焦興蘋 昝 珂 過立農(nóng) 鄭 健 馬雙成

1.青海省藥品檢驗檢測院，青海 西寧 810000；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

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綠原酸等四種物質(zhì)采用不同進樣方法制訂HPLC標準曲線的比較

焦興蘋 昝 珂 過立農(nóng) 鄭 健 馬雙成

1.青海省藥品檢驗檢測院，青海 西寧 810000；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

目的：比較高效液相色譜法制作標準曲線時，對照品稀釋法和不同進樣量法的異同。方法：采用高效液相色譜法，以綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷對照品作為研究對象，采用對照品稀釋法和進樣不同體積法，測定峰面積，計算標準曲線。結果：木犀草苷兩種方法結果線性關系良好，而綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷僅稀釋法線性關系良好。結論：建議采用稀釋法測定標準曲線，不同進樣量法需慎重。

高效液相色譜法；線性；對照品稀釋法；不同進樣量法

在建立藥品質(zhì)量標準時，分析方法需經(jīng)驗證；在藥品生產(chǎn)工藝變更、制劑的組分變更、原分析方法進行修訂時，質(zhì)量標準分析方法也需進行驗證。線性是藥品質(zhì)量標準分析方法驗證的必需項目之一[1]。在建立中藥含量測定方法時，高效液相色譜法是最常采用的方法。常用的標準曲線制作方法有兩種，一是配置一系列濃度的標準物質(zhì)，以峰面積對被測物質(zhì)濃度進行線性擬合[2-8]；另外一種方法是同一對照品溶液，進樣不同體積，以峰面積對被測物質(zhì)進樣量(μg)進行線性回歸計算[9-15]。本研究采用綠原酸(1)、連翹酯苷B(2)、毛蕊花糖苷(3)、木犀草苷(4)四個對照品(結構式見圖1)按上述兩種線性制作方法進行試驗，比較二者的異同。結果顯示，4個對照品溶液按照對照品稀釋法試驗，線性關系均良好；采用不同進樣量法試驗，僅木犀草苷線性關系良好，綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷三個化合物隨進樣量增大，峰面積響應值偏低，線性關系呈類拋物線型。

1 儀器與材料

1.1 儀器 安捷倫1260型高效液相色譜儀(二極管陣列檢測器，二元泵，自動進樣器，脫氣機)；MSA125P型電子天平(賽多利斯)。1.2 材料 綠原酸對照品(批號：110753-201314)、連翹酯苷B(批號：111811-201102)、木犀草苷(批號：111720-201408)購自中國食品藥品檢定研究院；毛蕊花糖苷(批號：M-011-150318北京中科質(zhì)檢生物技術有限公司)。磷酸(批號20140305，國藥集團化學試劑有限公司)，甲醇和乙腈為色譜純(Fisher公司)，水為Milli-Q超純水。

2 方法和結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters XSelect HSS T3(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：乙腈-0.5%磷酸溶液 (18∶82)；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：332nm。

2.2 對照品溶液的配制 分別取綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷對照品約10mg，精密稱定，分別置于10mL棕色量瓶中，以乙腈溶解并定容至10mL，即得各對照品儲備液。分別吸取上述儲備液0.1、0.2、0.3、0.5、0.8mL分別置于25mL容量瓶中，用流動相稀釋至25mL，用0.45μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得對照品溶液濃度分別約為4、8、12、20、32μg/mL。

2.3 不同進樣量法試驗 精密吸取2.2項下對照品混合溶液(20μg/mL)，分別進樣1、 2、 5、 10 、15μL，記錄峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標，以相應進樣量(X)為橫坐標，繪制標準曲線，結果見表1，線性圖見圖2。

表1 對照品混合標準溶液標準曲線結果

結果表明，不同進樣量法測定的木犀草苷線性關系良好，而綠原酸、連翹酯苷B和毛蕊花糖苷三個成分隨進樣量增大，響應值沒有線性增加，呈類拋物線型。

2.3 對照品稀釋法測定線性 分別精密吸取上述2.2項下一系列濃度的對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件測定，以各對照品進樣量(μg)為X軸，以峰面積積分值為Y軸，進行線性回歸，各對照品回歸方程和線性范圍見表2，線性圖見圖3。

表2 對照品稀釋法制訂標準曲線結果

結果表明，采用對照品稀釋法，所測四個成分線性關系均良好。

3 結果與討論

本實驗采用高效液相色譜法，以綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷以及木犀草苷四個對照品為研究對象，通過對照品稀釋法和進樣不同體積法對質(zhì)量標準分析方法驗證中的線性進行試驗。結果表明，采用對照品稀釋法，四個化合物的線性關系均良好，采用進樣不同體積法僅木犀草苷的線性關系良好，而綠原酸、連翹酯苷B和毛蕊花糖苷三個成分隨進樣量增大，峰面積響應值沒有線性增加，呈類拋物線型。其原因可能是流動相中加入了磷酸溶液，對照品溶液為甲醇配制，隨著進樣量增大，注入的不同體積的對照品溶液對流動相的pH值造成了波動。

綠原酸、連翹酯苷B和毛蕊花糖苷結構中均含有咖啡酸酯類，在含水量較高的流動相中容易產(chǎn)生電離，使色譜峰拖尾變寬，加入磷酸等酸性抑制劑抑制了此類化合物的電離，改善色譜峰的峰形。流動相不同pH值對化合物的峰形具有顯著影響，導致峰面積不完全成線性關系[16]。而進樣相同體積不同濃度的對照品溶液對流動相pH值的影響是一致的，峰面積和濃度呈線性關系。

由于本實驗儀器是采用自動進樣，木犀草苷的線性均良好，表明進樣器準確性和性能良好。實驗選用的進樣量范圍1～15μL為常用進樣量范圍，進樣體積并不過大。由于不同進樣量法較為簡便，課題組先采用不同進樣量法進行線性試驗，重復3次，結果均與本文報道一致，綠原酸、連翹酯苷B和毛蕊花糖苷3個化合物線性不佳，后改用稀釋法進行試驗，線性良好。

因此，進行中藥質(zhì)量標準驗證時，標準曲線的制備一般應采用稀釋法進行，慎重使用不同進樣體積法。

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(編輯：梁志慶)

Comparison of Four Different Chlorogenic Acid and Other Substances with Different Injection Methods to Develop HPLC Standard Curve

JIAO Xingping1ZAN Ke2GUO Linong2ZHENG Jian2*MA Shuangcheng2

1.Qinghai Provincial Institutes For Drug Control, Xining 810000，China;2.National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050,China

Object To compare differences and similarities of two injection methods for establishing calibration curves by HPLC. Methods To determine peak area and calculate calibration curves of chlorogenic acid, forsythoside B, acteoside and luteoloside by dilution and injection volume. Results Both of two methods of calibration curves are good for luteoloside. However, only dilution method can meet requirement for chlorogenic acid, forsythoside B and acteoside. Conclution Dilution method is suggested to establish calibration curves, injection volume method is suggested to use prudently.

HPLC; Calibration Curve;

ubstance Dilution Method; Injection Volume Method

2016-06-27

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項“中藥飲片質(zhì)量保障系統(tǒng)研究(一)”資助，項目編號：201507002；國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥化注冊司專項資助。

焦興蘋(1988-)，女，藏族，本科，中藥師，研究方向為中藏藥。E-mail：492076532@qq.com

鄭健(1971-)，女，博士，研究員，研究方向為中藥質(zhì)量控制。E-mail：bjzj825@163.com

R914.1

A

1007-8517(2016)18-0013-04