吳大同 潘遠(yuǎn)江

（浙江大學(xué)化學(xué)系，杭州 310027）

評(píng)述與進(jìn)展

逆流色譜研究進(jìn)展

吳大同 潘遠(yuǎn)江*

（浙江大學(xué)化學(xué)系，杭州 310027）

逆流色譜（Counter-current chromatography，CCC）是以分析物在液-液兩相溶劑中的分配差異為核心的快速分離技術(shù)。近年來，逆流色譜對(duì)復(fù)雜樣品的分離，尤其是對(duì)天然產(chǎn)物的分離已獲得廣泛的關(guān)注。本文綜述了近年來逆流色譜在儀器改進(jìn)、溶劑體系篩選等領(lǐng)域的研究進(jìn)展，并介紹了CCC在分離手性化合物中的應(yīng)用前景。最后，對(duì)該領(lǐng)域未來的研究?jī)?nèi)容進(jìn)行了展望。

逆流色譜；儀器改進(jìn)；溶劑體系；手性分離；評(píng)述

1 逆流色譜簡(jiǎn)介

20世紀(jì)70年代，美國(guó)國(guó)家健康研究院Ito博士發(fā)明了逆流色譜。逆流色譜（Counter-current chromatography，CCC）是一種連續(xù)液-液分配色譜技術(shù)，無需任何固態(tài)支撐體，依托于兩相溶劑連續(xù)有序的重復(fù)混合實(shí)現(xiàn)分析物高效分離。經(jīng)過40多年的發(fā)展與完善，逆流色譜作為一種高效的制備或半制備分離技術(shù)已廣泛用于分離復(fù)雜樣品，如天然產(chǎn)物［1～10］，生物蛋白［11～15］，納米粒子［16］等。與以固相載體作為固定相的色譜技術(shù)相比，其具有樣品損失小、無不可逆吸附、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)［17］。因此，逆流色譜正被越來越多的分離工作者接納。至今，已經(jīng)建立了快速分析型CCC，半制備型CCC，大分子蛋白質(zhì)分離用的CCC以及pH區(qū)帶制備型CCC。眾多的應(yīng)用實(shí)例表明，逆流色譜憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，已成為現(xiàn)代分離技術(shù)不可缺少的手段之一。

本文主要對(duì)近5年逆流色譜在儀器改進(jìn)、溶劑體系篩選等領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，重點(diǎn)介紹了圍繞提高固定相保留值而進(jìn)行的儀器改進(jìn)，并對(duì)CCC在分離手性化合物中的應(yīng)用做了簡(jiǎn)要介紹。

2 逆流色譜儀器的優(yōu)化和改進(jìn)

發(fā)展快速、高效的色譜分離技術(shù)是分離工作者不斷追求的目標(biāo)。經(jīng)過多年發(fā)展，特別是2000年以來，制備或半制備型逆流色譜在儀器改進(jìn)、設(shè)計(jì)方面已取得較大的突破，主要包括以下幾個(gè)方面：（1）色譜柱幾何構(gòu)型的設(shè)計(jì)；（2）多重色譜柱的串、并聯(lián)設(shè)計(jì)；（3）多維逆流色譜以及逆流色譜與制備液相色譜聯(lián)用技術(shù)。圍繞這三方面，研究人員做了大量的系統(tǒng)工作。設(shè)計(jì)出多種獨(dú)具特色且高效的逆流色譜，顯著提高了復(fù)雜樣品的分離效率，大大縮短了分離時(shí)間。

其中，對(duì)色譜柱的改進(jìn)，即是增加其固定相保留值。固定相保留值是逆流色譜的一個(gè)重要參數(shù)。通常，保留值越高，分離得到的峰分辨率就越好。但是，傳統(tǒng)逆流色譜普遍存在著固定相保留值較低的缺點(diǎn)（＜40%）。近年來，針對(duì)這個(gè)問題，研究人員對(duì)色譜柱幾何構(gòu)型進(jìn)行了改進(jìn)。

Liang等［18］構(gòu)建了新型圓錐體色譜柱的逆流色譜（圖1），并在理論上得到了最優(yōu)的圓錐體構(gòu)造關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)，不同于傳統(tǒng)的圓柱體色譜柱，該型色譜柱能顯著提高固定相保留值，最高可達(dá)71.56%。此外，Cao等［19］設(shè)計(jì)了螺旋管圓盤柱，使固定相保留值提高了10%，并成功應(yīng)用于對(duì)大極性化合物的分離。這些設(shè)計(jì)都有效地提高了逆流色譜的分離能力，證明了對(duì)色譜柱的優(yōu)化是一種可靠的方案。

改進(jìn)多重色譜柱的串、并聯(lián)設(shè)計(jì)是提高逆流色譜分離效率的另一種重要途徑。如今廣泛使用的高速逆流色譜［20～24］，就是利用螺旋管的一種特殊的同步行星式運(yùn)動(dòng)模式（J型模式），能夠?qū)崿F(xiàn)快速、高效分離。然而，由于其運(yùn)動(dòng)模式的限制，大極性溶劑體系很難在色譜柱中得到保留，因此對(duì)多肽、糖類以及蛋白質(zhì)等大極性化合物分離效果很差。

圖1 （A）圓錐體色譜柱設(shè)計(jì)示意圖和（B）實(shí)物圖［18］Fig.1 （A）Schematic illustration of upright conical coils and（B）photographs of the product［18］

Shinomiya等［25］以主、從動(dòng)軸不同的轉(zhuǎn)動(dòng)方式構(gòu)建了交叉軸螺旋管式離心型逆流色譜（圖2），具體運(yùn)動(dòng)方式為支撐軸在水平方向轉(zhuǎn)動(dòng)，從動(dòng)軸在豎直方向轉(zhuǎn)動(dòng)。與傳統(tǒng)的J型螺旋管式離心型逆流色譜相比，其對(duì)大極性溶劑體系具有較好的固定相保留值，能夠顯著提高大極性化合物的分離效率。實(shí)驗(yàn)表明，該型逆流色譜可以基于雙水相系統(tǒng)成功分離5種多糖類似物。此外，該設(shè)計(jì)極大地豐富了逆流色譜色譜柱的設(shè)計(jì)思路，為儀器的改進(jìn)提供了較佳方案。

圖2 （A）J-型螺旋管和交叉軸型螺旋管運(yùn)動(dòng)模式設(shè)計(jì)示意圖及（B）實(shí)物圖［25］Fig.2 （A）Schematic illustration of planetary motions of the type-J coil planet centrifuge（CPC）and cross-axis CPC and（B）photograph of the product［25］

其后，該研究小組又利用4個(gè)偏心軸將同步行星式運(yùn)動(dòng)模式（J型模式）與非同步離心模式（I型模式）結(jié)合，構(gòu)建了新型四柱并聯(lián)逆流色譜（圖3）［26］，并分別測(cè)試了以頭到尾和尾到頭洗脫方式分離復(fù)雜樣品。無論是以上相或下相為固定相，都具有較高的固定相保留值和較好的分離度。該方法既能保留兩種不同運(yùn)動(dòng)模式的優(yōu)點(diǎn)，又能擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，適用于分離極性差別大的復(fù)雜樣品。

多重色譜聯(lián)用技術(shù)是提高分離效率的有效手段之一。近年來，Qiu等［27，28］利用獨(dú)特的接口技術(shù)和不間斷分離模式，發(fā)展了逆流色譜與制備型液相色譜聯(lián)用技術(shù)（圖4）。以逆流色譜為第一維分離，制備液相色譜為第二維分離，一次性分離得到12種化合物，且純度達(dá)到90%以上。該結(jié)果表明，多維色譜技術(shù)能有效的結(jié)合每個(gè)色譜的技術(shù)特點(diǎn)，綜合利用其優(yōu)勢(shì)使分離效率達(dá)到最優(yōu)化。

為了進(jìn)一步優(yōu)化二維逆流色譜系統(tǒng)，本課題組設(shè)計(jì)了一種新型二維逆流色譜接口技術(shù)［29］。如圖5所示，該系統(tǒng)結(jié)合了固相萃取技術(shù)，用固相萃取小柱除去一維產(chǎn)生的大量溶劑，同時(shí)將目標(biāo)樣品吸附在固相萃取柱上。通過少量的流動(dòng)相即可將固相萃取柱上的樣品引入二維分離。該逆流色譜系統(tǒng)通過特殊的接口及色譜聯(lián)用設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了兩柱并聯(lián)集成化，大大提高了逆流色譜的分離效率。其后，本課題組又利用該二維逆流色譜系統(tǒng)開發(fā)出兩種不同類型溶劑體系，同時(shí)在線分離大黃提取物中的4種蒽醌類化合物［30］。具體操作步驟如下：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1∶1∶1∶1，V/V）作為第一維逆流色譜溶劑體系；甲基叔丁基醚-乙腈-水（2∶2∶3，V/V），上相加入三氟乙酸（10 mmol/L），下相加入三乙胺（10 mmol/L）的酸堿溶劑體系作為第二維逆流色譜溶劑體系，實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜樣品的高效、快速分離。

圖3 （A）J型模式和I型模式并聯(lián)設(shè)計(jì)示意圖和（B）實(shí)物圖［26］Fig.3 （A）Schematic illustration of type-J forward and type-I backward columns and（B）photograph of the product［26］

圖4 CCC和制備型HPLC聯(lián)用設(shè)計(jì)示意圖［27］Fig.4 Scheme for flow programming CCC×preparative HPLC system［27］CCC：Counter-current chromatography.

綜上所述，無論是對(duì)色譜柱的幾何構(gòu)型優(yōu)化設(shè)計(jì)，還是對(duì)多重色譜柱的串、并聯(lián)設(shè)計(jì)，均是為了增加固定相保留值，提高逆流色譜的分離度。此外，合理的多維色譜聯(lián)用設(shè)計(jì)能綜合不同色譜的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，顯著提高分離效率。

3 溶劑體系的選擇和優(yōu)化

選擇合適的溶劑體系是逆流色譜分離化合物最為關(guān)鍵一步，占全部工作量的90%以上。因此，建立合理的溶劑篩選策略，選擇合適的溶劑體系無疑是極其重要的。近年來，研究者陸續(xù)開發(fā)了新的溶劑篩選策略。針對(duì)四元溶劑體系：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，Margraff定義了其中的23種溶劑體系，并用字母命名A～Z定義了這23個(gè)溶劑體系（除E，I和O外），這些溶劑體系又被命名為Arizona體系。每個(gè)溶劑體系中正己烷/乙酸乙酯的比例與甲醇/水的比例必須保持一致。本課題組首先研究了溶質(zhì)的分配系數(shù)以及Arizona體系從親水性的溶劑體系（乙酸乙酯-水）到疏水性溶劑體系（正己烷-甲醇）的極性變化關(guān)系［31］，以此提出了新的篩選策略（圖6），AZ系統(tǒng)被分成4個(gè)部分：Ⅰ親水性，A～H；Ⅱ弱親水性，J～M；Ⅲ弱疏水性，N～S；Ⅳ疏水性，T～Z。結(jié)果表明，利用三柱并聯(lián)分析型逆流色譜。僅需3次即可獲得最佳溶劑體系。該策略顯著縮短了獲得合適的溶劑體系所需要的時(shí)間，極大地提高了分離效率。

圖5 二維逆流色譜設(shè)計(jì)示意圖［29］Fig.5 Scheme of two-dimensional counter-current chromatography［29］

圖6 基于AZ兩相體系的復(fù)雜物物質(zhì)快速篩選策略［31］Fig.6 Rapid screening strategy of a complex mixture based on liquid compositions of the AZ liquid system［31］

最近，研究人員發(fā)現(xiàn)利用建模的方法歸納出兩相體系中溶質(zhì)的分配系數(shù)規(guī)律具有一定的可行性。具體步驟如下：首先，利用少量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出溶質(zhì)分配系數(shù)的一定規(guī)律，并用相應(yīng)的數(shù)學(xué)方程式表示；其次，根據(jù)已建立的數(shù)學(xué)模型，尋找最佳的溶劑篩選體系。Hopmann等［32，33］基于非平衡溶劑化能數(shù)值計(jì)算的類導(dǎo)體屏蔽模型（COSMO-RS）對(duì)逆流色譜的溶劑體系進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，該模型可以準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)兩相溶劑系統(tǒng)的變化對(duì)溶質(zhì)分配系數(shù)的影響，并以此篩選出合適的溶劑體系。Ren等［34，35］創(chuàng)新性地引入熱力學(xué)模型（非隨機(jī)兩相液體模型，NRTL），其可對(duì)逆流色譜常用的兩相溶劑系統(tǒng)的液-液平衡組成成分進(jìn)行準(zhǔn)確估算。具體篩選過程如圖7所示：根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的溶質(zhì)分配系數(shù)及其相應(yīng)的溶劑體系計(jì)算NRTL模型參數(shù)，并用標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)證明該參數(shù)模型的可行性。其中，活度系數(shù)是非常重要的中間參數(shù)，該值的準(zhǔn)確性將決定該模型能否準(zhǔn)確預(yù)測(cè)合適的溶劑體系。

此外，傳統(tǒng)的溶劑體系（正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，甲基叔丁醚-乙腈-水等）適用于分離極性較小或中等極性的化合物。但對(duì)于一些大極性、容易失活的樣品，此類溶劑體系并不能滿足分離要求。因此，一些新的溶劑體系被開發(fā)用于分離多糖、多肽、蛋白質(zhì)等樣品。Yin等［36］利用雙水相系統(tǒng)PEG1000-MgSO4-H2O（12∶16∶72，w/w）實(shí)現(xiàn)一步分離3種不同分子量的多糖。Bezold等［37］開發(fā)新型的溶劑體系［Emim］Cl-K2HPO4/KH2PO4-H2O，成功實(shí)現(xiàn)3種蛋白質(zhì)（即溶解酵素、肌紅蛋白和牛血清蛋白）的分離。研究表明，含有離子液體的雙水相系統(tǒng)具有對(duì)樣品不易失活、對(duì)大極性化合物具有較好的分配系數(shù)等優(yōu)點(diǎn)。Wu等［38］以正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水（4∶3∶4∶4，V/V）三相系統(tǒng)為基礎(chǔ)，以上層為固定相，下層為流動(dòng)相。分離得到白芷提取物中8種香豆素類化合物；以上層為固定相，中間層為流動(dòng)相，分離達(dá)到高良姜提取物中6種二芳基庚烷類衍生物；以中間層為固定相，下層為流動(dòng)相，分離得到知母提取物中3種化合物。綜上所述，合適的溶劑體系有助于擴(kuò)大逆流色譜的分離對(duì)象，增加其應(yīng)用范圍。表1列舉了近年開發(fā)的新型溶劑體系。

圖7 NRTL模型的設(shè)計(jì)流程圖［34］Fig.7 Scheme of procedure of NRTL model［34］

表1 近年開發(fā)的新型溶劑體系Table 1 Novel liquid-liquid solvent systemin recent years

4 基于逆流色譜對(duì)手性化合物的拆分及其展望

手性對(duì)映體是一類具有特殊光學(xué)性質(zhì)的化合物，其在精細(xì)化學(xué)品、生命科學(xué)以及醫(yī)藥中間體等領(lǐng)域占有及其重要的地位。大量制備單構(gòu)型手性化合物一直是分離工作者不斷追求的目標(biāo)。然而，現(xiàn)有的色譜分離技術(shù)，如液相色譜、氣相色譜和毛細(xì)管電泳，存在著樣品容量小和成本高等缺點(diǎn)，限制了其在手性拆分中的應(yīng)用。

逆流色譜分離手性物質(zhì)無疑還處于實(shí)驗(yàn)階段。近年來，環(huán)糊精及其衍生物、蛋白質(zhì)等都被嘗試作為基于逆流色譜分離方法的手性拆分劑。Han等［44，45］以環(huán)糊精和銅（II）絡(luò)合物為手性拆分劑，成功拆分D/L-扁桃酸及其類似物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度、溶劑pH值和被分析物濃度都會(huì)對(duì)分離效率產(chǎn)生影響。Ito等［46］首次嘗試以牛血清蛋白為手性拆分試劑，基于螺旋管式逆流色譜雙水相體系分離單構(gòu)型的D/L-色氨酸。他們比較了液相色譜和逆流色譜在手性拆分中的優(yōu)缺點(diǎn)，其以羥丙基-β-環(huán)糊精為手性拆分劑分離苯基丙酸對(duì)映體［47，48］。結(jié)果表明，液相色譜和逆流色譜對(duì)手性拆分都各有其優(yōu)勢(shì)，制備型液相色譜適用于高效分離少量的手性化合物；逆流色譜更適用于大量制備高純度手性化合物。

然而，基于逆流色譜分離手性物質(zhì)仍存在以下幾個(gè)問題：（1）CCC分離柱理論塔板數(shù)相對(duì)較低；（2）所用溶劑體系會(huì)破壞主、客體分子間的相互作用；（3）缺乏合適的手性配體。因此，仍需逆流色譜工作者不斷努力找到合適的解決辦法。但是，可以相信，對(duì)于大制備量分離手性化合物，逆流色譜是一個(gè)可以信賴的分離技術(shù)。

5 總結(jié)與展望

經(jīng)過幾十年的不斷發(fā)展和完善，無論是儀器構(gòu)造，還是新型溶劑體系的篩選，逆流色譜均有顯著進(jìn)步。如今，CCC憑借其獨(dú)具特色的技術(shù)特點(diǎn)，已被越來越多的分離工作者作為制備或半制備分離技術(shù)，廣泛用于復(fù)雜樣品的分離，并成功得到高純度的化合物，如：生物堿、黃酮類、蛋白質(zhì)等。大量分離實(shí)例證明了逆流色譜對(duì)復(fù)雜樣品具有高效分離的優(yōu)勢(shì)。然而，與其它分離技術(shù)相比，逆流色譜還存在著一些問題亟需解決。例如，其較低的理論塔板數(shù)，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用；分離工作者需要花費(fèi)較長(zhǎng)的時(shí)間和精力篩選得到合適的溶劑體系。這些問題的存在使得逆流色譜仍有進(jìn)一步優(yōu)化的空間。

對(duì)此，提出以下幾點(diǎn)展望：（1）由于逆流色譜可以有效避免死吸附，因此可以針對(duì)一些高附加值對(duì)象（如紫杉醇）進(jìn)行分離，實(shí)現(xiàn)高回收率低消耗的分離過程。（2）逆流色譜是以分配比為基礎(chǔ)的分離技術(shù)，通過控制不同對(duì)象的分配比實(shí)現(xiàn)化合物的精確分段。隨著逆流色譜的不斷發(fā)展完善，它將發(fā)展成為一種更加成熟的、可產(chǎn)業(yè)化的高效分離技術(shù)。

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38 Wu X，Chao Z，Wang C，Yu L.J.Chromatogr.A，2015，1384：107-114

39 Zhou X Y，Zhang J，Xu R P，Ma X，Zhang Z Q.J.Chromatogr.A，2014，1362：129-134

40 Yin H，Zhang S，Long L J，Yin H，Tian X P，Luo X M，Nan H H，Sha He.J.Chromatogr.A，2013，1315：80-85

41 Liu D，Zou X W，Gao M Z，Gu M，Xiao H B.J.Chromatogr.A，2014，1356：157-162

42 Spórna-Kucaba A，Garrard I，Ignatova S，Wybraniec S.J.Chromatogr.A，2015，1380：29-37

43 Zeng Y，Liu G，Ma Y，Chen X Y，Ito Y.J.Chromatogr.A，2011，1218（48）：8715-8717

44 Han C，Luo J G，Xu J F，Zhang Y Q，Zhao Y C，Xu X M，Kong L Y.J.Chromatogr.A，2015，1375：82-91

45 Han C，Xu J F，Wang X B，Xu X M，Luo J G，Kong L Y.J.Chromatogr.A，2014，1324：164-170

46 Tong S Q，Ito Y，Ma Y.J.Chromatogr.A，2014，1374：77-84

47 Tong S Q，Zheng Y，Yan J Z.J.Chromatogr.A，2013，1281：79-86

48 Tong S Q，Zheng Y，Yan J Z，Guan Y X，Wu C Y，Lei W Y.J.Chromatogr.A，2012，1263：74-83

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.21532005 ）

Recent Development in Counter-current Chromatography

WU Da-Tong，PAN Yuan-Jiang*
（Zhejiang University，Department of Chemistry，Hangzhou 310027，China）

Counter-current chromatography（CCC）is a quick preparative separation technique based on the different partition coefficient in liquid-liquid solvent systems.This paper reviews recent research progress in the region of solvent systems，instruments improvement of CCC.Moreover，some application prospects about enantioseparation of racemic compounds by CCC are also discussed.Finally，the contents and goal of further research in this field is discussed.

Counter-current chromatography；Instruments improvement；Solvent systems；Chiral separation；Review

20 September 2015；accepted 2 December 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150746

2015-09-20收稿；2015-12-02接受

本文系國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.21532005）

*E-mail：panyuanjiang@zju.edu.cn