臧順平,呂云輝,苗文凱,陳　浩,劉國一,陳立鋼

(東北林業(yè)大學(xué)理學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

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介孔分子印跡聚合物分離分析奶粉中的三聚氰胺

臧順平,呂云輝,苗文凱,陳浩,劉國一,陳立鋼*

(東北林業(yè)大學(xué)理學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

以滅蠅胺為虛擬模板分子,采用溶膠凝膠技術(shù)制備滅蠅胺介孔分子印跡聚合物(MIP)。將MIP作為固相萃取吸附劑,與高效液相色譜聯(lián)用檢測奶粉樣品中的三聚氰胺。對該聚合物進行了吸附等溫線測定以及Scatchard分析,結(jié)果表明分子印跡聚合物對三聚氰胺有兩種結(jié)合方式。計算得到的最大表觀結(jié)合量(Qmax)和平衡解離常數(shù)(Kd)分別為:Qmax1=14.96 mg/g,Kd1=1.85 mg/L;Qmax2=26.16 mg/g,Kd2=27.03 mg/L。最后應(yīng)用合成的MIP對2 g奶粉樣品提取液中痕量三聚氰胺進行凈化和富集,回收率為94.73%～98.56%,相對標準偏差RSD為3.2%,檢出限為0.015 μg/g。此方法快速、選擇性高,為三聚氰胺的殘留分析開辟了一條新途徑。

介孔,分子印跡聚合物,三聚氰胺,奶粉

三聚氰胺(Melamine)是一種低毒的化工原料。然而它卻被不法商人摻雜進食品,如奶粉、冰激凌中,以提升食品檢測中的蛋白質(zhì)含量指標。其進入體內(nèi)后不能被代謝,一部分從尿液中原樣排出,但是由于個人體質(zhì)不同,有些則會在身體內(nèi)產(chǎn)生與氰脲酸結(jié)合的晶體狀聚合物,而引起腎結(jié)石、膀胱結(jié)石等病癥[1-2]。傳統(tǒng)檢測三聚氰胺的方法是在奶粉樣品中加入三氯乙酸和醋酸鉛溶液使蛋白質(zhì)沉淀,過混合型陽離子交換柱(MCX)純化后,經(jīng)高效液相色譜分析測定[3],但陽離子交換樹脂通過靜電引力與三聚氰胺結(jié)合,選擇性相對較差,萃取率低。即樣品中只要能與樹脂產(chǎn)生靜電引力的物質(zhì)均可以與其結(jié)合,與三聚氰胺的吸附產(chǎn)生競爭。

近年來,分子印跡作為一門新興技術(shù)得到迅速發(fā)展。分子印跡聚合物是具有特定功能基團以及孔穴大小和形狀的高分子材料,具有穩(wěn)定性好,耐高溫、高壓和酸堿的優(yōu)點[4-5]。目前,已有文獻報道[6-8]采用分子印跡技術(shù)分離分析三聚氰胺。然而,大多采用本體聚合法來制備分子印跡聚合物[6-7],制得粒子不規(guī)則,費時費力,產(chǎn)量低,且印跡位點會包埋在聚合物內(nèi)部,難以洗脫模板分子,傳質(zhì)阻力較大[9]。此外,當(dāng)直接采用三聚氰胺作為模板分子制備聚合物時,由于模板分子洗脫不干凈,聚合物在應(yīng)用過程中會造成模板滲漏,從而使檢測結(jié)果不準確。

介孔材料是指孔徑介于2～50 nm的一類多孔材料。該材料具有極高的比表面積、規(guī)則有序的孔道結(jié)構(gòu)、狹窄的孔徑分布、孔徑大小連續(xù)可調(diào)等特點[10]。若能將分子印跡和介孔兩種技術(shù)結(jié)合起來便可以兼得兩者的優(yōu)點。Lv[11]和Cheng[12]制備得到了介孔分子印跡聚合物(MIP),并分別將其應(yīng)用于洛美沙星和雙酚A的吸附分離。然而,至今尚沒有將該技術(shù)應(yīng)用于食品中三聚氰胺分離分析的研究。

本實驗采用溶膠凝膠技術(shù)以三聚氰胺的結(jié)構(gòu)相似物滅蠅胺為虛擬模板分子,十六烷基三甲基溴化銨為模板導(dǎo)向劑,正硅酸四乙酯為交聯(lián)劑,3-氨丙基三乙氧基硅烷為功能單體來制備聚合物,該聚合物應(yīng)用于分離分析奶粉樣品中的三聚氰胺。實驗方法具有分析快速、選擇性高、處理樣品和提取操作快速簡便等優(yōu)點。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

三聚氰胺(CAS號:108-78-1,純度99%)、滅蠅胺(CAS號:66215-27-8,純度98%)、莠去津(CAS號:1912-24-9,純度97%)、十六烷基三甲基溴化銨(CAS號:57-09-0,純度99%)上海阿拉丁;氫氧化鈉、鹽酸磷酸二氫鉀、正硅酸四乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅氧烷、甲醇、無水乙醇、乙腈、乙酸均為分析純,天津科密歐;乙腈色譜純,美國Fisher;實驗用水為去離子水;奶粉購于哈爾濱當(dāng)?shù)爻小?/p>

LC-15C高效液相色譜儀日本島津;ZORBAX 300-SCX離子交換色譜柱美國Agilent;TU-1800紫外分光光度計北京普析通用;FT-IR360傅里葉紅外光譜儀美國Nicolet;TG16-WS臺式高速離心機湖南湘儀;KQ-400KDE超聲波清洗器昆山市超聲儀器;DZF-6050真空干燥箱上海齊欣;pHS-3C pH計上海儀電;DFD-700恒溫水浴鍋上海樹立。

1.2實驗方法

1.2.1介孔分子印跡聚合物的制備將2.5 mmol滅蠅胺和1.8 g十六烷基三甲基溴化銨溶解在120 mL水中,再加入2.9 mL 3-氨丙基三乙氧基硅氧烷,11 mL正硅酸四乙酯攪拌30 min,再加入3.5 mL 2 mol/L的氫氧化鈉溶液常溫反應(yīng)24 h,抽濾,干燥,合成聚合物。將該聚合物分別經(jīng)過2 mol/L鹽酸-乙醇溶液回流48 h,用以除去十六烷基三甲基溴化銨,水洗、乙醇洗至中性。再用甲醇-乙酸(8/2,V/V)溶液索氏提取聚合物48 h,用以除去模板分子滅蠅胺。真空干燥后,即得到實驗所需的介孔分子印跡聚合物(MIP)。

同時制備介孔非分子印跡聚合物(NIP),操作步驟與上述相同,不加入模版分子滅蠅胺。

1.2.2靜態(tài)吸附等溫實驗將MIP 20.0 mg置于干凈試管中,加入2.5 mL濃度分別為1、5、10、50、100、200、400、500 mg/L的三聚氰胺溶液,振蕩吸附12 h,離心分離,濾膜過濾,用高效液相色譜檢測溶液中三聚氰胺的剩余濃度。

根據(jù)公式:Q=(Ci-Cf)V/m結(jié)合前后溶液中底物的濃度變化計算出吸附到聚合物上三聚氰胺的量(Q)。其中Ci(mg/L)為三聚氰胺的初始濃度;Cf(mg/L)為三聚氰胺的平衡濃度;V(mL)為吸附溶液的體積;m為聚合物的質(zhì)量(mg)。

采用Scatchard分析進一步討論聚合物的吸附情況,其擬合方程為:Q/Cf=(Qmax-Q)/Kd

其中,Q(mg/g)為聚合物對三聚氰胺的吸附量;Cf(mg/L)為三聚氰胺的平衡濃度;Qmax(mg/g)為最大表觀結(jié)合量;Kd(mg/L)為結(jié)合位點的平衡離解常數(shù)。

1.2.3選擇性吸附研究應(yīng)用三聚氰胺及莠去津和滅蠅胺考察介孔分子印跡聚合物的特異性選擇能力。分別將20 mg MIP加入到 2.5 mL、50 μg/mL的三聚氰胺、滅蠅胺、莠去津溶液中,振蕩吸附12 h,然后采用紫外分光光度計測定吸附后的剩余溶液,從而計算聚合物對這些物質(zhì)的吸附率。

1.2.4介孔分子印跡聚合物萃取分離奶粉中的三聚氰胺固相萃取柱的制備:2.5 mL注射器底端用脫脂棉作為篩板,防止分子印跡聚合物顆粒的流失。取50 mg介孔分子印跡聚合物,以蒸餾水為勻漿液,進行濕法裝柱,然后氮氣吹干,制得固相萃取小柱。

向2 g奶粉中加入6 mL丙酮,超聲振蕩5 min。然后以7000 r/min離心10 min。將離心后的上清液加入到固相萃取小柱,以1 mL/min過柱。然后用2 mL 5%(V/V)氨水-甲醇洗脫。收集洗脫液,氮吹濃縮至干,用色譜流動相定容至0.5 mL,待液相色譜檢測。

對實驗的條件如萃取劑和洗脫液進行了優(yōu)化。分別采用丙酮、乙腈和水做萃取劑來萃取奶粉中的三聚氰胺,以及分別采用甲醇、5%氨水-甲醇(V/V)、5%乙酸-甲醇(V/V)作為洗脫液對介孔分子印跡聚合物上的三聚氰胺進行脫附。以三聚氰胺回收率的高低評價不同條件的優(yōu)劣?；厥章释ㄟ^下式計算:

回收率(%)=樣品中三聚氰胺加標之后的總濃度-樣品中三聚氰胺的初始濃度/三聚氰胺加標的濃度×100

1.2.5色譜條件色譜柱為ZORBAX 300-SCX(4.6 mm×250 mm,5 μm)離子交換色譜柱;流動相為磷酸鹽緩沖溶液(10 mmol/L,pH=3.0)∶乙腈(7/3,V/V);流速為1.3 mL/min;進樣體積為20 μL;檢測波長為240 nm。

2　結(jié)果與討論

2.1介孔分子印跡聚合物的表征

用KBr壓片法,測定介孔分子印跡聚合物在紅外區(qū)4000～500 cm-1下的吸收譜帶,紅外光譜圖如圖1所示,3400 cm-1是O-H的伸縮振動吸收峰;1070 cm-1是Si-O的伸縮振動吸收峰;1620 cm-1是C=O伸縮振動吸收峰。

圖1　介孔分子印跡聚合物紅外光譜圖Fig.1　The infrared spectrogram of mesoporous molecular imprinting polymers

圖2　MIP和NIP對三聚氰胺的吸附等溫線Fig.2　The adsorption isotherm of melamine of MIP and NIP

2.2吸附等溫線的測定和Scatchard分析

由圖2所示,隨著三聚氰胺濃度的增加,聚合物對三聚氰胺的吸附量也變大,MIP對三聚氰胺的吸附效果大于NIP。

以Q/Cf對Q作圖,由圖3可知,對于MIP,Q/Cf與Q間存在非線性關(guān)系,說明MIP對三聚氰胺的吸附是非均一的,在測定的濃度范圍內(nèi),聚合物存在兩種結(jié)合位點。由兩條擬合直線的截距和斜率求得:

Qmax1=14.96 mg/g,Kd1=1.85 mg/L;

Qmax2=26.16 mg/g,Kd2=27.03 mg/L。

圖3　MIP吸附三聚氰胺的Scatchard分析Fig.3　Scatchard plot analysis of the binding of melamine onto the MIP

由圖4可知,對于NIP,Q/Cf與Q間存在線性關(guān)系,NIP對三聚氰胺的吸附是均一的,在測定的濃度范圍內(nèi),聚合物存在一個結(jié)合位點。由兩條擬合直線的截距和斜率求得:

Qmax=16.32 mg/g,Kd=84.03 mg/L。

圖4　NIP吸附三聚氰胺的Scatchard分析Fig.4　Scatchard plot analysis of the binding of melamine onto the NIP

在已有的研究成果中,以三聚氰胺為模板分子采用沉淀聚合法[13]和本體聚合法[14]制備分子印跡聚合物對三聚氰胺的吸附最大表觀結(jié)合量為22.71 mg/g和6.88 mg/g,而本實驗合成的介孔分子印跡聚合物,由于介孔大的比表面積和孔道結(jié)構(gòu)使得對三聚氰胺吸附的總的最大表觀結(jié)合量為41.12 mg/g,吸附效果更好。

2.3選擇性吸附研究

考察介孔分子印跡聚合物對滅蠅胺、三聚氰胺和莠去津(圖5)的吸附情況。由圖6可知,實驗制備的介孔分子印跡聚合物對滅蠅胺和三聚氰胺的吸附作用明顯大于非分子印跡聚合物,說明MIP對這兩種物質(zhì)均有良好的選擇性吸附。然而,合成的MIP和NIP對于莠去津的吸附則相差較小。這主要是因為三聚氰胺與滅蠅胺的結(jié)構(gòu)相對于莠去津而言更為相似。因此選擇滅蠅胺作為虛擬模板分子制備分子印跡聚合物用來分離三聚氰胺是可行的。

圖5　三聚氰胺(a)、滅蠅胺(b)、莠去津(c)的分子結(jié)構(gòu)式Fig.5　The molecular structures of melamine(a),cyromazine(b)and atrazine(c)

圖6　選擇性吸附測試Fig.6　The selectivity absorbing test

2.4萃取實驗條件的優(yōu)化

分別用丙酮、乙腈和水做萃取劑來萃取奶粉中的三聚氰胺。萃取劑的選擇結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示,丙酮的效果最好。此外,在丙酮介質(zhì)中,三聚氰胺可以很好的保留在所合成的介孔分子印跡聚合物上,奶粉萃取完成后,離心得到的萃取液可以直接通過聚合物小柱。而且在此條件下,樣品溶液在上樣時,沒有更多的干擾物質(zhì)被保留,所以分子印跡聚合物萃取環(huán)節(jié),可以省略淋洗步驟,上樣后直接用洗脫液進行洗脫即可。

圖7　三聚氰胺萃取劑的選擇Fig.7　The selection of extraction solvent for melamine

分別采用2 mL的甲醇、5%氨水-甲醇(V/V)、5%乙酸-甲醇(V/V)作為洗脫液對介孔分子印跡聚合物上的三聚氰胺進行脫附實驗洗脫液的選擇結(jié)果如圖8所示。結(jié)果顯示5%氨水-甲醇(V/V)的脫附效果較好,回收率高達98.56%。

圖8　三聚氰胺洗脫液的選擇Fig.8　The selection elution solution for melamine

2.5分析方法評價與應(yīng)用

采用高效液相色譜檢測三聚氰胺,得到的檢測奶粉中三聚氰胺的回歸方程為A=115813.5c+773.7(A為峰面積,c為三聚氰胺濃度),R2=0.9999,線性范圍為0.025～25 μg/g,檢出限為0.015 μg/g。奶粉中加標三聚氰胺的色譜圖如圖9所示。此外,根據(jù)衛(wèi)生部等5部門2011年第10號公告,三聚氰胺在嬰幼兒配方食品中的限量值為1.0 mg/kg,其他食品中三聚氰胺的限量值為2.5 mg/kg[15],因此,本實驗方法滿足三聚氰胺檢測的需求。從哈爾濱當(dāng)?shù)爻匈徺I三種奶粉應(yīng)用本實驗方法對三聚氰胺進行檢測,沒有發(fā)現(xiàn)三聚氰胺的存在。隨后對奶粉樣品進行了三聚氰胺的加標回收實驗,得到的回收率在94.73%～98.56%,相對標準偏差RSD為3.2%,本實驗檢測方法在分離三聚氰胺方面具有一定的應(yīng)用價值。

圖9　奶粉加標三聚氰胺(0. 25 μg/g)的液相色譜圖Fig.9　Chromatogram of melamine(0. 25 μg/g)in milk powder

3　結(jié)論

本實驗以滅蠅胺為虛擬模板分子,采用溶膠凝膠技術(shù)制備介孔分子印跡聚合物,對其進行了吸附等溫線的測定、Scatchard分析及選擇性分析,結(jié)果顯示對三聚氰胺具有較好的吸附效果。并且由于該聚合物具有介孔結(jié)構(gòu),因而比表面積大,對三聚氰胺吸附量比傳統(tǒng)的分子印跡聚合物高。將實驗制得的介孔分子印跡聚合物應(yīng)用于固相萃取劑萃取分離奶粉中的三聚氰胺,得到了理想的回收率。本實驗方法減少了奶粉樣品的預(yù)處理的步驟,分析速度快,準確度高。

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Separation and analysis of melamine in milk powder by mesoporous molecular imprinted polymers

ZANG Shun-ping,LV Yun-hui,MIAO Wen-kai,CHEN Hao,LIU Guo-yi,CHEN Li-gang*

(College of Science,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China)

Mesoporous molecular imprinted polymers(MIP)was prepared by Sol-Gel technique using cyromazine as virtual template molecule. The MIPs used as solid phase extraction adsorbents were coupled with high performance liquid chromatography(HPLC)to detect melamine in milk powder samples. The results of isothermal absorption experiment and Scatchard analysis showed that there were two kinds of binding sites. By calculating,the values of the apparent maximum absorption capacity Qmaxand the dissociation constant Kdwere as follows:Qmax1=14.96 mg/g,Kd1=1.85 mg/L,Qmax2=26.16 mg/g,Kd2=27.03 mg/L. The melamine in 2 g milk powder samples was purified and enriched by MIP. The recovery of melamine was between 94.73% and 98.56%,relative standard deviation(RSD)was 3.2%,and the detection limit was 0.015 μg/g. This method was rapid and high selectivity,and provided a new way to analyzing residue melamine.

mesoporous;molecularly imprinted polymers;melamine;milk powder

2016-01-18

臧順平(1996-)，男，本科，研究方向：食品安全分析，E-mail：1935402009@qq.com。

陳立鋼(1982-)，男，博士，副教授，研究方向：食品安全分析，E-mail：ligangchen2008@163.com。

黑龍江省青年科學(xué)基金(QC2014C005)；東北林業(yè)大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目(20150225036)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)16-0067-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.004