邱孫全，王金香

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江 杭州310006）

精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗與不明原因不孕患者行宮內(nèi)人工授精后妊娠結(jié)局的關(guān)系

邱孫全，王金香

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江 杭州310006）

目的 探討精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗（HBA）與不明原因不育患者行宮腔內(nèi)人工授精（IUI）后妊娠結(jié)局的關(guān)系。方法 根據(jù)HBA測量值將238例不明原因不孕行IUI的患者分為A組（HBA≥65%）108例和B組（HBA＜65%）130例，并比較不同水平的HBA的臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率等妊娠結(jié)局。 結(jié)果 A組周期妊娠率（16.7%）高于B組（13.9%），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩組流產(chǎn)率和活產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)論HBA結(jié)合率高，不明原因不孕患者行IUI所獲得的妊娠率也較高，但與流產(chǎn)和活產(chǎn)率沒有明顯關(guān)系。

精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗；不孕；宮腔內(nèi)人工授精；妊娠結(jié)局

精液的精子密度、活力和形態(tài)是評定男性因素不育的常規(guī)檢查指標，但部分臨床診斷為不明原因不育的患者，其精子常規(guī)檢測結(jié)果正常，其他多種常規(guī)輔助檢查結(jié)果也均為陰性。促排卵+宮腔內(nèi)人工授精（IUI）是對此類患者較好的臨床治療策略［1］。但IUI技術(shù)仍需依賴兩性配子的自然受精能力，如果存在精子與卵子透明帶的結(jié)合障礙，IUI就可能失敗。本研究通過使用人精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗（human sperm-hyaluronan acid bindingassay，HBA），分析精子-透明質(zhì)酸結(jié)合能力與不明原因不育患者行IUI后妊娠結(jié)局的相關(guān)性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年7月～2015年5月，在本院生殖內(nèi)分泌科進行的1057例夫精人工授精（artificial insemination with husband sperm，AIH）周期的臨床資料，其中不明原因不孕不育有238例，女方各項生殖功能檢查正常，經(jīng)輸卵管造影證實至少有一側(cè)輸卵管通暢；其男性精液常規(guī)參數(shù)檢測均為正常水平（精子密度＞20×106/mL，前向運動精子＞25%，正常形態(tài)精子＞4%），臨床診斷為：不明原因不孕不育癥。根據(jù)此前的研究，作者對體外受精-胚胎移植周期的患者其體外受精率是否≥70%為分類因變量作ROC曲線，獲得HBA結(jié)合率的最佳分界點65%［2］。以此分界點將238例不明原因不孕不育病例樣本分為A組 （HBA結(jié)合率≥65%）108例和B組（HBA結(jié)合率＜65%）130例，兩組男方年齡、女方年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、卵泡數(shù)及子宮內(nèi)膜厚度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 （均P＞0.05）。詳見表1。

表1 兩組一般資料比較（±s）

表1 兩組一般資料比較（±s）

組別 n 年齡（歲）男女不孕年限（年） BMI（kg/m2） 卵泡數(shù)（個） 子宮內(nèi)膜厚度（mm）A組 108 32.5±4.8 30.7±3.9 3.1±1.6 20.8±3.1 2.3±2.0 10.0±1.8 B組 130 32.0±4.3 30.3±3.9 3.2±2.0 20.8±2.4 2.1±1.6 10.0±2.0

1.2 方法

1.2.1 HBA試驗 試劑盒來自深圳博銳德生物科技有限公司。將10μL液化的精液加入透明質(zhì)酸包被載玻片的“T”孔中，蓋上蓋玻片后待精液自然擴散到“C”孔（對照孔）；室溫放置10分鐘后，在200倍顯微鏡下觀察精子與HBA玻片上的透明質(zhì)酸結(jié)合情況，計算精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率（%）=［（“T”孔被結(jié)合精子數(shù)/“T”孔被結(jié)合精子總數(shù)-“C”孔被結(jié)合精子數(shù)/“C”孔被結(jié)合精子總數(shù)）×100%］。

1.2.2 卵泡監(jiān)測和人工授精時機 自然周期的患者于月經(jīng)周期的第12天開始行經(jīng)陰道超聲檢測?？刂菩猿倥怕鸦颊卟捎萌私^經(jīng)期促性腺激素（HMG）/人絨毛膜促性腺激素（HCG）、來曲唑（LE）/ HMG方案。陰道超聲動態(tài)監(jiān)測卵泡的發(fā)育（卵泡直徑≥14mm為優(yōu)勢卵泡）及子宮內(nèi)膜的厚度和類型。當促黃體生成激素（LH）峰出現(xiàn)或卵泡平均直徑達18mm時，肌肉注射HCG 5000～10000IU，在注射HCG后24～48小時內(nèi)行人工授精，每周期行單次或雙次AIH治療。

1.2.3 精液處理 男方禁欲3天后，采用手淫法取精，待精液液化后，參考《WHO第五版人類精液檢驗和處理手冊》［3］觀察精子密度和活動力，然后取1～2mL精液進行密度梯度離心并重懸收集活力精子用于人工授精。

1.2.4 授精方法 女方取膀胱截石位，暴露宮頸后，用1mL注射器吸取經(jīng)過處理的精子懸液0.3～0.5mL，與人工授精管相連，緩慢注入宮腔內(nèi)，抬高臀部保持仰臥位約20分鐘。術(shù)后常規(guī)黃體支持。4周后行B超檢查，如見妊娠囊，則確定為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)采用（±s）表示，組間比較采用兩組獨立樣本t檢驗，率的比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

A組成功妊娠18例，活產(chǎn)14例，流產(chǎn)4例；B組成功妊娠18例，活產(chǎn)13例，流產(chǎn)3例，宮外孕2例。A組的周期妊娠率16.7%（18/108）較B組13.9% （18/130）高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而兩組間流產(chǎn)率和活產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 兩組妊娠結(jié)局的比較（n，%）

3 討論

本研究通過根據(jù)HBA結(jié)合率的分組比較，首次發(fā)現(xiàn)HBA結(jié)合率與不明原因不孕患者行IUI周期妊娠率有關(guān)，HBA檢測值≥65%者可以獲得更高的周期妊娠率（P＜0.05）。表明HBA結(jié)合率對于此類患者行IUI的成功率具有提示作用。對于臨床上選擇最佳的輔助生殖技術(shù)有一定的參考意義。

精子在發(fā)育過程后期形成透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）結(jié)合位點。透明質(zhì)酸是卵丘復(fù)合物中顆粒細胞基質(zhì)的主要組成部分，兩者的結(jié)合在受精過程中起重要作用。HA與精子發(fā)育過程中的細胞凋亡、DNA碎片化、非整倍體染色體形成以及成熟度等情況有關(guān)。Cayli等［4］發(fā)現(xiàn)HA結(jié)合精子有著較低的caspase-3激活水平，而caspase-3是細胞內(nèi)一個重要的凋亡因子，表明與HA結(jié)合的精子有著更低的凋亡水平。Huszar等［5］發(fā)現(xiàn)了一系列精子成熟的分子標志物，并且通過研究發(fā)現(xiàn)HA與精子中CK和HspA2的水平具有相關(guān)性，進一步實驗揭示了與HA結(jié)合的均為成熟精子。HA與精子DNA碎片化的相關(guān)性也被多項研究證實［6］。Jakab等［7］發(fā)現(xiàn)精子經(jīng)過HA選擇后，其正常形態(tài)精子率提高了3倍。這些研究表明與HA結(jié)合的精子具有較好的質(zhì)量及成熟度。因此，通過HBA試驗檢測精子與固相HA的結(jié)合能力，可以反映精子的質(zhì)量，可能與精卵結(jié)合、胚胎早期卵裂發(fā)育以及妊娠結(jié)局有關(guān)。

目前，HBA與受精及臨床妊娠結(jié)局的相關(guān)性研究報道并不多，研究結(jié)果也不盡相同。Ye等［8］對175例常規(guī)IVF周期樣本研究發(fā)現(xiàn)HBA結(jié)合率與體外受精率顯著相關(guān)，作者也報道過類似的結(jié)果［3］。而Nijs等［9］研究結(jié)果顯示HBA與受精率并無相關(guān)性，卻發(fā)現(xiàn)HBA與妊娠率顯著相關(guān)。Tarozzi等［6］研究報道HBA與體外受精率及臨床妊娠率均無相關(guān)性。Boynukalin等［10］研究結(jié)果提示HBA結(jié)合率并不能提示臨床妊娠率。本組結(jié)果提示，HBA結(jié)合率較高的A組，其周期妊娠率也較高，而與流產(chǎn)率和活產(chǎn)率沒有明顯關(guān)系。

不明原因不孕的可能潛在因素包括卵泡發(fā)育不良、精卵結(jié)合障礙、子宮內(nèi)膜因素、輸卵管撿拾和運送卵子功能異常、黃素化未破裂卵泡綜合征、不良的宮頸分泌物影響、輕度子宮內(nèi)膜異位癥及免疫因素等。因其病因復(fù)雜和不確定性而沒有最佳治療方案。目前主要的治療方案為促排卵同房或IUI，認為經(jīng)3個周期的IUI治療未獲成功者，建議進入IVF-ET周期。本研究結(jié)果顯示HBA結(jié)合率與不明原因不孕患者行IUI后的臨床妊娠率有關(guān)，表明HBA結(jié)合率對于此類患者行IUI的成功率具有提示作用，為選擇合適的輔助生殖技術(shù)提供新思路，并有助于進一步闡明此類患者的不孕機制，最終提高妊娠率。

［1］ Veltman-verhulst SM，Hughes E，Ayeleke RO，et al.Intrauterine insemination for unexplained subfertility.Cochrane Database Syst Rev，2016，2:CD001838

［2］王金香，邱孫全，葉英輝，等.人精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗與IVF-ET結(jié)局相關(guān)性研究.生殖與避孕，2015，35（4）:247

［3］ WHO.Laboratory manual for the examination and processing of human semen（fifth edition）.WHO Press，2010：7

［4］Cayli S，Jakab A，Ovari L，et al.Biochemical markers of sperm function:male fertility and sperm selection for ICSI.Reprod Biomed Online，2003，7（4）:462

［5］ Huszar G，Ozenci CC，Cayli S，et al.Hyaluronic acid binding by human sperm indicates cellular maturity，viability，and unreacted acrosomal status.Fertil Steril，2003，79（Suppl 3）:1616

［6］Tarozzi N，Nadalini M，Bizzaro D，et al.Sperm-hyaluronanbinding assay:clinical value in conventional IVF under Italian law.Reprod Biomed Online，2009，19（Suppl 3）:35

［7］Jakab A，Sakkas D，Delpiano E，et al.Intracytoplasmic sperm injection:a novel selection method for sperm with normal frequency of chromosomal aneuploidies.Fertil Steril，2005，84 （6）:1665

［8］Ye H，Huang GN，Gao Y，et al.Relationship between human sperm-hyaluronan binding assay and fertilization rate in conventional in vitro fertilization.Hum Reprod，2006，21 （6）:1545

［9］Nijs M，Creemers E，Cox A，etal.Relationship between hyaluronic acid binding assay and outcome in ART:a pilot study.Andrologia，2010，42（5）:291

［10］Boynukalin FK，Esinler I，Guven S，et al.Hyaluronan assay does not predict pregnancy rates in IUI cycles in couples with unexplained infertility.Arch Gynecol Obstet，2012，186 （6）:1577