張晶晶，康天放，李娜娜，魯理平，程水源

(北京工業(yè)大學(xué)　區(qū)域大氣復(fù)合污染防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境與能源工程學(xué)院，北京　100124)

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基于HDT自組裝金納米粒子修飾電極的微囊藻毒素-LR電化學(xué)免疫傳感器研究

張晶晶，康天放*，李娜娜，魯理平，程水源

(北京工業(yè)大學(xué)區(qū)域大氣復(fù)合污染防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境與能源工程學(xué)院，北京100124)

構(gòu)建了一種新型的基于金納米粒子(AuNPs)修飾金電極的微囊藻毒素-亮氨酸-精氨酸(MCLR)電化學(xué)免疫傳感器。采用檸檬酸鈉還原法制備了AuNPs溶膠，分別用透射電子顯微鏡和紫外-可見吸收光譜對其進(jìn)行表征。將AuNPs組裝到1，6-己二硫醇(HDT)自組裝單分子層修飾的金電極表面，再將MCLR抗體(anti-MCLR)固定于該修飾電極上，利用掃描探針顯微鏡法、循環(huán)伏安法和電化學(xué)交流阻抗法(EIS)表征了自制化學(xué)修飾電極表面的形貌特征和電化學(xué)免疫傳感器的電化學(xué)特征。通過辣根過氧化物酶標(biāo)記的MCLR(MCLR-HRP)與MCLR競爭結(jié)合抗體，建立了檢測MCLR的差分脈沖伏安法(DPV)。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，用DPV對MCLR檢測的線性范圍為0.01～25 μg/L，檢出限為0.005 μg/L。對構(gòu)建的免疫傳感器的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性進(jìn)行了考察。該方法對實(shí)際水樣中MCLR的加標(biāo)回收率為100%～102%，測定結(jié)果與高效液相色譜法的測定結(jié)果一致。

微囊藻毒素；金納米粒子；自組裝；免疫傳感器

近年來，世界范圍內(nèi)由于微囊藻毒素引起的湖泊、水庫等飲用水源的水體污染事件頻發(fā)，已嚴(yán)重威脅到人類飲用水安全[1-2]。藍(lán)藻水華釋放出的藻毒素中微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是出現(xiàn)頻率最高、毒性最強(qiáng)的亞型[3-4]，可引起皮膚刺激、過敏反應(yīng)、肌肉和關(guān)節(jié)痛等癥狀[5]，其毒性主要表現(xiàn)為強(qiáng)烈抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A的活性，導(dǎo)致肝腎損傷、腫瘤生成等[2]。目前已發(fā)現(xiàn)MCs有近90種同分異構(gòu)體[4，6-7]，其中微囊藻毒素-亮氨酸-精氨酸(MCLR)是最常見、毒性最強(qiáng)的微囊藻毒素[4，8-9]，為保障飲用水安全，世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的《飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則》中規(guī)定MCLR限值為1 μg/L[10]。目前檢測MCLR的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[7-8]、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[3]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[1，11]，這些方法雖靈敏度高、穩(wěn)定性好，但操作周期長，設(shè)備昂貴，對技術(shù)人員要求較高[1]。而生物測試法[12]和酶聯(lián)免疫法[13-15]因耗時、靈敏度低而應(yīng)用受限。電化學(xué)免疫傳感器因具有靈敏度高、特異性好、操作簡便[14]等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用[3，16-20]。金納米粒子(AuNPs)則因比表面積大、吸附能力強(qiáng)、導(dǎo)電性和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)[21-22]，被廣泛應(yīng)用于生物傳感器和化學(xué)傳感器中[23-24]。本研究用1，6-己二硫醇(HDT)兩端的巰基分別與金電極(GE)和AuNPs相連接，將AuNPs自組裝到金電極表面，利用AuNPs固定微囊藻毒素抗體(anti-MCLR)，用牛血清白蛋白(BSA)封閉非特異性吸附位點(diǎn)，構(gòu)建了一種新型的微囊藻毒素免疫傳感器。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

CHI 660a電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，實(shí)驗(yàn)采用三電極系統(tǒng)：金電極(Φ=2 mm)為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。2450型紫外-可見吸收光譜儀(島津公司)；SPM-9600型掃描電子顯微鏡(島津公司)；HT-7700型掃描探針顯微鏡(日本日立公司)；1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)。

微囊藻毒素單克隆抗體、微囊藻毒素-亮氨酸-精氨酸 、微囊藻毒素-精氨酸-精氨酸(MC-RR)、微囊藻毒素-酪氨酸-精氨酸(MC-YR)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的MC-LR(MCLR-HRP)購自北京伊普瑞斯有限公司；氯金酸(HAuCl4·3H2O)、對苯二酚(HQ)和1，6-己二硫醇(HDT)購于北京百靈威科技有限公司，牛血清白蛋白購于Sigma有限公司，檸檬酸鈉和雙氧水購于福辰化學(xué)試劑有限公司。所有試劑均為分析純及以上。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(Milli-QAdvantage A10超純水系統(tǒng)，法國Millipore公司)。

1.2金溶膠的制備

將8 mL 1% 的檸檬酸三鈉溶液迅速加至0.01% 100 mL沸騰狀態(tài)下的HAuCl4溶液中，攪拌15 min后，混合溶液的顏色由淺黃變?yōu)榫萍t色。自然冷卻至室溫，即得金納米粒子溶膠，將其置于4 ℃冰箱黑暗條件下保存?zhèn)溆肹24-25]。

圖1　免疫傳感器的制備過程及響應(yīng)原理示意圖Fig.1　Illustration of fabrication process and response mechanism of the immunosensora:in blank solution；b:in the presence of MCLR

1.3免疫傳感器的制備

免疫傳感器的制備過程如圖1所示。將金電極用粒徑為0.02～0.05 μm的Al2O3懸濁液拋光成鏡面后，用水清洗干凈，浸泡于新制的piranha溶液即H2O2∶H2SO4(3∶7)中活化15 min，然后分別在乙醇和水中超聲清洗5 min，氮?dú)獯蹈?。將金電極放入0.5% HDT溶液中浸泡過夜，通過Au-S鍵將HDT單分子層自組裝于金電極表面，得到HDT/GE；再向HDT/GE表面滴加10 μL金納米粒子溶膠，4 ℃下靜置12 h，AuNPs通過Au-S與HDT相連接，即得Au/HDT/GE；然后將5 μL 20 μg/mL 的anti-MCLR滴加至Au/HDT/GE表面，濕盒中靜置1 h，得到anti-MCLR/Au/HDT/GE；最后用10 μL 1% BSA溶液封閉特異性位點(diǎn)，將所制得的免疫傳感器于4 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4MCLR的檢測方法

將5 μL不同濃度的MCLR溶液和5 μL 15 μg/mL的MCLR-HRP先后滴加至免疫傳感器表面，室溫下濕盒中孵育1 h。電化學(xué)測試底液為含有1.5 mmol/L H2O2和3 mmol/L HQ的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 7.4)。MCLR的測定采用差分脈沖伏安法(DPV)和安培法。DPV的電位掃描范圍為-0.3～0.1 V，脈沖振幅50 mV，免疫反應(yīng)后差分脈沖峰電流Ip隨MCLR濃度的增加而減小，空白溶液的峰電流記作I0，通過空白溶液與MCLR溶液峰電流的差值ΔI(ΔI=I0-Ip)進(jìn)行定量分析(見圖1)。安培法是在+0.4 V(vs.SCE)恒電位下，待背景電流穩(wěn)定后迅速加入HQ溶液，記錄電極對HQ的電流響應(yīng)。

圖2　金納米粒子溶膠的透射電子顯微鏡圖Fig.2　TEM image of colloidal Au nanoparticles

圖3　不同電極的循環(huán)伏安圖Fig.3　Cyclic voltammograms of different electrodesa.bare GE，b.HDTs/GE，c.AuNPs/HDTs/GE；solution:1 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-

2　結(jié)果與討論

2.1金納米粒子的表征

本研究對AuNPs進(jìn)行了紫外-可見吸收光譜表征，結(jié)果顯示其在518 nm左右出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，根據(jù)公式[24]λmax=507.1+8.68×ln[0.2×size(AuNPs)(nm)] 計(jì)算金納米粒子的粒徑約為17 nm。根據(jù)AuNPs的透射電子顯微鏡圖(TEM)(圖2)，可觀察到金納米粒子呈球形分布，粒徑為15～18 nm，無團(tuán)聚現(xiàn)象。

2.2金納米粒子修飾電極的表征

在電位掃描范圍為-0.6～0.6 V，掃描速率為100 mV/s條件下，考察了裸金電極(a)、HDTs/GE(b)和AuNPs/HDTs/GE(c)在含1 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl 溶液中的循環(huán)伏安曲線(圖3)。與裸金電極相比，由于HDT分子層對電子傳遞的阻礙作用，顯著減小了電極的氧化還原峰電流；而當(dāng)金納米粒子結(jié)合到電極表面后，由于金納米粒子良好的導(dǎo)電性，[Fe(CN)6]3-/4-的氧化還原峰電流明顯增大，且大于裸電極上的峰電流，這說明AuNPs與HDT單分子層成功結(jié)合，且AuNPs的存在提高了電極的導(dǎo)電性能。

采用掃描探針顯微鏡(SPM)對AuNPs/HDTs/GE的表面形貌進(jìn)行表征，結(jié)果顯示，金納米粒子修飾于金電極表面為免疫傳感器提供了更大的表面積，從而使電極上可修飾更多的anti-MCLR，最終改善了免疫傳感器的檢測靈敏度。

圖4　不同電極的電化學(xué)交流阻抗圖Fig.4　Electrochemical impedance spectra of different electrodes a.bare GE，b.HDTs/GE，c.AuNPs/HDTs/GE，d.anti-MCLR/AuNPs/HDTs/GE，e.BSA/anti-MCLR/AuNPs/HDTs/GE，f.MCLR-HRP/BSA/anti-MCLR/AuNPs-HDTs/GE；solution:5.0 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-

2.3電極在修飾過程中的電化學(xué)表征

采用電化學(xué)交流阻抗法(EIS)檢測了修飾電極界面的特性。圖4為電極修飾過程中的阻抗譜圖，曲線高頻部分呈半圓形，其直徑等于界面電荷轉(zhuǎn)移阻抗(Ret)值，低頻部分受傳質(zhì)控制。裸金電極的交流阻抗圖近似呈一個小半圓(曲線a)，表明電極表面只受擴(kuò)散控制；當(dāng)電極表面修飾上HDT單分子層后，其阻抗值顯著增大(曲線b)，說明該分子層阻礙探針離子[Fe(CN)6]3-/4-在電極上的電子傳輸；當(dāng)在電極表面修飾納米金后，阻抗值明顯降低(曲線c)，說明納米金具有極好的導(dǎo)電性；金電極表面依次修飾上anti-MCLR，BSA，MCLR-HRP后，電極的阻抗值逐漸增大(曲線d～f)，這些物質(zhì)增大了探針分子在通過膜時的阻力，表明其已被成功地固定到電極表面。

2.4實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4.1anti-MCLR濃度的優(yōu)化 在5～30 μg/mL范圍內(nèi)，采用差分脈沖伏安法考察了anti-MCLR濃度對免疫傳感器響應(yīng)峰電流的影響。結(jié)果表明，隨著anti-MCLR濃度的增大，免疫傳感器的DPV峰電流先逐漸增大后趨于平緩。anti-MCLR濃度為20 μg/mL時，峰電流達(dá)到最大值，此后再增大anti-MCLR濃度，峰電流不再增大。因此選擇anti-MCLR的最佳濃度為20 μg/mL。

2.4.2MCLR-HRP濃度的優(yōu)化免疫傳感器表面修飾的HRP對其響應(yīng)靈敏度有直接影響。將不同濃度MCLR-HRP修飾于免疫電極BSA/anti-MCLR/AuNPs-HDTs/GE上，發(fā)現(xiàn)其峰電流隨著MCLR-HRP濃度的增大而增大，當(dāng)MCLR-HRP濃度達(dá)到15 μg/mL時，峰電流不再增大，表明此時免疫電極表面的特異性位點(diǎn)已完全結(jié)合MCLR-HRP，因此選擇 MCLR-HRP的最佳濃度為15 μg/mL。

2.4.3測試底液中H2O2與HQ濃度的優(yōu)化 底液中H2O2與HQ的濃度對免疫傳感器的響應(yīng)信號有重要影響。分別將免疫傳感器MCLR-HRP/BSA/anti-MCLR/AuNPs-HDTs/GE浸入含0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mmol/L H2O2的測試底液中，測量DPV峰電流。結(jié)果顯示，H2O2的濃度在0.5～1.5 mmol/L范圍內(nèi)，峰電流隨著H2O2濃度的增加而增大，當(dāng)H2O2濃度達(dá)到1.5 mmol/L時峰電流不再增大，故選擇 H2O2的最佳濃度為1.5 mmol/L。同理，分別將免疫電極浸入含1.0，2.0，3.0，3.5，4.0 mmol/L HQ的測試底液中，結(jié)果顯示，HQ的最佳濃度為3.0 mmol/L。

圖5　傳感器對不同濃度MCLR的差分脈沖伏安圖Fig.5　Differential pulse voltammograms of different concentrations MCLR on the sensorsolution:0.1 mol/L PBS (pH 7.4) containing 3.0 mmol/L HQ and 1.5 mmol/L H2O2 ;insert:calibration curve,concentration of MCLR(a-f):0，0.01，0.10，1.0，10，25 μg/L

2.5MCLR的測定

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，考察了MCLR-HRP/anti-MCLR/Au/HDT/GE免疫傳感器對不同濃度MCLR的電流響應(yīng)。如圖5所示，差分脈沖伏安峰電流隨MCLR濃度的增加而減小，且ΔI與MCLR濃度(μg/L)的對數(shù)在0.01～25 μg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為ΔI(μA)=3.354+1.401lgc，相關(guān)系數(shù)為0.991 8，檢出限(S/N=3)為0.005 μg/L。

采用安培法考察了MCLR-HRP/anti-MCLR/Au/HDT/GE免疫傳感器的性能。在含1.5 mmol/L H2O2的0.1 mol/L PBS緩沖溶液中，工作電極的電位為+400 mV，在攪拌狀態(tài)下，待電流穩(wěn)定后迅速加入3 mmol/L HQ。結(jié)果顯示，響應(yīng)電流隨MCLR濃度的增大而減小，電流差值ΔI與MCLR濃度的對數(shù)在0.010～10 μg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，回歸方程為ΔI(μA) =-14.861+5.081 lgc，相關(guān)系數(shù)為0.992 8，檢出限為0.004 6 μg/L。

2.6重現(xiàn)性、穩(wěn)定性與選擇性

2.7實(shí)際水樣的檢測

將該免疫傳感器用于北京市通惠河河水的檢測，通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)對MCLR濃度進(jìn)行測定。水樣預(yù)處理分為兩步：經(jīng)過3次-20 ℃冷凍萃取、20 ℃以上室溫解凍、30 min以上超聲處理；用孔徑為0.45 μm的濾膜對上述水樣進(jìn)行抽濾。表1結(jié)果顯示，原始水樣中均未檢出MCLR，對其進(jìn)行10.00，15.00 μg/L濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，其回收率分別為102%和100%，檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法[7]結(jié)果相符。

表1　免疫傳感器和HPLC法對實(shí)際水樣測定結(jié)果的對比Table 1　Comparative determination of MCLR in real sample by the proposed immunosensor and HPLC method

3　結(jié)　論

本文將AuNPs組裝到1，6-己二硫醇自組裝單分子層修飾的金電極表面，再將MCLR抗體固定于該修飾電極上，構(gòu)建了一種檢測MCLR的免疫傳感器。與交聯(lián)反應(yīng)固定抗體方法相比，本文固定anti-MCLR的方法不僅很好地保持了抗體的活性，而且固定在電極表面的傳感層較薄，有利于分子、離子在電極表面的擴(kuò)散。此外，AuNPs的加入增強(qiáng)了電極的導(dǎo)電性，并增大了抗體在免疫傳感器上的固定量。該傳感器的制作方法簡單，測定重現(xiàn)性好、選擇性高，具有較好的應(yīng)用前景。

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Study on Electrochemical Immunosenor for Microcystin-LR Based on HDT Self-assembly Au Nanoparticle Modified Electrode

ZHANG Jing-jing，KANG Tian-fang*，LI Na-na，LU Li-ping，CHENG Shui-yuan

(College of Environmental and Energy Engineering，Key Laboratory of Beijing on Regional Air Pollution Control，Beijing University of Technology，Beijing100124，China)

A novel electrochemical immunosensor for microcystin-(leucine-arginine)(MCLR) was developed based on gold electrode modified with Au nanoparticles(AuNPs).The AuNPs were prepared by the sodium citrate reduction method,and characterized by transmission electron microscopy(TEM) and UV-vis absorption spectroscopy.1，6-hexanedithiol(HDT) molecules were modified onto the surface of a gold electrode to form self-assembly monolayer,and then the AuNPs were assembled on the self-assembly monolayer of HDT.The immunosensor was constructed by immobilizing the antibody of microcystin-(leucine-arginine)(anti-MCLR) on the modified electrode.The surface morphology of the AuNPs modified electrode and the electrochemical behaviour of the immunosensor were characterized by scanning probe microscopy，cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy(EIS)，respectively.MCLR and horseradish peroxidase conjugated MCLR(MCLR-HRP) competitively combined with immobilizing anti-MCLR.The determination of MCLR using the immunosensor was investigated by differential pulse voltammetry(DPV).Under the optimized conditions，a linear range from 0.01 μg/L to 25 μg/L and a detection limit of 0.005 μg/L were obtained by DPV method.The reproducibility，stability and selectivity of the immunosensor for MCLR were investigated.The proposed method was applied in the determination of MCLR in real water samples with recoveries of 100%-102%,and the determination results of MCLR were consistent with those obtained by HPLC method.

microcystin；gold nanoparticles；self-assembly；immunosensor

2016-01-22；

2016-04-04

國家教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(20131103110011);國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BSC23B0204)

康天放，博士，教授，研究方向：化學(xué)生物傳感技術(shù)及化學(xué)污染物快速檢測應(yīng)用，Tel:010-67391659，E-mail:kangtf@sina.cn，kangtf@bjut.edu.cn

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.004

O657.1；S852.44

A

1004-4957(2016)09-1100-05