organic Synthesis.Applied Biochemistry and Biotechnology,(160):2102-2113.

Nejidat A,2005.Nitrification and occurrence of salt-tolerant nitrifying bacteria in the Negev desert soils.FEMS microbiology ecology,52 (1):21-29.

曹煜成，李卓佳，馮娟，等，2005.地衣芽孢桿菌胞外產(chǎn)物消化活性的研究.熱帶海洋學(xué)報(bào)，24（6）：6-12.

陳林林，辛嘉英，張穎鑫，等，2010.粗狀假絲酵母產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件的優(yōu)化.食品工業(yè)科技，31（1）：183-185.

東秀珠，蔡妙英，等，2001.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè).北京：科學(xué)出版社，353-354.

胡德朋，唐家毅，曹昱，等，2008.枯草芽孢桿菌的分離鑒定及酶系分布的研究.水產(chǎn)科學(xué)，27（2）：86-88.

黃鷺強(qiáng)，謝必峰，黃建忠，等，2010.芽孢桿菌WF63脂肪酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì).云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），19（4）：290-293.

李建武，簫能，余瑞元，等，1994.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與方法.北京：北京大學(xué)出版社，3-11.

李鑫玲，孫曉菲，孟楠，等，2011.產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化.食品研究與開發(fā)，32（6）：119-120.

廖國(guó)祥，楊建強(qiáng)，高振會(huì)，等，2011.深海環(huán)境中溢油輸移擴(kuò)散的初步數(shù)值模擬.海洋通報(bào)，30（6）：707-712.

劉秀花，劉茵，梁峰，2006.一株產(chǎn)脂肪酶芽孢桿菌的發(fā)酵條件及酶學(xué)特性.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，45（4）：509-511.

馬麗，李吉鵬，陸志強(qiáng)，等，2013.海洋溢油生態(tài)損害簡(jiǎn)易評(píng)估方法研究.海洋通報(bào)，32（1）：113-120.

彭立鳳，趙汝淇，譚天偉，2006.微生物脂肪酶的應(yīng)用.食品與發(fā)酵工業(yè)，26（3）：68-73.

沈萍，范秀容，李廣武，2005.微生物實(shí)驗(yàn).北京：高等教育出版社，31-32.

施巧琴，1998.堿性脂肪酶的研究.微生物學(xué)通報(bào)，8（3）：108-110.

湯富彬，沈丹玉，劉毅華，等，2013.油茶籽油和橄欖油中主要化學(xué)成分分析.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，28（7）：108-113.

王麗娜，2013.海洋近岸溢油污染微生物修復(fù)技術(shù)的應(yīng)用基礎(chǔ)研究.中國(guó)海洋大學(xué).

魏濤，封盛學(xué)，毛多斌，等，2011.根霉ZZ-3脂肪酶發(fā)酵條件的優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究.食品工程，（2）：20-23.

吳海武，2014.凈化水質(zhì)熱帶芽孢桿菌的篩選、復(fù)方研制及效果研究.海南大學(xué).

徐先棟，謝珍玉，歐陽吉隆，等，2012.褐點(diǎn)石斑魚脫鱗病病原菌的分離與鑒定.海洋科學(xué)，36（2）：67-74.

閆云君，舒正玉，楊江科，2006.細(xì)菌脂肪酶的結(jié)構(gòu)和功能研究進(jìn)展.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，（4）：121-126.

楊建強(qiáng)，張秋艷，羅先香，等，2011.深海溢油生態(tài)損害快速評(píng)估模擬研究.海洋通報(bào)，30（6）：702-706.

鄭天凌，莊鐵城，蔡立哲，等，2001.微生物在海洋污染環(huán)境中的生物修復(fù)作用.廈門大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），40（2）：524-534.

周永燦，張本，謝珍玉，等，2013.海南省潛在海水增養(yǎng)殖區(qū)研究.海洋出版社，289-290.

朱彥博，2013.海南土著芽孢桿菌篩選、復(fù)合及其水質(zhì)凈化效果研究.海南大學(xué).

朱彥博，唐葉玲，陳圣豐，等，2013.鹽度、溫度和pH對(duì)2株海南地衣芽孢桿菌相對(duì)蛋白酶活性的影響.海南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版，31（2）：133-138.

（本文編輯：袁澤軼）

Screening of lipase producing strains adapting to the Hainan tropical marine environment and study on the lipase producing conditions

GUO Cong1,WU Hai-wu1,2,GUO Wei-liang1,ZHU Yan-bo1,HUANG Jie-chang1, ZHOU Yong-can1,WANG Shi-feng1,XIE Zhen-yu1
（1.Key Laboratory of Hainan University for Sustainable Exploitation of Tropical Biotic Resources,Key Laboratory of AquaticBiological Technology of Hainan,College of Marine Science,Hainan University,Haikou 570228；2.Hainan Academy of Agricultural Sciences,Haikou 571100,China）

10 lipase-producing bacterial strains were isolated from Hainan tropical seawater,and the lipase-producing activity of strain LD-1302 was the highest.The strain LD-1302 was identified as Bacillus licheniformis based on 16S rDNA sequence analysis and physiological and biochemical tests.The lipase fermentation condition for the strain LD-1302 was studied on the effect of carbon sources,pH,temperature,inoculation volume,lasting time and salinity,in the seawater environment with pH 8,the salinity of 32,the initial concentration of 3.75×105CFU/mL of LD-1302,which was fermentation of lipase-producing induced by the optimum carbon source of olive oil,and the highest lipase activity was produced in the fermentation of 48 h,and the lipase activity reached the maximal level of(34.97±1.45)U/mL.

lipase;bacillus licheniformis;screening;lipase-producing condition

S913

A

1001-6932（2016）04-0427-09

10.11840/j.issn.1001-6392.2016.04.010

2015-05-07；

2015-07-26

海南省產(chǎn)學(xué)研一體化專項(xiàng)資金項(xiàng)目（CXY20130028）；海南省重大科技項(xiàng)目（ZDZX2013014）；農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2011GB2F200009）；國(guó)家自然科學(xué)基金（41466002）。

郭聰（1989-），女，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖與病害控制技術(shù)研究。電子郵箱：1257303447@qq.com。

謝珍玉，博士，教授。電子郵箱：xiezyscuta@163.com。