穆淑梅，樊高君，張才達(dá)，王海玲，康現(xiàn)江

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定　071002)

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莠去津?qū)χ腥A絨螯蟹精子LDH、ACP活性的影響

穆淑梅，樊高君，張才達(dá)，王海玲，康現(xiàn)江

(河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定071002)

為了評(píng)估莠去津?qū)π坌灾腥A絨螯蟹的生殖毒性，以成熟雄性中華絨螯蟹為材料，采用莠去津梯度(0.001、0.01、0.1、1 mg/L)暴露方式進(jìn)行體內(nèi)染毒2周，通過分光光度法和聚丙烯酰胺凝膠電泳酶譜法，分析中華絨螯蟹精子中乳酸脫氫酶(LDH)和酸性磷酸酶(ACP)的活性，比較其催化能力的變化.結(jié)果顯示，0.1 mg/L莠去津處理組精子的LDH、ACP比活力是所有組別中最高的，且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；1 mg/L的次之，但同2個(gè)低質(zhì)量濃度組(0.001、0.01 mg/L)的一樣，均較對(duì)照組差異不顯著(P>0.05).凝膠電泳后活性染色分析結(jié)果顯示2種酶的催化能力的變化與分光光度法結(jié)果一致.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定質(zhì)量濃度的莠去津?qū)π坌灾腥A絨螯蟹具生殖毒性，可為莠去津?qū)θ祟惿辰】档挠绊懱峁﹨⒖紨?shù)據(jù).

莠去津；中華絨螯蟹；精子；乳酸脫氫酶(LDH)；酸性磷酸酶(ACP)

近年來，隨著環(huán)境污染日益嚴(yán)重，環(huán)境與生殖健康越來越受到人們的關(guān)注.李衛(wèi)華等[1]在分析中國(guó)環(huán)境對(duì)生殖健康的危害現(xiàn)狀時(shí)指出，中國(guó)男性精液質(zhì)量不斷下降，直接導(dǎo)致生育能力降低；而與國(guó)民生計(jì)有關(guān)的6～7萬種化學(xué)物質(zhì)中20%具有生殖毒性.

莠去津(atrazine，ATR)作為一種高效除草劑被廣泛應(yīng)用，但是其殘效期長(zhǎng)、水溶性較大，可隨地表徑流進(jìn)入河流、湖泊，對(duì)地下水和地表水造成污染.目前，莠去津已成為世界公認(rèn)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，對(duì)人類和其他動(dòng)物的生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等造成負(fù)面影響[2-3].

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱河蟹、大閘蟹，是中國(guó)傳統(tǒng)名貴水產(chǎn)品之一，養(yǎng)殖范圍更是遍布全國(guó).研究表明，莠去津干擾中華絨螯蟹蛻皮激素[4]、蛻皮抑制激素[5]的分泌，甚至造成血淋巴細(xì)胞的DNA損傷[6].本實(shí)驗(yàn)通過分光光度法和聚丙烯酰胺凝膠電泳酶譜法分析、檢測(cè)莠去津暴露后中華絨螯蟹精子中乳酸脫氫酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)的活性變化，評(píng)估莠去津?qū)π坌灾腥A絨螯蟹的生殖毒性，為該除草劑對(duì)人類生殖健康的影響提供參考數(shù)據(jù).

1　材料與方法

1.1材料

正常性成熟雄性中華絨螯蟹購(gòu)自河北省白洋淀，體質(zhì)量平均為(121.2±3.2)g.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室水族箱中，水深6～8 cm，每日早晚各投喂1次，每2天換水1次.投喂餌料為玉米和蝦混合物.

1.2試劑及儀器

主要試劑：莠去津(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%，Sigma)；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、NAD、NBT、PMS(Biotopped)；Tris(BBI life sciences)；通用蛋白裂解/抽提試劑、BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒(博邁德生物科技有限公司)；乳酸脫氫酶活性測(cè)定試劑盒、酸性磷酸酶活性測(cè)定試劑盒(南京建成生物科技有限公司).其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

主要儀器：微型電動(dòng)組織勻漿機(jī)(Kimble)，2-16PK高速冷凍離心機(jī)(Sigma)，電熱恒溫水浴鍋(上海啟勝儀器有限公司)，DYY-6C恒流穩(wěn)壓電泳儀(北京市六一儀器廠)，24DN電泳槽(北京市六一儀器廠)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)，F(xiàn)ilter Max F5多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices).

1.3方法

1.3.1莠去津梯度暴露

成熟雄性中華絨螯蟹于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7～10 d，以便其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境.挑選體型均勻且活躍的中華絨螯蟹為實(shí)驗(yàn)材料.在玻璃水族箱中加入3 L曝氣水(每L水含海水晶20 g)和莠去津儲(chǔ)液，使莠去津的終質(zhì)量濃度分別為0.001、0.01、0.1、1 mg/L，對(duì)照組以dd H2O代替莠去津，每組設(shè)置3個(gè)平行處理.莠去津暴露時(shí)間2周.

1.3.2精莢(子)蛋白制備及質(zhì)量濃度測(cè)定

解剖莠去津處理后的成熟雄性中華絨螯蟹，取儲(chǔ)精囊置于預(yù)冷的無鈣人工海水中，用手術(shù)剪剪碎至無明顯塊狀組織后，于冰上靜置10 min，棄去上清液，再次加入預(yù)冷的無鈣人工海水，清洗精莢，重復(fù)3次.將清洗后的精莢轉(zhuǎn)入離心管中，4 ℃，3 000 r/min，離心5 min，棄上清液，沉淀即為精莢(內(nèi)含精子).

按1 g精莢加入1 mL組織裂解液的比例，將精莢和組織裂解液混合，微型電動(dòng)組織勻漿機(jī)低溫(冰浴)勻漿2 min，冰上靜置5 min，使組織充分裂解.4 ℃，1 4 000 r/min，離心20 min，收集上清液即為精莢(子)蛋白.

按BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒說明書的操作步驟測(cè)定精莢(子)蛋白質(zhì)量濃度，以計(jì)算分光光度法和聚丙烯酰胺凝膠電泳的加樣量.

1.3.3分光光度法測(cè)定酶的比活力

分別按照乳酸脫氫酶活性測(cè)定試劑盒、酸性磷酸酶活性測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定莠去津暴露后中華絨螯蟹精子乳酸脫氫酶、酸性磷酸酶比活力.

乳酸脫氫酶酶活力定義：每g組織蛋白在37 ℃反應(yīng)條件下與基質(zhì)作用15 min，反應(yīng)體系中產(chǎn)生1 μmol丙酮酸為1個(gè)酶活力單位.比活力(U/g)計(jì)算公式參見乳酸脫氫酶活性測(cè)定試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)說明書.

酸性磷酸酶酶活力定義：每g組織蛋白在37 ℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個(gè)活力單位.比活力(U/g)計(jì)算公式參見酸性磷酸酶活性測(cè)定試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)說明書.

1.3.4聚丙烯酰胺凝膠電泳法分析酶活性

采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%的分離膠、4%濃縮膠，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳.根據(jù)所測(cè)得的蛋白質(zhì)量濃度，計(jì)算每組蛋白上樣量，確保上樣后每組總蛋白含量相同.

電泳完畢，取出凝膠分別置于事先配制好的乳酸脫氫酶、酸性磷酸酶特異顯色液中，37 ℃恒溫孵育1.5 h，待凝膠上出現(xiàn)明顯條帶后，即可棄去顯色液.用dd H2O漂洗凝膠后加入體積分?jǐn)?shù)7%的冰醋酸固定.

用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行呈像并拍照.將圖片上的特異顯色條帶用Quantity One軟件進(jìn)行分析，以便分析莠去津?qū)χ腥A絨螯蟹精子中乳酸脫氫酶、酸性磷酸酶活性的影響.

1.3.5數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示.利用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan多重比較分析各組間均數(shù)的差異顯著性.P<0.05差異顯著.

2　結(jié)果

2.1莠去津?qū)χ腥A絨螯蟹精子乳酸脫氫酶比活力的影響

將測(cè)得的蛋白質(zhì)量濃度和樣品的吸光值代入乳酸脫氫酶比活力計(jì)算公式中，得到對(duì)照組和各莠去津處理組乳酸脫氫酶比活力之間的差異(表1).對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)在所有組別中，0.1 mg/L組精子的乳酸脫氫酶比活力最高，為227.85 U/g，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；1 mg/L組的次之，為222.01 U/g，但相比對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；而2個(gè)較低質(zhì)量濃度組0.001 mg/L和0.01 mg/L與對(duì)照組相比，中華絨螯蟹精子乳酸脫氫酶比活力亦無顯著變化，0.001 mg/L組酶比活力基本與對(duì)照組相同，0.01 mg/L組酶比活力略高，為181.47 U/g.

表1　莠去津暴露后中華絨螯蟹精子乳酸脫氫酶(LDH)比活力的變化

標(biāo)有不同字母者表示組間差異顯著(P<0.05)；標(biāo)有相同字母者表示組間差異不顯著(P>0.05).

聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果(圖1)顯示乳酸脫氫酶特異性染色條帶.將聚丙烯酰胺凝膠電泳所得乳酸脫氫酶酶譜用Quantity One軟件分析，對(duì)其灰度賦值后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析.結(jié)果(圖2)顯示，0.1 mg/L組乳酸脫氫酶活性仍是所有組別中最高的，且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；1 mg/L組的酶活同樣是次高，但相較于對(duì)照組并未表現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)；0.001 mg/L和0.01 mg/L組與對(duì)照組相比亦無顯著變化(P>0.05).分析結(jié)果與分光光度法測(cè)定結(jié)果一致.

1.對(duì)照；2.0.001 mg/L；3.0.01 mg/L； 標(biāo)有不同字母者表示組間差異顯著(P<0.05)；標(biāo)有相同字4.0.1 mg/L；5.1 mg/L. 母者表示組間差異不顯著(P>0.05).圖1　莠去津處理后中華絨螯蟹精子乳酸脫氫酶(LDH)聚 圖2　聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)莠去津?qū)χ腥A絨螯蟹精丙烯酰胺凝膠電泳酶譜子乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響(n=6)Fig.1　Polyacrylamide gel electrophresis results of LDH in Fig.2　Effects of atrazine on the activity of LDH in spermatozoaEriocheir sinensis spermatozoa exposed to atrazineof Eriocheir sinensis detected by polyacrylamide gel electrophresis

2.2莠去津?qū)χ腥A絨螯蟹精子酸性磷酸酶比活力的影響

莠去津暴露后，利用分光光度法測(cè)定中華絨螯蟹精子酸性磷酸酶的活性，如表2.數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示：0.1 mg/L組中華絨螯蟹精子酸性磷酸酶比活力為23.93 U/g，顯著高于對(duì)照組(P<0.05).其他暴露組均較對(duì)照組酶活有所升高，但是均未產(chǎn)生顯著差異(P>0.05).

表2　莠去津暴露后中華絨螯蟹精子酸性磷酸酶(ACP)比活力的變化

標(biāo)有不同字母者表示組間差異顯著(P<0.05)；標(biāo)有相同字母者表示組間差異不顯著(P>0.05).

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得中華絨螯蟹精子中酸性磷酸酶酶譜(圖3)，同樣利用Quantity One軟件進(jìn)行灰度賦值，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果(圖4)表明：莠去津暴露后，0.1 mg/L組中華絨螯蟹精子中酸性磷酸酶活性亦在所有組別中最高，且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其他處理組酸性磷酸酶活性均無顯著變化(P>0.05).分析結(jié)果與分光光度法測(cè)定結(jié)果相符.

1.對(duì)照；2.0.001 mg/L；3.0.01 mg/L； 　　　標(biāo)有不同字母者表示組間差異顯著(P<0.05)；4.0.1 mg/L；5.1 mg/L.　　　標(biāo)有相同字母者表示組間差異不顯著(P>0.05).圖3　莠去津處理后中華絨螯蟹精子酸性磷酸圖4　　　　酶譜法分析莠去津?qū)χ腥A絨螯蟹精子酸性磷酸酶(ACP)酶(ACP)聚丙烯酰胺凝膠電泳酶譜　　　活性的影響(n=6)Fig.3　Polyacrylamide gel electrophresis results of ACP Fig.4　Effects of atrazine on the activity of ACP of Eriocheir sinensis in Eriocheir sinensis spermatozoa exposed to atrazine sperm detected by polyacrylamide gel electrophresis(n=6)

3　討論

本實(shí)驗(yàn)研究莠去津?qū)χ腥A絨螯蟹精子乳酸脫氫酶、酸性磷酸酶活性的影響，精子取自中華絨螯蟹儲(chǔ)精囊，進(jìn)入到儲(chǔ)精囊中的精子已完全成熟，緊密排布在精莢中[7]，精子的代謝活動(dòng)也主要發(fā)生在精莢中[8].中華絨螯蟹的精莢由精子、精莢基質(zhì)、精莢壁組成，精莢基質(zhì)為精巢分泌物，而精莢壁實(shí)質(zhì)上也是由外周的精莢基質(zhì)濃縮而成[7].因此，中華絨螯蟹精莢中主要成分是精子，提取精莢并破碎勻漿后獲得的蛋白也基本能反映精子中蛋白組成，故本研究從儲(chǔ)精囊中獲得精莢后即制備蛋白提取液用于酶活檢測(cè)，而并未再破碎精莢獲得純精子后再制備其蛋白提取液，這樣減少了處理步驟，以減少對(duì)酶活的影響.

在檢測(cè)酶活性方面，分光光度法是常用的方法之一.本實(shí)驗(yàn)中，采用分光光度法檢測(cè)了莠去津處理后2種酶比活力的變化.比活力反應(yīng)酶的純度，其大小可用來比較每單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力[9]336.早在1980年，Heussen和Dowdle就提出了用聚丙烯酰胺凝膠電泳酶譜法檢測(cè)尿激酶等纖溶酶原激活劑活性的方法，在他們的實(shí)驗(yàn)中最低酶活檢出量為1 mU[10].Huang等[11]改變底物濃度，尿激酶的檢出量甚至可以低至0.39 μU(約0.78 ng).此外，不同條件下(如溫度、pH等)的酶活性比較，亦可以通過聚丙烯酰胺凝膠電泳酶譜法進(jìn)行分析檢測(cè)[12].實(shí)驗(yàn)中采用上述2種方法分析莠去津體內(nèi)暴露后中華絨螯蟹精子乳酸脫氫酶、酸性磷酸酶活性的變化，2種方法所得結(jié)果互相印證，可增加毒理實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性.

乳酸脫氫酶是一種糖酵解酶，以NADH為供氫體，催化丙酮酸羰基的還原生成乳酸，與細(xì)胞的能量代謝有關(guān).精子乳酸脫氫酶在精子發(fā)生過程中轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，使發(fā)育中的精子能夠利用丙酮酸作為能源[13]84.精子乳酸脫氫酶不僅與精子的發(fā)生有關(guān)，而且與精子的代謝、獲能和受精過程密切相關(guān)[14-15].因此，乳酸脫氫酶活性可以作為檢測(cè)精子質(zhì)量的重要指標(biāo).

實(shí)驗(yàn)中采用分光光度法和聚丙烯酰胺凝膠電泳酶譜法，測(cè)定、分析莠去津體內(nèi)暴露后中華絨螯蟹精子乳酸脫氫酶活性的變化，2種檢測(cè)方法結(jié)果趨勢(shì)相同，均為0.1 mg/L處理組酶活最高，且與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05).1 mg/L處理組的酶活次之，但同2個(gè)低質(zhì)量濃度組(0.001、0.01 mg/L)的一樣，均較對(duì)照組差異不顯著(P>0.05).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.1 mg/L的莠去津可造成中華絨螯蟹精莢中精子代謝異常.乳酸脫氫酶比活力升高，催化能力增強(qiáng)，將導(dǎo)致其參與的氧化還原反應(yīng)的產(chǎn)物乳酸在精子內(nèi)的蓄積，使精子內(nèi)部pH值降低.研究表明，Ca2+在動(dòng)物精子頂體反應(yīng)的離子調(diào)控中起主導(dǎo)作用，哺乳動(dòng)物中Ca2+內(nèi)流可導(dǎo)致H+外流，精子內(nèi)部pH升高，誘發(fā)頂體反應(yīng)[13]102.據(jù)此，實(shí)驗(yàn)中，由于乳酸脫氫酶活性的升高導(dǎo)致的精子內(nèi)部pH值降低，可影響中華絨螯蟹精子的頂體反應(yīng)，不利于精卵結(jié)合.

酸性磷酸酶是一類在酸性條件下催化磷酸酯類水解的酶，可參與機(jī)體的各種代謝過程，如滲透調(diào)節(jié)，發(fā)育分化，蛋白質(zhì)合成，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，性腺發(fā)育等[16-17]；同時(shí)，精子中酸性磷酸酶活性變化會(huì)引起精子頂體反應(yīng)異常，因此，精子酸性磷酸酶活力水平通常是判斷精子活力的標(biāo)準(zhǔn)之一[18].

中華絨螯蟹成熟精子中的酸性磷酸酶主要分布在頂體管中，與精卵結(jié)合時(shí)精子的頂體反應(yīng)有關(guān)[19].本實(shí)驗(yàn)分析測(cè)定了莠去津體內(nèi)暴露后中華絨螯蟹精子中酸性磷酸酶活性的變化，2種方法檢測(cè)顯示0.1 mg/L處理組精子酸性磷酸酶活性最高，且顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；其余各處理組相較對(duì)照組無顯著差異(P>0.05).就人類而言，男性個(gè)體生殖健康檢查指標(biāo)中顯示精子酸性磷酸酶活性升高與細(xì)胞受損的程度呈正相關(guān)；同時(shí)精子頂體中酸性磷酸酶酶活性升高，也反應(yīng)出精子發(fā)生頂體反應(yīng)的速度加快[21-22].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，0.1 mg/L莠去津組中華絨螯蟹成熟精子酸性磷酸酶活性升高，預(yù)示著該質(zhì)量濃度莠去津使中華絨螯蟹精子受損，加快了其頂體反應(yīng)速度.精子頂體反應(yīng)是精卵結(jié)合的先決條件，過快或過慢的頂體反應(yīng)過程均會(huì)造成精卵結(jié)合障礙，從而影響受精作用.

本實(shí)驗(yàn)乳酸脫氫酶、酸性磷酸酶的結(jié)果均呈現(xiàn)出莠去津暴露后的倒“U”形毒性效應(yīng)，即毒性效應(yīng)出現(xiàn)在中間質(zhì)量濃度組.毒理學(xué)研究中受試物的“U”形效應(yīng)和倒“U”形效應(yīng)是比較常見的現(xiàn)象，如焦?jié)M靜等[4]考察了莠去津作用后中華絨螯蟹血清中蛻皮激素含量的變化，發(fā)現(xiàn)僅0.1 mg/L質(zhì)量濃度組對(duì)血清中蛻皮激素含量影響顯著，而0.001、0.01 mg/L組和1 mg/L組并未顯現(xiàn)毒性效應(yīng)，亦符合倒“U”形效應(yīng)規(guī)則.

中國(guó)關(guān)于莠去津生產(chǎn)企業(yè)污染物的排放標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，莠去津排放不得超過1 mg/L[22].本實(shí)驗(yàn)中，一定質(zhì)量濃度的莠去津(0.1 mg/L)對(duì)雄性中華絨螯蟹顯現(xiàn)出生殖毒害作用，提示應(yīng)加強(qiáng)該農(nóng)藥生產(chǎn)排污后的監(jiān)管與監(jiān)測(cè)，同時(shí)嚴(yán)格控制該除草劑使用時(shí)的施藥質(zhì)量濃度.

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Effects of atrazine on the enzymatic activities of LDH and ACP in spermatozoa of Eriocheir sinensis

MU Shumei,FAN Gaojun,ZHANG Caida,WANG Hailing,KANG Xianjiang

(College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China)

In order to evaluate the reproductive toxicities of atrazine on male Chinese mitten handed crab,Eriocheirsinensis,mature male crabs were treated with 0.001,0.01,0.1,1 mg/L of atrazine for 2 weeks.The enzymatic activities of lactate dehydrogenase (LDH) and acid phosphatase (ACP) in the spermatozoa of the crabs were measured by spectrophotometry and polyacrylamide gel electrophresis.As for 0.1 mg/L atrazine groups,the activities of LDH and ACP were the highest and they were also significantly higher than the control groups (P<0.05).There was no significant difference in the activities of LDH and ACP between the control and the atrazine treated groups (0.001,0.01,1 mg/L;P>0.05).The changes of the activities of LDH and ACP after atrazine treatment detected by polyacrylamide gel electrophresis and spectrophotometry were consistent with each other.The results indicate that atrazine exposure affects the reproductivity of maleE.sinensis.Our study can provide reference data for atrazine impact on human reproductive health.

atrazine;Eriocheirsinensis;spermatozoa;lactate dehydrogenase (LDH) ;acid phosphatase (ACP)

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.02.009

2015-07-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31202000，31272309)；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(C2011201028)；河北大學(xué)博士基金資助項(xiàng)目(2012-239)；河北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(14967611D)；河北省生物學(xué)強(qiáng)勢(shì)特色學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目；河北大學(xué)中西部高校提升綜合實(shí)力工程項(xiàng)目

穆淑梅(1972—)，女，河北曲陽(yáng)人，河北大學(xué)副教授，主要從事生殖毒理學(xué)研究.E-mail:shumeimu@126.com

康現(xiàn)江(1964—)，男，河北邯鄲人，河北大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，主要從事細(xì)胞發(fā)育分化及其調(diào)控方面的研究.

E-mail:xjkang@hbu.edu.cn

X503.225;Q959.223.63

A

1000-1565(2016)02-0162-07