王夢(mèng)雨，王文霞，趙小明，尹 恒

(1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧大連 116023； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

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殼寡糖對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗的保護(hù)作用及相關(guān)代謝產(chǎn)物的影響

王夢(mèng)雨1，2，王文霞1，趙小明1，尹 恒1

(1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧大連 116023； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

為了解殼寡糖對(duì)低溫脅迫下小麥的保護(hù)作用，對(duì)兩個(gè)小麥品種(小偃22和西農(nóng)9871)幼苗噴施100 mg·L-1殼寡糖和0℃低溫脅迫96 h，檢測(cè)葉片的損傷面積及丙二醛、脯氨酸、可溶性糖、還原糖含量，并調(diào)查復(fù)溫后返青率。結(jié)果表明，與常溫對(duì)照組相比，低溫脅迫48 h后殼寡糖處理的小麥葉片損傷面積和丙二醛含量增幅較低，其中小偃22和西農(nóng)9871的損傷面積相對(duì)于低溫對(duì)照分別減少了25.3%和28.8%，丙二醛含量分別降低了16.9%和33.7%；同時(shí)，兩個(gè)品種葉片脯氨酸含量分別提高了15.8%和26.7%，還原糖含量分別提高了25.6和14.3%，可溶性糖含量也表現(xiàn)出增高的趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)復(fù)溫培養(yǎng)，殼寡糖處理下小偃22和西農(nóng)9871的返青率分別提高了4.6%和5.9%。說(shuō)明殼寡糖可通過(guò)促進(jìn)小麥苗脯氨酸、還原糖等低溫抗性相關(guān)次生代謝物的表達(dá)，提高其對(duì)低溫寒害的抵抗能力。

殼寡糖；小麥；低溫脅迫；次生代謝物

低溫凍害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要的自然災(zāi)害之一，嚴(yán)重影響作物正常的生長(zhǎng)發(fā)育和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量[1]。冬小麥?zhǔn)俏覈?guó)北方主要的糧食作物，因其冬前播種、越冬休眠、冬后返青拔節(jié)的生長(zhǎng)特點(diǎn)，極易受到低溫凍害的影響[2-4]。低溫脅迫會(huì)使小麥的脂質(zhì)過(guò)氧化，質(zhì)膜結(jié)構(gòu)受到破壞，造成光合作用效率降低，能量產(chǎn)生和物質(zhì)合成受阻，同時(shí)為了維持正常的代謝活動(dòng)，植株的呼吸作用增強(qiáng)，能量消耗增加，會(huì)嚴(yán)重抑制小麥的正常生長(zhǎng)發(fā)育，甚至導(dǎo)致植株死亡，使小麥生產(chǎn)遭受巨大損失[5]。因此，研究能夠提高小麥抗寒性的技術(shù)手段，以保證植株正常生長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。

殼寡糖[Chitooligosaccharide(COS)]是幾丁質(zhì)脫乙酰基后,經(jīng)酸解或酶解得到的可溶性堿性寡糖[6]，是一種具有植物激發(fā)子效應(yīng)的天然產(chǎn)物，可誘導(dǎo)和提升植物對(duì)病蟲(chóng)害的抗性，因而其應(yīng)用效果和機(jī)制已經(jīng)得到廣泛而深入的研究[7]。殼寡糖不僅可激發(fā)植物應(yīng)對(duì)病蟲(chóng)害的生物脅迫抗性，還可以提高植物的非生物脅迫抗性。研究表明，殼寡糖能夠誘導(dǎo)油菜等作物抗旱，干旱脅迫下噴施殼寡糖后油菜幼苗葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度顯著提高[8]。殼寡糖對(duì)鎘脅迫下的小麥幼苗生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，受到殼寡糖處理的小麥抗氧化酶活性顯著增加[9]。在低溫下殼寡糖處理后水稻幼苗的葉綠素含量和根系活力均顯著提高[10]。本實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，殼寡糖對(duì)低溫脅迫下小麥有一定的保護(hù)作用，可以減少低溫對(duì)小麥產(chǎn)量造成的損失[11]，但殼寡糖的作用機(jī)制尚不明確。本試驗(yàn)檢測(cè)了殼寡糖處理后麥苗在低溫脅迫下的損傷和次生代謝物含量的變化，以期揭示殼寡糖提高小麥低溫抗性的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材 料

供試小麥品種為小偃22和西農(nóng)9871，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。殼寡糖粉劑由中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所制備，用去離子水溶解后殼寡糖水溶液中脫乙酰度> 95%，聚合度為3～10。

1.2處理方法

1.2.1幼苗培養(yǎng)

小麥種子用去離子水浸種8 h后，播種于直徑15 cm、高18 cm的花盆中，盆中裝泥炭土與蛭石3∶1(v/v)的混合介質(zhì)，泥炭土中有機(jī)質(zhì)含量70%±5%，pH 5.0～6.0，胡敏酸含量40%±2%，總氮含量1%～2.5%，總P2O5含量0.3%，總K2O含量0.21%，總 Fe 含量1%～3%，C/N 15～20，C.E.C 80～150 me·100 mg-1(Panda peat，China)，每個(gè)花盆種植15棵麥苗。將麥苗置于氣候室內(nèi)生長(zhǎng)，生長(zhǎng)條件：晝夜溫度22±1 ℃，晝夜時(shí)間16 h/8 h，光照強(qiáng)度400 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度50%。待麥苗出現(xiàn)第4 片真葉(第三片葉全展)時(shí)，用15 mL濃度為100 mg·L-1的殼寡糖水溶液噴施葉片(濃度由之前的預(yù)試驗(yàn)得到)，對(duì)照組噴施等量去離子水。噴施24 h后將殼寡糖和對(duì)照處理的一半小麥幼苗移入到低溫氣候室進(jìn)行低溫脅迫。這樣形成4個(gè)處理組：常溫殼寡糖處理組、常溫對(duì)照組、低溫殼寡糖處理組和低溫對(duì)照組，各處理組重復(fù)3次。

1.2.2低溫脅迫處理

低溫脅迫從22 ℃始，以2 ℃·h-1的速率逐漸降溫至0 ℃。晝夜時(shí)間16 h/8 h，光照強(qiáng)度400 μmol·m-2·s-1。溫度降至0±1 ℃脅迫處理4 d，每2 d取樣一次，取樣時(shí)間為當(dāng)天氣候室內(nèi)進(jìn)入白晝后的第2小時(shí)，樣品液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

消費(fèi)者食品安全意識(shí)淡薄。正是因?yàn)橄M(fèi)者食品安全意識(shí)淡薄，導(dǎo)致食品生產(chǎn)企業(yè)對(duì)食品質(zhì)量安全不夠重視。當(dāng)前，我國(guó)居民大多為中低收入消費(fèi)者，他們的消費(fèi)能力沒(méi)有那么高，并且尚未樹(shù)立正確的食品安全意識(shí)，在部分人的認(rèn)知中，只追求低價(jià)格，輕視了食品的質(zhì)量安全問(wèn)題。

1.3測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 葉片損傷面積的測(cè)定

低溫脅迫48 h后，利用Evans blue法[12]染色4個(gè)處理組，用ImageJ軟件計(jì)量葉片面積與染上顏色的損傷面積。損傷面積比率=染色面積/葉片面積×100%。

1.3.2代謝產(chǎn)物含量的測(cè)定

丙二醛含量采用硫代巴比妥酸反應(yīng)法測(cè)定[13]，脯氨酸含量采用磺基水楊酸比色法測(cè)定[14]，可溶性糖含量采用蒽酮法測(cè)定[15]，還原糖含量用3,5-二硝基水楊酸法[16]。

1.3.3小麥返青率的測(cè)定

幼苗培養(yǎng)與脅迫處理同1.2.1和1.2.2，各處理組分別取50株形態(tài)均一的小麥苗，經(jīng)過(guò)4 d 0±1 ℃低溫脅迫后，放置于4±1 ℃培養(yǎng)室內(nèi)平衡24 h，之后再放入22±1 ℃培養(yǎng)。小麥生長(zhǎng)3 d后調(diào)查其存活的植株數(shù)。

返青率=返青株數(shù)/處理前株數(shù)×100%

數(shù)據(jù)用SPSS Statistics Program 19.0 (IBM,New York,USA)進(jìn)行ANOVA 檢驗(yàn)，利用最小顯著性差異法 (LSD，Least-significant difference)確定不同處理組之間的顯著性差異。

2　結(jié)果與分析

2.1殼寡糖對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗葉片損傷的影響

噴施殼寡糖和低溫脅迫48 h后，與低溫對(duì)照組相比，小麥品種小偃22和西農(nóng)9871的葉片損傷程度分別降低了25.3%和28.8%，說(shuō)明殼寡糖預(yù)處理后小麥的低溫抗性顯著提高。兩個(gè)品種對(duì)低溫均有明顯的反應(yīng)，且存在顯著差異，經(jīng)過(guò)低溫脅迫后，小偃22的葉片損傷程度比西農(nóng)9871低59%(圖1和圖2)。

XY22: 小偃22；XN9871：西農(nóng)9871；CK-NT: 常溫對(duì)照組；CK-LT:低溫對(duì)照組；COS-NT: 常溫殼寡糖處理組；COS-LT:低溫殼寡糖處理組。下同

XY22: Xiaoyan 22; XN9871: Xinong 9871; CK-NT: CK-normal temperature; CK-LT: CK-low temperature; COS-NT: COS-normal temperature; COS-LT: COS-low temperature. The same as below

圖1通過(guò)Evans blue染色法顯示低溫脅迫對(duì)小麥幼苗葉片的損傷

Fig.1Damage area of wheat seedling under low temperature stress detected by Evans blue

圖柱上的字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同

Different letters on the columns indicate the significant differences among the treatments at 0.05 level.The same as below

圖2殼寡糖對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗葉片損傷的影響

Fig.2Effect of COS on damage area of wheat seedling under low temperature stress

2.2殼寡糖對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗葉片丙二醛含量的影響

低溫脅迫后，小偃22和西農(nóng)9871幼苗的丙二醛(MDA)含量均顯著上升(圖3)。低溫脅迫48 h時(shí)兩個(gè)小麥品種殼寡糖處理的MDA含量都顯著低于低溫對(duì)照組， 降幅分別為16.9%和33.7%。而低溫脅迫96 h時(shí)，殼寡糖處理與低溫對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。兩個(gè)小麥品種MDA含量對(duì)低溫脅迫的反應(yīng)有顯著差異，西農(nóng)9871的MDA含量在低溫脅迫后均高于小偃22，而且這種差異無(wú)論經(jīng)殼寡糖處理與否均存在。

2.3殼寡糖對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗葉片脯氨酸含量的影響

在常溫條件下噴施殼寡糖24 h后，小麥品種小偃22和西農(nóng)9871的脯氨酸含量顯著提高，增幅分別為15.8%和26.7%，并且隨后續(xù)的生長(zhǎng)，小麥的脯氨酸含量呈增加的趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)48 h的低溫脅迫，兩個(gè)品種殼寡糖處理的脯氨酸含量均顯著高于低溫對(duì)照組，增幅分別為7.7%和10.1%。經(jīng)過(guò)96 h的低溫脅迫后，殼寡糖處理組和低溫對(duì)照組沒(méi)有顯著的區(qū)別。經(jīng)過(guò)低溫脅迫48 h后，小偃22的脯氨酸含量比西農(nóng)9871高26.1%，說(shuō)明兩個(gè)品種的脯氨酸對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)存在顯著差異(圖4)。

圖3　殼寡糖對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗葉片 丙二醛(MDA)含量的影響Fig.3　Effect of COS on MDA content of wheat seedling under low temperature stress

圖4　殼寡糖對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗 葉片脯氨酸含量的影響Fig.4　Effect of COS on proline of wheat seedling under low temperature stress

2.4殼寡糖對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗葉片可溶性糖含量的影響

經(jīng)殼寡糖處理24 h后，小偃22和西農(nóng)9871的可溶性糖含量都無(wú)顯著性變化(圖5)。低溫脅迫48 h后，兩個(gè)小麥品種的可溶性糖含量較常溫對(duì)照組都顯著增加，增幅分別為25.6%和14.3%，而殼寡糖處理與低溫對(duì)照組相比表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，但沒(méi)有顯著性差異。在低溫脅迫96 h后，麥苗的可溶性糖含量相對(duì)于低溫48 h時(shí)有所降低，殼寡糖處理與低溫對(duì)照組也沒(méi)有顯著性差異。

2.5殼寡糖對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗葉片還原糖含量的影響

經(jīng)殼寡糖處理24 h后，小偃22和西農(nóng)9871的還原糖含量都比常溫對(duì)照組顯著提高，增幅分別為19.2%和14.1%(圖6)。經(jīng)過(guò)低溫脅迫48和96 h后，兩個(gè)品種的還原糖含量表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，但殼寡糖處理組與低溫對(duì)照組相比都沒(méi)有表現(xiàn)出顯著性差異。而小麥品種間還原糖含量的差異比較明顯，小偃22在低溫脅迫48和96 h后比西農(nóng)9871分別高出10.2%和12.5%。此外，常溫下不同處理組間還原糖含量沒(méi)有明顯的差異。

圖5　殼寡糖對(duì)低溫脅迫下小麥 幼苗葉片可溶性糖含量的影響Fig.5　Effect of COS on water soluble(WSS) sugar of wheat seedling under low temperature stress

圖6　殼寡糖對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗 葉片還原糖含量的影響Fig.6　Effect of COS on reducing sugar of wheat seedling under low temperature stress

2.6殼寡糖對(duì)低溫脅迫下麥苗返青率的影響

調(diào)查結(jié)果(圖7)表明，低溫脅迫96 h的麥苗再?gòu)?fù)溫3 d后，雖然兩個(gè)小麥品種都受到了嚴(yán)重的低溫?fù)p傷，但殼寡糖處理的小麥返青率明顯高于低溫對(duì)照組。其中，小偃22的返青率提高了的4.6%，西農(nóng)9871的返青率提高了5.9%。

圖7　殼寡糖對(duì)低溫脅迫下小麥幼苗死亡率的影響Fig.7　Effects of COS on reviving rate of wheat seedling under low temperature stress

3　討 論

殼寡糖作為一種植物激發(fā)子，其作用機(jī)制已經(jīng)得到廣泛研究。本研究結(jié)果表明，殼寡糖有增強(qiáng)小麥抗寒能力的作用。低溫會(huì)直接破壞細(xì)胞膜，造成細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的流失和細(xì)胞膜脂類(lèi)的氧化，利用Evans blue染色和檢測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物MDA，可以顯示葉片細(xì)胞膜受到低溫?fù)p傷的程度[12-13]。本研究中，殼寡糖噴施處理的小麥在經(jīng)過(guò)低溫脅迫后，受到的損傷面積明顯低于沒(méi)有經(jīng)過(guò)殼寡糖處理的低溫對(duì)照組。此外，經(jīng)過(guò)殼寡糖處理的小麥經(jīng)過(guò)低溫脅迫后，生理生化指標(biāo)的變化顯示出低溫抗性得到了增強(qiáng)。脯氨酸和糖含量的增加可以減弱低溫對(duì)植物組織液的冷滯效應(yīng)，保證植物細(xì)胞中溶質(zhì)的流動(dòng)性[17]，同時(shí)脯氨酸合成過(guò)程中產(chǎn)生的NADPH及還原糖可以為細(xì)胞提供還原力[18-19]，降低低溫下產(chǎn)生的氧化自由基的損傷，并對(duì)維持低溫脅迫下光合作用的穩(wěn)定起到重要作用。經(jīng)過(guò)殼寡糖處理后，小麥脯氨酸合成量在低溫脅迫初始階段就顯著提高，說(shuō)明殼寡糖可以促進(jìn)小麥的脯氨酸合成，這為減少后續(xù)到來(lái)的低溫脅迫所造成的損傷提供了預(yù)保護(hù)的作用。這與干旱條件下油菜上殼聚糖的處理效果相一致。在本實(shí)驗(yàn)中，殼寡糖對(duì)低溫脅迫下小麥的可溶性糖含量沒(méi)有顯著的影響，但經(jīng)過(guò)96 h的低溫脅迫后，殼寡糖處理的小麥可溶性糖含量與低溫對(duì)照組相比有增高的趨勢(shì)。先前的研究顯示，殼寡糖對(duì)小麥的葉綠素含量有顯著的影響[9]，這表明殼寡糖可能存在保護(hù)低溫下植物光合作用，進(jìn)而維持植株物質(zhì)代謝的效應(yīng)。殼寡糖處理后的小麥在低溫脅迫發(fā)生前就表現(xiàn)出較高的還原糖含量，這同樣為減少后續(xù)到來(lái)的低溫脅迫所造成的損傷提供了預(yù)保護(hù)的作用。

此外，通過(guò)考察小麥的返青率發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)低溫脅迫并復(fù)溫生長(zhǎng)后，殼寡糖處理的麥苗成活率明顯高于低溫對(duì)照組，這直接表現(xiàn)了殼寡糖對(duì)小麥低溫抗性的提高效應(yīng)。

在試驗(yàn)中，小偃22表現(xiàn)出較強(qiáng)的低溫抗性，其低溫?fù)p傷水平明顯低于西農(nóng)9871，同時(shí)各種有利于提高低溫抗性的次生代謝物含量也高于西農(nóng)9871。經(jīng)過(guò)殼寡糖處理后，西農(nóng)9871的低溫?fù)p傷顯著減少，低溫抗性得到了顯著的提升，這說(shuō)明殼寡糖對(duì)兩個(gè)小麥品種都有明顯增強(qiáng)低溫抗性的效果。

綜上所述，殼寡糖處理后可以減少小麥葉片受到的低溫?fù)p傷，增加植株脯氨酸、還原糖等次生代謝物的含量，提高了小麥經(jīng)受低溫脅迫后的返青率，這些都說(shuō)明殼寡糖可以增強(qiáng)小麥對(duì)低溫脅迫的抵抗能力。在低溫脅迫初始，植物未及啟動(dòng)應(yīng)對(duì)的調(diào)控機(jī)制，此時(shí)的低溫對(duì)植物傷害最嚴(yán)重[20]，而噴施處理后就顯著提高脯氨酸和還原糖含量，說(shuō)明殼寡糖可以為小麥提供預(yù)保護(hù)的作用，以應(yīng)對(duì)即將到來(lái)的低溫脅迫。這種效果為殼寡糖應(yīng)用于早冬寒害和倒春寒提供了良好思路。為了更好地利用殼寡糖對(duì)小麥的低溫保護(hù)作用，其調(diào)控低溫抗性相關(guān)基因的作用機(jī)制、品種的響應(yīng)差異以及小麥不同的生長(zhǎng)階段的作用效果都有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Chitooligosaccharide on Reducing Cryoinjury and Improving Metabolite of Winter Wheat Seedlings under Low Temperature Stress

WANG Mengyu1,2,WANG Wenxia1,ZHAO Xiaoming1,YIN Heng1

(1.Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian,Liaoning 116023,China;2.University of the Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

In order to study the effects of Chitooligosaccharide (COS) on protecting wheat from low temperature stress,two cultivars,Xiaoyan 22 (XY22) and Xinong 9871 (XN9871),were pretreated with 100 mg·L-1COS under 0 ℃ low temperature stress for 96 hours. The area of cold damage,the content of malonaldehyde (MDA),proline,water soluble sugar (WSS),reducing sugar and reviving rate were detected every 48 hours during the study. The results showed that COS decreased the low temperature damage area by 25.3% in XY22 and 28.8% in XN9871,respectively. Meanwhile,COS improved metabolite of the both wheat seedlings under the low temperature stress: the content of MDA was reduced by 16.9% in XY22 and 33.7% in XN9871; proline was increased by 15.8% in XY22 and 26.7% in XN9871; and reducing sugar was increased by 25.6% in XY22 and 14.3% in XN9871,respectively. In addition,the reviving rate raised by 4.6% in XY22 and 5.9% in XN9871,which revealed COS have remarkable effect on protecting wheat from low temperature stress. It is worth noting that the expression level of proline and reducing sugar in wheat seedling significantly accumulated when pretreated with COS in 24 hours before low temperature stress,which implied that COS provide pre-protection for wheat seedlings to the upcoming low temperature stress. The study indicates that COS could reduce cryoinjury and increase the secondary metabolism production of winter wheat seedlings under low temperature stress.

Chitosan oligosaccharides (COS); Wheat; Low temperature stress; Secondary metabolites

時(shí)間：2016-05-10

2015-12-01

2016-01-05

海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201305016-2)；中科院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)項(xiàng)目(2015144)；中國(guó)科學(xué)院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計(jì)劃-山東省主要設(shè)施蔬菜綠色安全種植及保鮮 (技術(shù)集成與示范KFJ-EW-STS-085)

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尹 恒(E-mail：yinhengi@dicp.ac.cn)

S512.1；S311

A

1009-1041(2016)05-0653-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160510.1625.034.html