◎蔡曉東，張甑妮，閔莉靜

（1.湖州師范學院求真學院，浙江 湖州 313000；

2.湖州師范學院生命科學學院，浙江 湖州 313000）

蜂蠟黃酮抑菌性實驗研究

◎蔡曉東1，張甑妮1，閔莉靜2

（1.湖州師范學院求真學院，浙江 湖州 313000；

2.湖州師范學院生命科學學院，浙江 湖州 313000）

通過從蜂蠟中提取黃酮類化合物，探究其抑菌活性，測定其對不同菌種的最低抑菌濃度及其抑菌活性的影響因素，旨在為蜂蠟的推廣利用提供依據。

蜂蠟；黃酮；抑菌活性

蜂蠟，又稱黃蠟、蜜蠟。蜂蠟中含有一定的黃酮類化合物，具有一定抑菌活性?；诖耍懻摲湎烖S酮的抑菌活性及其影響因素。

1　材料與方法

1.1材料

蜂蠟，豆芽，葡萄糖，瓊脂，蔗糖，NaNO3，K2HPO4，KCl，MgSO4，F(xiàn)eSO4。

1.2方法

1.2.1蜂蠟黃酮的制備

蜂蠟若干，干燥，粉碎，稱取粉末，加入乙醇，加熱提取，攪拌，抽濾，取濾液，重復操作2次，減壓濃縮，正己烷水溶液萃取，除脂，備用[1]。

1.2.2培養(yǎng)基的制備

豆芽汁培養(yǎng)基（酵母菌用）的成分見表1；

察氏培養(yǎng)基（霉菌用）的成分見表2；

瓊脂培養(yǎng)基（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌用）的成分見表3[2]。

表1　豆芽汁培養(yǎng)基的成分表

表2　察氏培養(yǎng)基的成分表

表3　瓊脂培養(yǎng)基的成分表

1.2.3菌株活化及菌懸液的制備

（1）供試菌株的活化。用接種環(huán)挑取各種菌種，分別在斜面培養(yǎng)基上劃線，將金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌培養(yǎng)基置于36±1 ℃烘箱培養(yǎng)18～24 h；黑曲霉菌在28±1 ℃烘箱培養(yǎng)48 h；酵母菌置于30±1 ℃烘箱培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長情況，生長良好后，4 ℃保藏備用。

（2）供試菌株的菌懸液制備。分別挑取適量的活化后金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、黑曲霉菌和酵母菌體，分別接入無菌水中，搖勻，制成孢子、菌體懸浮液。

1.2.4濾紙片擴散法測定蜂蠟黃酮的抑菌效果：

將定性濾紙剪成直徑6 m m的小圓片，放于干燥培養(yǎng)皿中，50張/皿，滅菌，再分別在蜂蠟黃酮提取液、60%乙醇、75%乙醇，無菌水中浸泡24 h。分別吸取0.2 m L各菌種菌懸液涂布在各自培養(yǎng)基上，分別夾取上述制備的浸泡各種液體的無菌濾紙片，甩去多余液體，覆在涂布各種菌種的平皿上，4片/皿，不同培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)。2次平行實驗。量取濾紙片的抑菌圈大小，比較抑菌效果。

1.2.5蜂蠟黃酮的最低抑菌濃度（MIC）的測定

在無菌條件下，把蜂蠟黃酮提取物配制成濃度為100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%和1.56%的一系列不同濃度的溶液。分別移取2 mL上述系列濃度溶液至15 mL培養(yǎng)基中，加入200 μ L各種不同菌種的活化菌液，搖勻，各自培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)24 h后，觀察菌落生長狀況。菌落被完全抑制的最高稀釋度的提取物濃度即為該菌種的最低抑菌濃度（MIC）。

1.2.6蜂蠟黃酮抑菌活性的外界影響因素研究

（1）培養(yǎng)基酸堿度對蜂蠟黃酮抑菌效果的影響。用0.1 mol/mL HCl或NaOH溶液調節(jié)培養(yǎng)基酸堿度，分別達到瓊脂培養(yǎng)基pH值為4、5、6、7、8和9。然后，用各菌相應的最低抑菌濃度下的稀釋液進行抑菌試驗，空白對照。討論培養(yǎng)基酸堿度對蜂蠟黃酮抑菌活性的影響。

（2）溫度對蜂蠟黃酮抑菌效果的影響。分別移取5 mL各菌相應的最低抑菌濃度下的稀釋液于自然酸堿度的瓊脂培養(yǎng)基中，于40、60、80、100 ℃和121 ℃的水浴培養(yǎng)2 h，空白對照。討論培養(yǎng)溫度對蜂蠟黃酮抑菌活性的影響。

（3）共培養(yǎng)時間對蜂蠟黃酮抑菌效果的影響

選以大腸桿菌作為代表菌種，設定共培養(yǎng)時間分別為1、3、6、9 h和12 h，空白對照，討論提取物與菌種共培養(yǎng)時間對蜂蠟黃酮抑菌活性的影響。

2　結果與討論

蜂蠟黃酮對試驗菌的抑菌效果見表4，對供試菌種最低抑菌濃度的測定結果見表5，不同的pH值、不同的溫度、共培養(yǎng)時間對蜂蠟黃酮提取物抑菌活性的影響結果分別見表6、7、8。

表4　蜂蠟黃酮對試驗菌的抑菌效果表

表5　蜂蠟黃酮對供試菌種最低抑菌濃度的測定結果表

表6　不同的pH值對蜂蠟黃酮提取物抑菌活性的影響表

表7　不同的溫度對蜂蠟黃酮提取物抑菌活性的影響表

表8　共培養(yǎng)時間對蜂蠟黃酮提取物抑菌活性的影響表

由表4～8的結果表明，蜂蠟黃酮提取物對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、大腸桿菌和黑曲霉菌均有不同程度的抑制作用，其最低抑菌濃度濃度（MIC）分別為6.25%、3.125%、3.125%、 3.125%、6.25%和3.125%。

3　結論

蜂蠟黃酮抑菌活性影響因素實驗表明，低pH值、低溫、長共培養(yǎng)時間有利于其發(fā)揮抑菌性。

[1]郭孝武.一種提取中草藥化學成分的方法--超聲提取法[J].天然產物研究與開發(fā)，2010，11（3）：37-40.

[2]曾超珍，劉志祥，韓磊.黃芩總黃酮提取技術及其抑菌活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥2009，20（6）：1342-1343.

Study on the Antibacterial Activity of Flavonoids from Beeswax

Cai Xiaodong1， Zhang Zengni1， Min Lijing2
（1.Qiuzhen School of Huzhou University， Huzhou 313000， China；
2.Life Science School of Huzhou University， Huzhou 313000， China）

In this paper， we extracted flavonoids from beeswax and discussed on their antibacterial activity. Then we determined the minimal inhibitory concentration （MIC） and the factors affecting the antimicrobial activity， in order to provide reference for the popularization and utilization of beeswax.

Beeswax； Flavonoids； Antibacterial activity

TQ28

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.08.026

由2016年度湖州師范學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目資助。

指導老師：閔莉靜（1981-），女， 碩士，實驗師；主要研究方向為天然產物。