王榮芳,楊曉博,陳劍橋,李喜悅,崔　同

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000)

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頂空固相微萃取-氣相色譜法測定山楂果膠酯化度

王榮芳,楊曉博,陳劍橋,李喜悅,崔同*

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000)

利用頂空固相微萃取與氣相色譜聯(lián)用(HS-SPME-GC)的方法測定山楂果膠的酯化度(包括甲酯化和乙酯化),對影響檢測結(jié)果的萃取頭種類、萃取溫度、平衡時(shí)間、萃取時(shí)間、鹽離子濃度、解吸溫度、解吸時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,HS-SPME-GC測定山楂果膠酯化度較優(yōu)條件為:5 mL山楂果膠溶液中加48.8%硫酸鈉,在40 ℃下平衡20 min,用75 μm CAR-PDMS萃取頭在40 ℃下萃取30 min,然后在280 ℃的GC進(jìn)樣口解析60 s。該方法線性良好r≥0.9983,檢出限10～15 mg/L,加標(biāo)回收率為95.6%～116.2%。該方法快速、簡便、準(zhǔn)確。

山楂果膠,酯化度,頂空固相微萃取,氣相色譜

山楂(CrataequspinnatifidaBge)屬于薔薇科山楂屬植物,是我國北方地區(qū)重要的栽培水果,其果實(shí)中有豐富的果膠,含量約為鮮重的4%[1]。果膠具有凝膠性、增稠性、乳化性、穩(wěn)定性等功能特性,被廣泛地用于食品、藥品、化妝品領(lǐng)域中。它的這些理化性質(zhì)直接取決于其化學(xué)結(jié)構(gòu),尤其是其α-1,4半乳糖醛酸結(jié)構(gòu)單元的酯化度是影響果膠凝膠特性的主要因素[2-3]。因此,評價(jià)果膠的膠凝特性,必須準(zhǔn)確測定果膠酯化度[4]。測定果膠酯化度的方法可以分為直接測定法和脫酯后測定法,直接測定法主要采用圖譜分析技術(shù),如NMR法[5]、FT-IR法[6-7],這些方法操作簡便但需要精密儀器,而且有時(shí)會受共存雜質(zhì)的干擾。脫酯后測定法是針對果膠皂化反應(yīng)后釋放出的羧基或者甲醇進(jìn)行分析,包括堿液滴定法[8-9]、醇氧化法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]、硼氫化法[12]。頂空固相微萃取(HS-SPME)是一種集采樣,萃取,濃縮和進(jìn)樣于一體的無溶劑樣品微萃取新技術(shù)[13],具有操作時(shí)間短、樣品用量少、儀器設(shè)備簡單,操作快速、便攜,重現(xiàn)性好、精度高、檢測限低等優(yōu)點(diǎn),是一種較理想的氣相色譜(GC)的樣品前處理技術(shù)。

本實(shí)驗(yàn)采取頂空固相微萃取與GC結(jié)合,探索建立一種可以同時(shí)測定山楂果膠甲酯化和乙酯化程度的方法,為山楂果膠改性及其功能評價(jià)提供一種方便、快捷的新方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

山楂品種為大金星,購于河北省保定市果品批發(fā)市場;甲醇(色譜純)Honeywell Burdick & Jackson公司;乙醇(分析純)、NaCl(純度99.5%)、Na2SO4(純度99.5%)天津天力化學(xué)試劑有限公司;純凈水哇哈哈食品飲料有限公司。

6820型氣相色譜儀美國Agilent 公司;SGH-300型高純氫發(fā)生器、SGK-2LB型低噪音空氣泵北京東方精華苑科技有限公司生產(chǎn);固相微萃取裝置Supelco公司生產(chǎn),固相微萃取纖維頭:50/30 μm DVB/CAR/PDMS型、75 μm CAR/PDMS型和100 μm PDMS型;RJ-TDL-40B型離心機(jī)無錫市瑞江分析儀器有限公司;KQ5200DE型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn);FD-1B-50型冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn);HH-2型恒溫水浴鍋國華電器有限公司生產(chǎn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1山楂果膠的制備按照專利方法[14]從山楂果實(shí)中制備得到山楂膳食纖維。參考王娜等[15]的方法從山楂膳食纖維中提取山楂果膠:山楂膳食纖維中加入20倍體積蒸餾水,95 ℃熱水?dāng)嚢杼崛?經(jīng)離心(4000 r/min,3 min),收集上清液,重復(fù)4次上述過程,再將收集的上清液真空濃縮至原體積的1/3,加入2倍體積的95%乙醇沉淀果膠,離心(4000 r/min,3 min)得到果膠沉淀,加2倍體積的丙酮洗果膠沉淀,再加入2倍體積的蒸餾水溶解果膠沉淀,真空濃縮至原來的1/3,最后將濃縮的果膠溶液冷凍干燥,得到薄片狀固體山楂果膠,置于干燥器中備用。

1.2.2萃取頭的處理萃取頭每次使用前均進(jìn)行活化。將萃取頭Hub端接入手柄后插入GC進(jìn)樣口進(jìn)行活化,活化條件分別為:50/30 μm DVB/CAR/PDMS為270 ℃,1 h;75 μm CAR/PDMS為300 ℃,1 h;100 μm PDMS為250 ℃,0.5 h。同時(shí)監(jiān)測系統(tǒng)壓力,防止漏氣。

1.2.3樣品前處理準(zhǔn)確稱取0.200 g冷凍干燥的山楂果膠,加入20 mL純凈水,使之完全溶解,用1 mL 1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至13,室溫下皂化30 min,再用1 mL 1 mol/L HCl溶液調(diào)果膠溶液pH至7。

1.2.4頂空固相微萃取條件取皂化的果膠溶液注入含有Na2SO4的頂空瓶中,隔墊密封,在60 ℃下超聲30 min使Na2SO4溶解,取出后渦旋混勻,在水浴中平衡一定時(shí)間,將SPME萃取頭插入頂空瓶中萃取一定時(shí)間,立即將萃取頭在GC進(jìn)樣口解析,進(jìn)行GC分析。每份樣品重復(fù)3次。

1.2.5單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1萃取頭種類的選擇在平衡時(shí)間為20 min,萃取溫度為40 ℃,萃取時(shí)間為30 min,添加48.8% Na2SO4,解吸時(shí)間為60 s,解吸溫度為280 ℃時(shí),考察了50/30 μm DVB/CAR/PDMS、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS 3種萃取頭的萃取對萃取效果的影響。

1.2.5.2萃取溫度對萃取效果的影響當(dāng)果膠溶液中的甲醇和乙醇在氣-液兩相達(dá)到平衡時(shí),它們在氣相中濃度的高低受很多因素的影響,而萃取的溫度是一個(gè)很重要的因素。本實(shí)驗(yàn)在使用75 μm CAR/PDMS萃取頭,平衡時(shí)間為20 min,萃取時(shí)間為30 min,添加48.8% Na2SO4,解吸時(shí)間為60 s,解吸溫度為280 ℃時(shí),考察了不同萃取溫度(30、40、50、60、70 ℃)對HS-SPME-GC萃取效果的影響。

1.2.5.3平衡時(shí)間對萃取效果的影響在一定的溫度下,被分析組分在氣-液兩相達(dá)到平衡需要一定時(shí)間,本實(shí)驗(yàn)在使用75 μm CAR/PDMS萃取頭,萃取溫度為40 ℃,萃取時(shí)間為30 min,添加48.8% Na2SO4,解吸時(shí)間為60 s,解吸溫度為280 ℃時(shí),比較了不同平衡時(shí)間(10、20、30、40、50 min)對HS-SPME-GC萃取效果的影響。

1.2.5.4萃取時(shí)間對萃取效果的影響萃取時(shí)間即從萃取頭進(jìn)入頂空瓶到萃取達(dá)到平衡的時(shí)間。這個(gè)時(shí)間由被分析組分的分配系數(shù)、物質(zhì)的擴(kuò)散速率、萃取頭的吸附能力等因素決定。本實(shí)驗(yàn)在使用75 μm CAR/PDMS萃取頭,萃取溫度為40 ℃,平衡時(shí)間為20 min,48.8% Na2SO4,解吸時(shí)間為60 s,解吸溫度為280 ℃時(shí),比較了不同萃取時(shí)間(5、10、20、30、40 min)對HS-SPME-GC萃取效果的影響。

1.2.5.5鹽濃度對萃取效果的影響溶液中添加電解質(zhì),可增強(qiáng)溶液的離子強(qiáng)度,可以降低其在水中的溶解度,有利于促進(jìn)目標(biāo)成分揮發(fā)到氣相中而增加分析的靈敏度。當(dāng)使用75 μm CAR/PDMS萃取頭,萃取溫度為40 ℃,平衡時(shí)間為20 min,萃取時(shí)間為30 min,解吸時(shí)間為60 s,解吸溫度為280 ℃時(shí),比較了不同添加量的NaCl、Na2SO4對HS-SPME-GC固相萃取效果的影響。

1.2.5.6解吸溫度對萃取效果的影響GC進(jìn)樣口的溫度即為解吸溫度,溫度過低解吸不完全或造成二次進(jìn)樣;溫度過高會對SPME萃取頭涂層損害較大。而甲醇、乙醇都屬于易揮發(fā)性化合物,溫度不需要過高,因而,在使用75 μm CAR/PDMS萃取頭,萃取溫度為40 ℃,平衡時(shí)間為20 min,萃取時(shí)間為30 min,添加48.8% Na2SO4,解吸時(shí)間為60 s時(shí),比較了不同解吸溫度(240、250、260、270、280、290、300 ℃)對HS-SPME-GC固相萃取效果的影響。

1.2.5.7解吸時(shí)間對萃取效果的影響解吸時(shí)間與待分析組分的解吸完全程度直接相關(guān)。在使用75 μm CAR/PDMS萃取頭,萃取溫度為40 ℃,平衡時(shí)間為20 min,萃取時(shí)間為30 min,添加48.8% Na2SO4,解吸溫度為280 ℃條件下,考察不同解吸時(shí)間(30、60、90、120 s)對解吸效果的影響

1.2.6色譜條件色譜柱:毛細(xì)管柱TG-WAXMS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);檢測器:氫火焰離子化檢測器;載氣:高純氮,流速1 mL/min,分流比為1∶50。氣化室溫度:280 ℃;檢測器:300 ℃;升溫程序:35 ℃保持6 min,以20 ℃/min升至80 ℃;再以50 ℃/min升至230 ℃保持10 min。

1.2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線制作精確稱取400 mg甲醇和100 mg乙醇,加水定容至100 mL,配制成4000 mg/L甲醇和1000 mg/L乙醇標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。貯備液密封保存,甲醇、乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液均由儲備液稀釋得到。

用甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋得到濃度分別為2000、1000、400、200、100、20 mg/L的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,乙醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋得到濃度分別為500、250、100、50、25、5 mg/L的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照1.2.4步驟頂空萃取,按照1.2.6色譜條件進(jìn)行測定。分別以甲醇、乙醇標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)(X,mg/L),以甲醇、乙醇峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求回歸方程。

1.3數(shù)據(jù)處理

使用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1頂空固相微萃取條件的優(yōu)化

2.1.1萃取頭種類的選擇從50/30 μm DVB/CAR/PDMS、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS 3種萃取頭的萃取結(jié)果分析表明,這3種萃取頭對甲醇、乙醇均有一定程度的萃取效果。其中,100 μm PDMS的萃取效果最差,得到甲醇、乙醇的峰面積均很小;50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取得到的雜峰較多,在甲醇出峰位置有雜峰干擾;而75 μm CAR/PDMS萃取效果最佳,且雜峰較少,因此,選擇萃取頭75 μm CAR/PDMS。

2.1.2萃取溫度對萃取效果的影響結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出,當(dāng)萃取溫度為40 ℃時(shí),甲醇和乙醇的萃取量均達(dá)到最大,再繼續(xù)升高溫度時(shí)它們的萃取效果沒有明顯的變化。因此,選擇萃取溫度為40 ℃。

圖1　萃取溫度對萃取效果的影響Fig.1　Effect of extraction temperature on the extraction rate

2.1.3平衡時(shí)間對萃取效果的影響從圖2可以看出,當(dāng)平衡時(shí)間少于20 min,萃取量增加,當(dāng)平衡時(shí)間為20 min時(shí),果膠溶液中甲醇和乙醇的萃取量達(dá)到最大。因此,選擇平衡時(shí)間為20 min。

圖2　平衡時(shí)間對萃取效果的影響Fig.2　Effect of balance time on the extraction rate

2.1.4萃取時(shí)間對萃取效果的影響從圖3可以看出,當(dāng)萃取時(shí)間小于30 min時(shí),甲醇和乙醇的萃取量都在增加,但是乙醇增加量大于甲醇;當(dāng)萃取時(shí)間為30 min時(shí),兩者的萃取量最大。因此,選擇萃取時(shí)間為30 min。

圖3　萃取時(shí)間對萃取效果的影響Fig.3　Effect of extraction time on the extraction rate

2.1.5鹽離子濃度對萃取效果的影響從圖4可以看出,雖然NaCl也有促進(jìn)目標(biāo)成分揮發(fā)的效果,但作用強(qiáng)度不及Na2SO4,當(dāng)Na2SO4添加量達(dá)到飽和(48.8%)時(shí),兩者萃取量均達(dá)到最大。因此選擇48.8% Na2SO4。

圖4　鹽濃度對萃取效果的影響Fig.4　Effect of salt concentration on the extraction rate

2.1.6解吸溫度對萃取效果的影響結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出,當(dāng)溫度為280 ℃,甲醇、乙醇均完全解吸,因此,選擇解吸溫度為280 ℃。

圖5　解吸溫度對萃取效果的影響Fig.5　Effect of desorption temperature on the extraction rate

2.1.7解吸時(shí)間對萃取效果的影響從圖6可以看出,當(dāng)時(shí)間為60 s時(shí),甲醇、乙醇峰面積達(dá)到最大值,延長解吸時(shí)間峰面積不再增加,因此,選擇解吸時(shí)間為60 s。

圖6　解吸時(shí)間對萃取效果的影響Fig.6　Effect of desorption time on the extraction rate

2.2方法評價(jià)

2.2.1方法的精密度按照優(yōu)化的固相微萃取條件進(jìn)行萃取后,按1.2.6的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣分析(n=5),以評價(jià)檢測儀器的精密度。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

表1　甲醇、乙醇的精密度分析(n=5)

2.2.2方法的回歸方程、線性范圍、最低檢出限按照1.2.7配制標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線,按照1.2.6的色譜條件進(jìn)行分析,以進(jìn)樣濃度為自變量(X,mg/L),峰面積為因變量(Y),分別求出甲醇、乙醇的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。最低檢出限以3倍信噪比(S/N)所對應(yīng)的進(jìn)樣濃度求得,結(jié)果見表2。

表2　對照品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及最低檢出限

2.2.3方法的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)以評價(jià)檢測方法的準(zhǔn)確度。分別稱取已知質(zhì)量的對照品分別按其在山楂果膠中常規(guī)含量水平加入山楂果膠樣品中,按照1.2.3所述樣品前處理,平行5份;按照優(yōu)化的固相微萃取條件進(jìn)行萃取后,按1.2.6色譜條件分別測定未加標(biāo)和加標(biāo)樣品,計(jì)算組分的加標(biāo)回收率,結(jié)果見表3。

表3　甲醇、乙醇的回收率

2.2.4實(shí)際樣品分析按1.2.3所述方法重復(fù)進(jìn)行山楂果膠樣品前處理(n=3),按照優(yōu)化的固相微萃取條件進(jìn)行萃取,按1.2.6的色譜條件進(jìn)行含量分析,對照品和樣品色譜圖如圖7所示,酯化度分析結(jié)果見表4。

圖7　混合對照品(A)和山楂果膠樣品(B)的GC色譜圖Fig.7　GC chromatograms of references(A)and hawthorn pectin sample(B)注:1:甲醇,2:乙醇。

類型酯化度(%)甲酯化56.13±1.35乙酯化1.76±1.41

從圖7中可以看出,甲醇和乙醇達(dá)到很好的分離。而表4的結(jié)果表明,山楂果膠樣品的總酯化度(包括甲酯化和乙酯化)達(dá)到57.89%,屬于一種高甲氧基果膠,而其中的乙酯化度相對較低,僅有1.76%。

3　結(jié)論

通過對頂空固相微萃取條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了一種HS-SPME-GC測定山楂果膠甲酯化和乙酯化的方法,較優(yōu)條件為:75 μm CAR-PDMS萃取頭,萃取溫度40 ℃,平衡時(shí)間20 min,萃取時(shí)間30 min,加48.8%硫酸鈉,進(jìn)樣解吸溫度280 ℃,解吸時(shí)間60 s。方法操作簡單,測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可為相關(guān)研究提供了新的檢測方法。

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Determination of the esterification degree of hawthorn pectin by headspace solid-phase microexrtaction and gas chromatography

WANG Rong-fang,YANG Xiao-bo,CHEN Jian-qiao,LI Xi-yue,CUI Tong*

(College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China)

Headspace solid-phase microextraction and gas chromatography(HS-SPME-GC)were used for the qualitative determination of the esterification degree(methyl esterification and ethyl esterification)of haw pectin samples. HS-SPME experimental conditions,such as the type of fibers,extraction temperature,balance time,extraction time,salt concentrations,desorption temperature,desorption time were optimized. The best HS-SPME-GC performance was achieved under the following conditions:5 mL pectin solution in headspace glass vial with addition of 48.8% Na2SO4,20 min balance time and 30 min extraction time at 40 ℃ using 75 μm CAR-PDMS fiber and 60 s desorption time in the GC inlet at 280 ℃. The correlation coefficient r was greater than 0.9983,the detection limits of the method were 10～15 mg/L,the recovery rates were 95.6%～116.2%. The proposed method is simple,fast and accurate with high reproducibility.

hawthorn pectin;esterification degree;headspace solid-phase microextraction;gas chromatography

2016-01-15

王榮芳(1989-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程，E-mail：15131220593@163.com。

崔同(1956-)，男，教授，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分分析，E-mail：cuitong98@aliyun.com。

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(C2015204187)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)16-0056-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.002