邵紫培，趙瑩，袁洪水

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071000）

科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

響應(yīng)面法優(yōu)化冬蟲夏草菌產(chǎn)多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基

邵紫培，趙瑩，袁洪水*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071000）

本試驗(yàn)應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)冬蟲夏草菌CC-10液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以提高胞內(nèi)多糖含量同時(shí)降低生產(chǎn)成本。試驗(yàn)以多糖含量為響應(yīng)值，先通過(guò)單因素試驗(yàn)確定最適碳源和氮源，采用Plackett-Burman試驗(yàn)從7個(gè)培養(yǎng)基組分中篩選出主要影響因素，爬坡試驗(yàn)逼近最佳響應(yīng)值區(qū)域，最終通過(guò)Box-Behnken Design和響應(yīng)面分析確定主因素的最優(yōu)濃度。結(jié)果表明：冬蟲夏草菌CC-10產(chǎn)多糖的最適碳源為麥芽糖，最適氮源為蛋白胨，綜合菌株生長(zhǎng)特性和生產(chǎn)成本，選擇葡萄糖、麥芽糖組合碳源和蛋白胨、豆餅粉組合氮源；確定葡萄糖、麥芽糖、蛋白胨3個(gè)主因素，得到最優(yōu)的產(chǎn)多糖培養(yǎng)基為葡萄糖9.3 g/L、麥芽糖18.8 g/L、蛋白胨6.1 g/L、豆餅粉4 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L、核黃素0.5 mg/L。優(yōu)化后的多糖含量為4.23%，是優(yōu)化前的2.06倍。試驗(yàn)為后續(xù)大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)提供理論參考。

響應(yīng)面法；冬蟲夏草菌；多糖；培養(yǎng)基優(yōu)化

冬蟲夏草是由冬蟲夏草菌侵染青藏高原山草甸土中的蝙蝠蛾科昆蟲的幼蟲而形成的蟲草復(fù)合體（許亮等，2011）。冬蟲夏草富含多糖、核苷、氨基酸和無(wú)機(jī)元素等多種活性物質(zhì)，保健防病作用顯著，但是其生長(zhǎng)環(huán)境特殊，自然資源匱乏，價(jià)格昂貴。研究表明，人工發(fā)酵后的冬蟲夏草菌絲體與天然冬蟲夏草成分相似，多糖類、核苷類等藥用成分的含量甚至高于天然冬蟲夏草，且二者具有相同的功效和藥理作用（石巖等，2013；詹小濤等，2012）。邵紫培等（2016）用CC-10冬蟲夏草菌粉飼喂肉雞，結(jié)果顯示0.1%或0.2%添加量均能提高肉雞的免疫功能和生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)對(duì)CC-10菌株產(chǎn)多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，期望可以在提高胞內(nèi)多糖含量的同時(shí)降低生產(chǎn)成本，為將來(lái)更好地應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)提供理論參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株冬蟲夏草菌CC-10，保藏于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2培養(yǎng)基PDA加富培養(yǎng)基。

種子液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L，pH值6.7。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源26 g/L、氮源10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.5 g/L、核黃素0.5 mg/L，pH值6.7。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)方法種子液制備：挖取已活化的CC-10菌種1～2 cm2接種于種子培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/500 mL，26℃、180 r/min搖床培養(yǎng)4 d。

發(fā)酵液制備：將種子液以10%（V/V）的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/500 mL，26℃、180 r/min搖床培養(yǎng)5 d。

將發(fā)酵液離心，菌絲體60℃烘干至恒重，粉碎，過(guò)60目篩，即為檢測(cè)樣品。

1.2.2多糖含量測(cè)定取冬蟲夏草菌粉，用80%乙醇脫脂，除去單糖和低聚糖，加入適量的超純水，90℃超聲提取4次，1 h/次，濃縮，Sevage法除去蛋白，加入4倍體積95%的乙醇，靜置24 h，離心收集沉淀，用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，冷凍干燥，得到冬蟲夏草菌絲體精制多糖（穆文靜等，2011）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照黎晶晶和徐格非（2008）的方法。

菌絲體多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法：取0.1 mL樣品多糖溶液置于試管中，補(bǔ)加蒸餾水至體積為1 mL，之后操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，將所得吸光度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得多糖濃度，并計(jì)算菌絲體中多糖含量。

1.2.3單因素試驗(yàn)以菌絲體多糖含量為指標(biāo)，分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、麥芽糊精為唯一碳源，種子液以7%的接種量接種，26℃、180 r/min搖床培養(yǎng)5 d。以最優(yōu)碳源為基礎(chǔ)，分別以牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、蠶蛹粉、豆餅粉為唯一氮源，以相同發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定菌絲體多糖含量。

1.2.4Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)PB設(shè)計(jì)是一種近飽和的2水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，每個(gè)變量選取高（+）、低（-）兩個(gè)水平，包括虛擬變量在內(nèi)共計(jì)11個(gè)變量，分別為X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11，經(jīng)Design-expert 8.05軟件設(shè)計(jì)后，會(huì)產(chǎn)生12次試驗(yàn)，最終得到一個(gè)多元一次回歸方程。

1.2.5最陡爬坡試驗(yàn)最陡爬坡試驗(yàn)的爬坡方向與試驗(yàn)值變化的梯度方向一致，變化步長(zhǎng)由各因素效應(yīng)值的大小決定，能快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最佳值區(qū)域（Montgomery等，1991）。

1.2.6Box-Behnken Design（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)進(jìn)行三因素三水平（-1，0，+1）試驗(yàn)得到包括一次項(xiàng)、平方項(xiàng)和交互項(xiàng)的多元二次回歸方程。采用Design-expert 8.05軟件繪制響應(yīng)面立體分析圖，得出響應(yīng)值的最優(yōu)值和各因素的最優(yōu)水平。所得到的參數(shù)需進(jìn)行多次重復(fù)試驗(yàn)，以驗(yàn)證模型的可靠性，并確定最終的優(yōu)化結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1碳源對(duì)菌絲體多糖含量的影響由圖1可知，CC-10菌株能在不同程度上利用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，而不能有效利用麥芽糊精產(chǎn)生胞內(nèi)多糖。其中，以麥芽糖為發(fā)酵培養(yǎng)基唯一碳源時(shí)，菌絲體多糖含量最高，為（2.36±0.14）%，而以葡萄糖為單一碳源時(shí)，多糖含量為（2.00±0.24）%，并且葡萄糖價(jià)格較麥芽糖低，所以選擇葡萄糖和麥芽糖作為組合碳源進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1　碳源對(duì)多糖含量的影響

2.1.2氮源對(duì)菌絲體多糖含量的影響由圖2可知，CC-10菌株能不同程度利用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、蠶蛹粉、豆餅粉，其中，以蛋白胨為唯一氮源時(shí)，菌絲體多糖含量最高，可達(dá)（2.75± 0.34）%。綜合考慮菌株生長(zhǎng)特性和工業(yè)化生產(chǎn)成本，選用價(jià)格較為低廉的豆餅粉與蛋白胨共同作為后續(xù)研究的氮源。

圖2　氮源對(duì)多糖含量的影響

表1　Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2PB試驗(yàn)篩選主效應(yīng)因子結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，本研究選取7個(gè)潛在的影響CC-10菌絲體多糖含量的因素為實(shí)際變量，包括葡萄糖（X1）、麥芽糖（X2）、蛋白胨（X3）、豆餅粉（X4）、MgSO4（X5）、KH2PO4（X6）、核黃素（X7），并余4個(gè)虛擬變量X8、X9、X10、X11作為誤差分析來(lái)進(jìn)行PB試驗(yàn)。PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表1，每個(gè)因素包括高低兩個(gè)水平，每組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)取平均值。

由表2可知，該模型極顯著（P=0.0064＜0.01）。在90%的置信區(qū)間內(nèi)，對(duì)胞內(nèi)多糖含量有顯著影響的因素依次為麥芽糖＞蛋白胨＞葡萄糖，三個(gè)因素均表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，濃度可適當(dāng)降低，作為發(fā)酵優(yōu)化的主要因素，進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面分析。其他四種因素對(duì)胞內(nèi)多糖含量影響不顯著，為降低生產(chǎn)成本，應(yīng)維持在低水平。各因素經(jīng)回歸分析，得多元一次方程：

表2　Plackett-Burman設(shè)計(jì)各因素效應(yīng)分析和評(píng)價(jià)

經(jīng)方差分析，該模型Prob＞F值為0.0064，所得回歸方程極顯著，證明該模型在所研究區(qū)域擬合良好。決定系數(shù)R2為97.08%，調(diào)整性決定系數(shù)Adj R2為91.98%，進(jìn)一步證明了該模型的可靠性。精密度顯示的是信噪比，其值大于4.0視為合理，本試驗(yàn)精密度達(dá)14.001。

2.3最陡爬坡試驗(yàn)為了逼近多糖含量最高的區(qū)域，根據(jù)PB篩選出的主效應(yīng)值的大小及正負(fù)進(jìn)行了爬坡試驗(yàn)。由表3可知，當(dāng)葡萄糖、麥芽糖、蛋白胨濃度分別為9、19、6 g/L時(shí)，多糖含量達(dá)到最高4.17%，表明最高多糖含量區(qū)在第4組試驗(yàn)附近。

表3　最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4Box-Behnken中心組合試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1Box-Behnken中心組合試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，選擇第4組作為Box-Behnken中心組合試驗(yàn)的中心點(diǎn)，利用Design-Expert 8.05軟件設(shè)計(jì)3因素3水平，共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的中心組合試驗(yàn)，共包括12個(gè)析因點(diǎn)和5個(gè)零點(diǎn)重復(fù)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

利用Design-Expert 8.05軟件對(duì)中心組合試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到多糖含量（Y）對(duì)葡萄糖（A）、麥芽糖（B）、蛋白胨（C）的多元二次回歸方程：

表4　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

回歸方程及模型相關(guān)顯著性分析見表5。由表5可見，CC-10菌株產(chǎn)胞內(nèi)多糖響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ蚉r=0.0010＜0.01，說(shuō)明方程擬合度較好，在α= 0.01水平上回歸極顯著；失擬項(xiàng)誤差為0.1288＞0.05，表明失擬不顯著，殘差是由隨機(jī)誤差引起，證明該模型選擇較合適；復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9492，說(shuō)明預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)值之間相關(guān)性高度一致；調(diào)整性決定系數(shù)Adj R2=0.8840，表明該模型可信度很高，可以很好地描述試驗(yàn)結(jié)果。由表5可知，因素A、B、C對(duì)產(chǎn)多糖的線性效應(yīng)均不顯著；因素A2、B2、C2對(duì)產(chǎn)多糖的曲面效應(yīng)均顯著；因素A、C和B、C之間對(duì)產(chǎn)多糖的交互影響均不顯著，而因素A、B之間對(duì)產(chǎn)多糖的交互影響顯著。

2.4.2CC-10菌株產(chǎn)多糖響應(yīng)面分析利用Design-Expert 8.05軟件根據(jù)多元二次回歸方程繪制了相應(yīng)的三維響應(yīng)曲面和等高線圖（圖3～5），用該圖對(duì)影響多糖產(chǎn)量的任何兩種因素之間的交互效應(yīng)進(jìn)行分析，進(jìn)而確定最佳因素水平。

表5　響應(yīng)面試驗(yàn)方差結(jié)果分析

圖3　葡萄糖和麥芽糖對(duì)多糖含量交互影響的三維曲面圖（A）和等高線圖（B）

由圖3可知，葡萄糖和麥芽糖對(duì)多糖含量的影響顯示，當(dāng)?shù)鞍纂撕繛? g/L時(shí)，多糖含量隨著二者含量的增加先升高后下降，趨勢(shì)一致，但是沿葡萄糖方向的等高線密度大于沿麥芽糖方向的等高線密度，說(shuō)明在一定范圍內(nèi)增加葡萄糖的量比增加麥芽糖的量更有效。同時(shí)可以看出等高線接近橢圓，說(shuō)明兩者交互作用顯著（P＜0.05）。由圖4可知，葡萄糖和蛋白胨對(duì)多糖含量的影響顯示，當(dāng)麥芽糖含量為19 g/L時(shí)，多糖含量隨著二者含量的增加先升高后下降，但是沿蛋白胨方向的等高線密度大于沿葡萄糖方向的等高線密度，說(shuō)明在一定范圍內(nèi)增加蛋白胨的量比增加葡萄糖的量更有效。但是等高線不接近橢圓，說(shuō)明兩者交互作用不顯著（P＞0.05）。由圖5可知，麥芽糖和蛋白胨對(duì)多糖含量的影響顯示，當(dāng)葡萄糖含量為9 g/L時(shí)，多糖含量隨著二者含量的增加先升高后下降。但是等高線不接近橢圓，說(shuō)明兩者交互作用不顯著（P＞0.05）。

圖4　葡萄糖和蛋白胨對(duì)多糖含量交互影響的三維曲面圖（A）和等高線圖（B）

圖5　麥芽糖和蛋白胨對(duì)多糖含量交互影響的三維曲面圖（A）和等高線圖（B）

2.4.3CC-10菌株產(chǎn)多糖響應(yīng)面結(jié)果的優(yōu)化分析與條件驗(yàn)證回歸方程對(duì)CC-10菌株產(chǎn)多糖響應(yīng)面試驗(yàn)擬合良好，因此可用回歸方程對(duì)此試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析。采用Design-Expert 8.05軟件獲取多糖含量最大值，步驟如下：Optimization→Numerical→Criteria中選取“多糖含量”，Goal中選擇maximize，設(shè)置Upper為6，Lower為默認(rèn)→Solutions中可得到最大值為4.2318%，此時(shí)，葡萄糖含量為9.32 g/L、麥芽糖含量為18.79 g/L、蛋白胨含量為6.14 g/L，實(shí)際試驗(yàn)中添加量為葡萄糖9.3 g/L、麥芽糖18.8 g/L、蛋白胨6.1 g/L。為了驗(yàn)證多糖含量模型的有效性和實(shí)用性，利用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行6次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得多糖含量的平均值為（4.16±0.15）%，與預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，因此該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。優(yōu)化前多糖含量為2.05%，利用最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵胞內(nèi)多糖含量是未優(yōu)化的2.06倍。

3　討論

蟲草多糖對(duì)免疫系統(tǒng)具有增強(qiáng)作用，具體表現(xiàn)為能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和刺激腹腔吞噬細(xì)胞的吞噬功能，進(jìn)而提高機(jī)體免疫力（郎久義等，2008）。胡雅婷等（2004）利用蟲草菌粉飼喂雛雞，結(jié)果顯示，中、高劑量（0.6、1.8 g/kg）蟲草菌粉能夠極顯著提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。王米等（2015）研究表明，合適濃度的蛹蟲草多糖能促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO、NOS和iNOS以及TNF-α，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的功能。本研究以冬蟲夏草菌CC-10液體發(fā)酵產(chǎn)多糖為優(yōu)化指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化后的胞內(nèi)多糖含量達(dá)4.23%，是優(yōu)化前的2.06倍，可以用于生產(chǎn)更優(yōu)的飼料添加劑。

培養(yǎng)基的優(yōu)化常采用正交試驗(yàn)法和響應(yīng)面法，正交試驗(yàn)法可同時(shí)考慮多個(gè)因素并且尋找最佳因素水平組合，但是無(wú)法得到因素與響應(yīng)值在整個(gè)區(qū)域的一個(gè)明確回歸方程，因而無(wú)法得到最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。響應(yīng)面法可用來(lái)確定試驗(yàn)因素及因素間的交互作用對(duì)試驗(yàn)過(guò)程中響應(yīng)值的影響，通過(guò)回歸方程及三維曲面圖能準(zhǔn)確、清晰地得出最優(yōu)試驗(yàn)因素及響應(yīng)值，因此應(yīng)用廣泛。陳雄等（2009）利用響應(yīng)面法優(yōu)化地衣芽孢桿菌A2發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化后發(fā)酵液中A2的活菌含量達(dá)1.30×1011cfu/mL，比優(yōu)化前提高了近3倍。王飛等（2007）采用響應(yīng)面法優(yōu)化北蟲草產(chǎn)多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化后培養(yǎng)液多糖含量為1.977×10-2g/mL。本試驗(yàn)先采用單因素試驗(yàn)確定了最佳碳源、氮源的種類，進(jìn)而利用響應(yīng)面法優(yōu)化CC-10菌株產(chǎn)多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化后胞內(nèi)多糖含量為4.23%。

4　結(jié)論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化冬蟲夏草菌CC-10產(chǎn)多糖液體發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)響應(yīng)面分析確定了最優(yōu)培養(yǎng)基為葡萄糖9.3 g/L、麥芽糖18.8 g/L、蛋白胨6.1 g/L，通過(guò)多元二次回歸方程分析，該模型回歸顯著，擬合度良好，為后續(xù)大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)提供了理論參考。

［1］陳雄，袁金鳳，王志等．響應(yīng)面法優(yōu)化地衣芽孢桿菌A2發(fā)酵培養(yǎng)基［J］．中國(guó)飼料，2009，7：17～20．

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In order to enhance cell yield of polysaccharide and reduce production cost，this study used response surface methodology to optimize liquid fermentation medium of Cordyceps sinensis CC-10 strain.Taking the content of polysaccharide as response value，the single-factor design was used to screen the suitable carbon and nitrogen source. Plackett-Burman design was employed to screen main influence factors from seven medium components.Then the steepest ascent experiment was used to approach maximum response area.Last optimum levels of critical variables were determined by Box-Behnken Design.The results showed that maltose and peptone were screened as the optimal carbon source and nitrogen source，respectively.Considering the growth characteristics of CC-10 strain and production cost，combination carbon source of glucose and maltose，combination nitrogen source of peptone and bean cake powder were chose.Glucose，maltose and nitrogen were identified as main influencing factors，the optimized composition were：glucose 9.3 g/L，maltose 18.8 g/ L，peptone 6.1 g/L，bean cake powder 4 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，riboflavin 0.5 mg/L.Under the optimum medium，cell yield of polysaccharide was up to 4.23%，which was increased by 1.06 times of previous optimization.The study could provide a theory reference for the mass production in the future.

response surface methodology；Cordyceps sinensis；polysaccharide；medium optimization

S816.7

A

1004-3314（2016）13-0009-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161302