姜利英肖小楠 周鵬磊 張 培 閆艷霞 姜素霞 陳青華（鄭州輕工業(yè)學(xué)院電氣信息工程學(xué)院，鄭州 450002）

基于氧化石墨烯熒光適體傳感器的胰島素檢測

姜利英*肖小楠 周鵬磊 張 培 閆艷霞 姜素霞 陳青華
（鄭州輕工業(yè)學(xué)院電氣信息工程學(xué)院，鄭州 450002）

采用熒光基團（FAM）標(biāo)記的核酸適體作為識別元件，氧化石墨烯為淬滅劑，建立了一種高選擇性、高靈敏度的核酸適體傳感器。核酸適體與氧化石墨烯結(jié)合后，熒光淬滅，此時溶液無熒光；加入胰島素后，溶液中熒光得到恢復(fù)。利用熒光分析法檢測加入胰島素前后，溶液中熒光強度的變化，獲取了熒光適體傳感器的線性度和靈敏度，實現(xiàn)對胰島素濃度的測定。結(jié)果表明，在5×10-8～1×10-5mol/L范圍內(nèi)，胰島素的濃度與溶液中熒光強度有良好的線性關(guān)系，檢出限為10 nmol/L。采用此方法檢測胰島素，操作簡便，檢測速度快，準(zhǔn)確性高，選擇性好，檢出限低。

熒光基團；核酸適體；氧化石墨烯；熒光適體傳感器；胰島素

1 引言

胰島素（Insulin，INS）是胰臟中胰島B（β）細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素，既能促進(jìn)血液中的葡萄糖進(jìn)入肝、肌肉和脂肪等組織細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)合成糖元或轉(zhuǎn)變成其它營養(yǎng)物質(zhì)貯存起來；又能促進(jìn)葡萄糖氧化分解釋放能量，供機體利用，是維持血糖在正常水平的主要激素。胰島素分泌不足或缺乏時，會引起高血糖，甚至是糖尿病。因此，能否準(zhǔn)確測定血液中胰島素的濃度，對高血糖及糖尿病的早期診斷、臨床和基礎(chǔ)研究具有重要的價值［1，2］。胰島素的檢測方法包括免疫分析法［3］、色譜法［4］，這兩種方法操作繁瑣，靈敏度低，難以應(yīng)用到現(xiàn)場即時檢測?，F(xiàn)在研究較多的檢測方法是電化學(xué)分析法［5～13］和熒光分析法［14～16］。

由于核酸適體具有高親和力和高特異性，已成為制備生物傳感器理想的識別元件［17～20］。Seyed等［2］利用了核酸適體和三股螺旋分子開關(guān)的獨特性質(zhì)，對胰島素進(jìn)行檢測，檢出限為9.97 nmol/L。Verdian等［15］基于胰島素適體折疊熒光淬滅，實現(xiàn)了對INS的檢測，檢測范圍為2～70 nmol/L。Ying等［16］以氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）為淬滅劑，基于核酸適體熒光檢測法得到INS的檢出限為500 nmol/L，檢測范圍0.5～50μmol/L。氧化石墨烯可與DNA堿基發(fā)生強烈的π-π相互作用，穩(wěn)定吸附單鏈DNA，使熒光淬滅，它的淬滅效率遠(yuǎn)高于常見的有機淬滅劑，且它的生產(chǎn)成本較低、制備簡單，是研究生物傳感器的熱點材料［21～24］。

本研究采用熒光基團標(biāo)記的單鏈DNA作為探針，以氧化石墨烯為淬滅劑，構(gòu)建了對INS有特異性的熒光適體傳感器，在檢測范圍與檢出限方面獲取了更好的結(jié)果。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

GL-16Ⅱ型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；07HWS-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（杭州儀表電機有限公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；F-7000熒光光譜儀（日本 HITACHI公司）獲得。Tris-HCl緩沖液為（pH 7.4，50 mmol/L Tris-HCl，30 mmol/L NaCl，50 mmol/L KCl）。牛胰島素（北京索萊寶科技有限公司）；2 mg/mL氧化石墨烯溶液（蘇州恒球科技有限公司）。實驗所用的寡核苷酸序列均由上海生工生物技術(shù)有限公司（中國）合成，其核苷酸序列如下：5′-GGT GGT GGG GGG GGT TGG TAG GGT GTC TTCFAM-3′。實驗用水均為超純水，實驗溫度為25℃。

2.2 工作溶液的制備

將100 μL 100μmol/L核酸適體加入到100 mL Tris-HCl緩沖液中，再加入5 mL GO，室溫下靜置10 min后，加入20 μL 100μmol/L PBA封閉未反應(yīng)位點，即得到工作溶液。取25 mg INS加入25 mL工作溶液中，得到INS的濃度為174.4μmol/L，加入工作溶液稀釋，分別得到0，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，5.0，10.0，50和100μmol/L的待測液各5 mL。裝入離心管內(nèi)，離心0.5 h，再靜置1 h，使其充分結(jié)合。

2.3 樣品的分析

在激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為521 nm的條件下，以不含INS的溶液作為空白對照組，用熒光光譜儀測定不同濃度的INS待測液的熒光強度。以熒光強度對相應(yīng)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 特異性檢測

在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)選定濃度為5μmol/L，與檢測INS相同的條件下，分別測定BSA、生物素和鏈霉親和素的熒光強度，與相同濃度的INS的熒光強度作比較，并繪制柱狀圖。

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測原理、胰島素的激發(fā)和發(fā)射波長

利用核酸適體與氧化石墨烯組成的檢測INS熒光適體傳感器，檢測INS的基本原理如圖1所示。當(dāng)沒有目標(biāo)分子（INS）加入時，核酸適體表面的熒光基團被GO吸附，溶液中有極其微弱的熒光強度；加入INS后，適體不斷從GO表面游離，溶液中的熒光強度得以恢復(fù)。隨著INS濃度的增大，溶液中的熒光強度也不斷增大。根據(jù)熒光強度的變化可以實現(xiàn)對INS的檢測。

圖1 檢測胰島素的原理示意圖Fig.1 Mechanism of insulin detection

分別取3 mL工作溶液和待測液，在熒光光譜儀上先固定一個合適的激發(fā)波長，優(yōu)化發(fā)射波長（500～600 nm）；確定發(fā)射波長，優(yōu)化激發(fā)波長。最終確定胰島素的激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為521 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度設(shè)置為10 nm。

3.2 核酸適體與GO的量比對熒光強度的影響

若核酸適體的量過大，GO不能將適體完全吸附，溶液中還存在大量熒光，當(dāng)加入INS后，熒光強度的變化不夠明顯，對實驗結(jié)果有較大影響。若GO量過大，核酸適體的熒光被GO完全吸附后，溶液中無熒光，但存在一部分未與核酸適體結(jié)合的GO，加入INS時，從GO表面游離的核酸適體有可能再次被GO吸附，影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。核酸適體與GO不同的量比測得溶液中的熒光強度如圖2所示。由圖2可得，最終選擇適體與GO的比例為1 nmol∶1 mg（曲線c），此時GO將完全吸附適體，熒光即將會完全淬滅。

3.3 緩沖液濃度對熒光強度的影響

緩沖溶液的濃度可以影響核酸適體的熒光強度，從而影響最終測得INS的熒光強度。本實驗考察了不同濃度的緩沖液（50 nmol/L，50μmol/L，50 mmol/L）對最終實驗結(jié)果熒光強度的影響，發(fā)現(xiàn)緩沖液濃度為50 mmol/L時，測得熒光強度最強，實驗效果最好。最終確定緩沖液為Tris-HCl 50 mmol/L，NaCl 30 mmol/L，KCl 50 mmol/L。

圖2 不同DNA與GO的比率相對應(yīng)的熒光強度Fig.2 Fluorescence intensity corresponding to different ratios of DNA and GO

3.4 工作溶液與胰島素結(jié)合時間對熒光強度的影響

工作溶液與INS結(jié)合的時間太短（0～30 min），測得熒光強度較弱，延長結(jié)合時間（30～60 min），熒光強度不斷增強。當(dāng)結(jié)合時間大于60 min，熒光強度趨于穩(wěn)定。最終確定INS與工作溶液的最佳結(jié)合時間為60 min。需要注意的是，INS與工作溶液的結(jié)合時間不宜過長，否則會破壞核酸適體的結(jié)構(gòu)，影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.5 胰島素的標(biāo)準(zhǔn)曲線及特異性實驗結(jié)果

在上述實驗條件下，INS濃度與相應(yīng)的熒光強度的關(guān)系如圖3所示，隨著INS濃度增大，熒光強度不斷增強。目標(biāo)INS的濃度在5×10-8～1×10-5mol/L范圍內(nèi)，適體的熒光強度（y）和INS的濃度（x）有良好的線性關(guān)系（圖4），線性回歸方程為y=84.83571+16.0724x，相關(guān)系數(shù)R=0.99913，檢出限為10 nmol/L。

在圖3的標(biāo)準(zhǔn)曲線上選擇一個濃度（5μmol/L），與檢測INS的條件相同，得到的結(jié)果如圖5所示。INS的熒光強度與牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA），生物素（Biotin）和鏈霉親和素（Streptavidin-biotin）明顯不同，BSA、生物素、鏈霉親和素與胰島素的熒光強度比為1.0∶1.33∶1.07∶8.9。因此，本方法對胰島素具有良好的選擇特異性。

圖3 胰島素的熒光信號曲線Fig.3 Fluorescent signal curve of insulin

圖4 胰島素的濃度與熒光強度的關(guān)系曲線Fig.4 Calibration curve of insulin concentration and fluorescence intensity

3.6 實際樣品的分析

INS加入到正常人的血清中，再加工作液，配制成不同濃度的待測液，采用本方法測其熒光強度（表1）。結(jié)果表明，本方法的測定結(jié)果與實際樣品誤差很小，每個濃度的樣品平行測定5次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，說明本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表1 實際樣品中胰島素的測定結(jié)果Table 1 Determination results of insulin in real samples

圖5 胰島素對照組的熒光信號強度（5μmol/L）Fig.5 Fluorescent signal intensity of insulin in control group

4 結(jié)論

將能夠與INS特異性結(jié)合的單鏈DNA與GO結(jié)合，構(gòu)建了對INS有特異性的熒光適體傳感器。根據(jù)緩沖液中INS加入前后熒光強度的變化，測定INS濃度，建立了一種快速檢測INS的方法。本方法具有選擇性好、方法簡單、檢測速度快、檢出限低等優(yōu)點。在此實驗基礎(chǔ)上，通過對實驗條件的優(yōu)化或更換淬滅效果更好的淬滅劑，能獲取更好的實驗結(jié)果。若條件允許，預(yù)測此方法在檢測其它蛋白質(zhì)分子方面具有良好的應(yīng)用前景。

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.61002007 ）

An Aptamer-based Fluorescence Biosensor for Insulin Detection Based on Graphene Oxide

JIANG Li-Ying*，XIAO Xiao-Nan，ZHOU Peng-Lei，ZHANG Pei，YAN Yan-Xia，JIANG Su-Xia，CHEN Qing-Hua （Zhengzhou University of Light Industry，Institute of Electrical and Information Engineering，Zhengzhou 450002 China）

By using fluorophore（FAM）labeled aptamers as recognition elements and graphene oxide as a quencher，a highly selective and sensitive sensor was constructed for the fast and accurate detection of insulin. After the aptamer binding with graphene oxide，fluorescence will be quenched and fluorescence intensity disappeared；after addition of insulin，the solution fluorescence was restored.Based on the fact，we established a method for the determination of insulin concentration by measuring the fluorescence intensity. The results showed that the concentration of insulin in the range of 5×10-8-1×10-5mol/L had a good linear relationship with the fluorescence intensity.The detection limit was 10 nmol/L.This method of detecting insulin had obvious advantages of fast detection speed，high selectivity and low detection limit.

Fluorophore；Aptamer；Graphene oxide；Fluorescence aptamer biosensor；Insulin

3 July 2015；accepted 13 November 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150534

2015-07-03收稿；2015-11-13接受

本文系國家自然科學(xué)基金（No.61002007）、河南省科技創(chuàng)新人才計劃（No.124100510001）、鄭州輕工業(yè)學(xué)院2014年度研究生科技創(chuàng)新基金資助項目（No.2014010）、鄭州輕工業(yè)學(xué)院博士科研基金資助項目（No.2014BSJJ041）

*E-mail：jiangliying@zzuli.edu.cn