楊向東 牛 陸 張 偉 楊 靜 杜 茜 邢國杰 郭東全李啟云 董英山

吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所 / 吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室, 吉林長春130033

RNAi介導SMV-P3基因沉默增強大豆對花葉病毒病的抗性

楊向東 牛 陸 張 偉 楊 靜 杜 茜 邢國杰 郭東全李啟云 董英山*

吉林省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所 / 吉林省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室, 吉林長春130033

大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus, SMV)病是我國各大豆主產(chǎn)區(qū)最重要的病害之一, 嚴重影響大豆產(chǎn)量和籽粒外觀品質(zhì)。培育抗病品種是防治該病害最經(jīng)濟有效的措施。本研究基于植物介導 RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù), 將編碼參與SMV運動和影響宿主域范圍的P3蛋白基因RNAi片段導入栽培大豆品種, 研究RNAi介導SMV-P3基因沉默對大豆抗SMV的影響。Southern雜交檢測結(jié)果表明, 外源RNAi片段以低拷貝的形式(1~4個)整合至大豆基因組中。對T1~T3代轉(zhuǎn)基因大豆噴施除草劑和PCR鑒定結(jié)果表明, 外源T-DNA插入片段在轉(zhuǎn)基因大豆不同代際間能夠穩(wěn)定遺傳。對T2和T3代轉(zhuǎn)基因大豆接種SMV鑒定結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)基因大豆對我國大豆產(chǎn)區(qū)主要流行SMV株系SC-3較非轉(zhuǎn)基因?qū)φ帐荏w品種Williams 82和SN9的抗性水平顯著提高, 病情指數(shù)降低至4.37~18.51, 且抗性能夠穩(wěn)定遺傳。綜上所述, RNAi介導SM-P3基因沉默能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因大豆對SMV的抗性水平。

大豆; 大豆花葉病毒病; SMV-P3; RNAi介導基因沉默

大豆花葉病毒(soybean mosaic virus, SMV)病是 由大豆花葉病毒引起的一類世界性大豆病害, 也是我國各大豆主產(chǎn)區(qū)最重要的病害之一。SMV一般可造成大豆減產(chǎn)10%~30%, 嚴重年份和地區(qū)甚至造成大面積絕產(chǎn)[1-3]。SMV還常常造成籽粒斑駁, 嚴重影響大豆籽粒的外觀品質(zhì)和商品價值[4]。在分類學上, SMV屬馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus), 主要通過受侵染的種子和蚜蟲傳播。隨著全球范圍內(nèi)大豆種質(zhì)資源交流, 新型病毒株系的出現(xiàn)和致病力強弱的變化, 我國大豆抗SMV育種工作面臨的形勢也更為嚴重。Yang等[5]對我國境內(nèi)采集的206個病毒株和589個SMV樣本分析表明,新型重組花葉病毒(recombinant Soybean mosaic virus, SMV-R)出現(xiàn)頻率達到16.7%~60.0%, 且主要集中在我國中部和南部大豆種植區(qū)。由于化學防治困難且易造成環(huán)境安全等問題, 生產(chǎn)上對大豆花葉病毒的防治主要依賴于抗SMV大豆品種的培育。由于SMV存在復雜的株系分化, 大豆對 SMV的抗性又具有株系專化性[6], 因此, 寄主的抗性易隨著病毒株系的變異而喪失[7-9], 培育廣譜、抗性持久的抗病品種也成為防治大豆花葉病毒病的根本途徑。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是植物抵抗外來核酸(病毒、轉(zhuǎn)座子等)入侵以保持自身基因組完整性的一種防御機制[10-11]。病毒入侵寄主細胞后,其雙鏈 RNA (double-strand RNA, dsRNA)被植物DCL (Dicer-like)核酸酶加工為 vsiRNA (virus short interfering RNA), 隨后 vsiRNA與 AGO蛋白結(jié)合,降解與 vsiRNAs 互補配對的長鏈病毒 RNA, 從而阻止病毒的進一步侵染[12]。許多研究表明, 在植物中表達部分病毒基因組序列片段, 產(chǎn)生的dsRNA可以有效抑制病毒的侵染[13-15]。在大豆抗SMV研究方面, Wang等[16]將攜帶SMV 3′-UTR的外殼蛋白基因CP導入大豆, 其中2個轉(zhuǎn)基因株系對SMV抗性水平較受體品種顯著提高。Furutani等[17]將 SMV-CP基因?qū)氪蠖? 接種鑒定結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)基因大豆植株對SMV侵染具有較高的抗性。Zhang等[18]和Kim 等[19]分別將SMV-NIB和SMV-CP基因序列反向重復片段(inverted repeat, IR)導入大豆, 接種鑒定結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)基因大豆能夠有效抵御SMV的侵染, 其SMV抗性顯著高于受體品種。最近, Gao等[3]將轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)的負調(diào)控因子SMV HC-Pro基因IR片段導入大豆, 接種鑒定表明, 轉(zhuǎn)基因大豆對SMV抗性顯著提高。可見, 利用宿主介導SMV編碼基因RNAi沉默是提高大豆抗SMV的有效手段。更為重要的是, 利用RNAi干擾技術(shù)為同時抗多種病毒及病毒不同生理小種提供了一條更為有效的技術(shù)途徑[13,18,20]。但目前已有的研究主要是通過 RNAi介導 SMV-CP或 SMVHC-Pro基因沉默提高大豆抗 SMV水平, 而對其他參與SMV侵染、復制、運動等過程關(guān)鍵基因RNAi沉默介導的SMV抗性研究則尚未見到相關(guān)報道。

與Potyvirus屬其他病毒成員類似, SMV基因組為單鏈正義 RNA[21], 其基因組共編碼 11個不同功能的成熟蛋白[22]。P3蛋白是由SMV基因組編碼的一個關(guān)鍵蛋白。研究表明, P3蛋白不僅在病毒復制和運動過程中發(fā)揮著重要的作用, 同時與感染寄主癥狀表型密切相關(guān), 并在一定程度上決定了病毒侵染的寄主范圍[23-24]。最近研究表明, P3蛋白是攜帶Rsv1抗性位點大豆基因型的無毒決定因子[25-26]。攜帶Rsv4抗性位點大豆基因型的無毒決定因子也位于P3蛋白序列內(nèi)部, 并在 SMV致病過程中發(fā)揮著重要的作用[27-29]。另外, 位于P3蛋白基因順反子內(nèi)部編碼75個氨基酸的PIPO蛋白對病毒粒子在寄主體內(nèi)的運動也發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[30]。本文利用 RNAi介導SMV-P3基因沉默研究對大豆抗SMV的影響,以期為進一步拓寬大豆抗SMV遺傳資源基礎, 培育廣譜、高抗SMV轉(zhuǎn)基因大豆新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大豆花葉病毒 SC-3株系和受體品種 Williams 82分別由吉林省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所和大豆研究所提供; 受體品種SN9由沈陽農(nóng)業(yè)大學謝甫綈教授惠贈。大腸桿菌DH5α購自北京TIANGEN公司; 根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA101由本實驗室保存; 載體質(zhì)粒 pTF101-RBSC由東北師范大學劉寶教授惠贈。TRIzol試劑和Prime-Scrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒分別購自美國 Invitrogen和日本 TaKaRa公司; KOD FX高保真酶購自日本TOYOBO公司; ExTaq MasterMix聚合酶購自北京康為試劑公司; 限制性內(nèi)切酶Hind III、Sac I等購自美國Thermo公司; 除草劑Basta購自北京鼎國生物公司; 草銨膦(Glufosinate-ammonium, 貨號 45520-100MG)購自Sigma公司; QuickStix PAT/bar 轉(zhuǎn)基因檢測試紙購自美國EnviroLogix公司; 遺傳轉(zhuǎn)化實驗中所用的培養(yǎng)基基礎成分、植物激素、抗生素等購自美國Phyto Tech 和Sigma公司; 測序與引物合成委托北京華大基因公司完成。

1.2 SMV-P3反向重復片段設計及RNAi表達載體構(gòu)建

利用TRIzol試劑從感染SMV SC-3 病毒的大豆葉片(本實驗室保存)中提取總 RNA, 并用 Prime-Scrip 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1鏈, 保存于–20℃。根據(jù)GenBank中已登錄SMV株系P3基因保守序列(2529~2822 nt)設計引物, 正向引物為5′-GGTTGTTGGATGCTTTTCTTTC-3′, 反向引物為5′-TCTCTTGATGGGCTTGGTTTCACC-3′。以合成cDNA第一鏈為模板, 利用 KOD FX 高保真酶擴增目的片段。以 pTF101-RBSC質(zhì)粒為載體骨架, 利用常規(guī)分子生物學操作技術(shù)將目的片段分別以正向和反向的方式構(gòu)建到載體中, 構(gòu)建植物RNAi表達載體 pTF101-RBSC-P3, 并送北京華大公司測序驗證。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTF101-RBSC-P3中, SMV-P3 RNAi片段啟動子為菜豆葉片特異啟動子RBSC2 (GenBank登錄號為 AF028707.1), 內(nèi)含子序列來源于黃菊花屬Flaveria trinervia丙酮酸磷酸雙激酶pdk基因, 植物篩選標記為草胺膦抗性基因bar (圖1)。采用凍融法將載體質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌菌株EHA101以備轉(zhuǎn)化。

圖1 RNAi表達載體pTF101-RBSC-P3 T-DNA區(qū)示意圖Fig.1 Schematic representation of the T-DNA region of the recombinant plasmid pTF101-RBSC-P3

1.3 農(nóng)桿菌介導大豆遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導法進行大豆遺傳轉(zhuǎn)化[31], 轉(zhuǎn)化受體品種為Williams 82和SN9。將萌發(fā)培養(yǎng)基GM (B5鹽、B5維生素、30 g L–1蔗糖、3.9 g L–1MES、5 g L–1瓊脂粉, pH 5.8)上培養(yǎng)24 h后的大豆種子沿種臍部位剖開, 并在子葉節(jié)位置輕微劃傷, 然后于農(nóng)桿菌液中侵染30 min。將侵染后的外植體轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)基CCM (B5鹽、B5維生素、30 g L–1蔗糖、3.9 g L–1MES、1.67 mg L–1BAP、0.25 mg L–1GA3、400 mg L–1半胱氨酸、154.2 mg L–1DTT、200 μmol L–1AS、5 g L–1瓊脂粉, pH 5.4)上, 于23℃條件下暗培養(yǎng)4 d。將外植體近軸面朝上轉(zhuǎn)移至誘導培養(yǎng)基SIM (B5鹽、B5維生素、30 g L–1蔗糖、0.59 g L–1MES、1.67 mg L–1BAP、250 mg L–1頭孢霉素、100 mg L–1Timentin、6 mg L–1草丁膦、8 g L–1瓊脂粉, pH 5.7)上, 25℃, 16 h/8 h光暗條件下培養(yǎng)2周左右。然后將外植體取出, 切除多余的下胚軸部分, 并轉(zhuǎn)移至誘導培養(yǎng)基 SIM 上繼續(xù)培養(yǎng)2~4周。將外植體上產(chǎn)生的叢生芽轉(zhuǎn)移至芽伸長培養(yǎng)基SEM (MS鹽、MS維生素、30 g L–1蔗糖、0.59 g L–1MES、50 mg L–1天門冬氨酸、50 mg L–1L-谷氨酸、0.1 mg L–1IAA、0.5 mg L–1GA3、1.0 mg L–1玉米素核苷、250 mg L–1頭孢霉素、100 mg L–1Timentin、6 mg L–1草丁膦、8 g L–1瓊脂粉, pH 5.7)上培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為25℃, 16 h/8 h光暗周期。待抗性芽長至3~5 cm時,將其切下, 并用1 mg L–1IBA浸泡30 s, 然后轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基RM (MS鹽、20 g L–1蔗糖、0.59 g L–1MES、 50 mg L–1天門冬氨酸、50 mg L–1L-谷氨酸、1.0 mg L–1IBA、3 g L–1植物凝膠, pH 5.6)上繼續(xù)培養(yǎng)。待抗性芽長出健壯的根時, 移栽至溫室中生長結(jié)實。

1.4 PCR檢測和除草劑噴施鑒定

對移栽至溫室中的轉(zhuǎn)化再生植株進行 PAT/bar試紙檢測, 具體檢測方法參照產(chǎn)品說明書。采用DNA 快速提取法提取轉(zhuǎn)化再生植株葉片 DNA[32],根據(jù)植物RNAi表達載體pTF101-RBSC-P3序列設計 2對特異性檢測引物(P3-F1/P3-R1和 Bar-F1/ Bar-R1)。引物P3-F1 (5′-ACCTCAACTCCACCAGC ATC-3′)位于SMV-P3 RNAi片段上游啟動子RBSC2,引物 P3-R1 (5′-TACTCTCAACTTTTATCTTCTTCG TC-3′)位于內(nèi)含子pdk序列。引物對Bar-F1/Bar-R1 (F: 5′-GCACCATCGTCAACCACTACATCGAG-3′, R: 5′-TGAAGTCCAGCTGCCAGAAACCCAC-3′)位于bar基因讀碼框。預期PCR擴增片段分別為727 bp和441 bp。內(nèi)標基因Gmactin檢測引物為Act-F1/Act-R1 (F: 5′-TTGACTGAGCGTGGTTATTCC-3′, R: 5′-GAT CTTCATGCTGCTGGGTG-3′), 擴增片段為403 bp。3對引物PCR擴增條件均為95℃ 5 min; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 1 min, 共35個循環(huán); 72℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

對T1~T3代轉(zhuǎn)基因植株后代采用PCR檢測和田間噴施除草劑 Basta (主要成分為草銨膦)的方法鑒定。PCR檢測引物及檢測方法同上。待大豆幼苗長出第1組三出復葉時, 噴施500 mg L–1Basta。7~14 d后調(diào)查除草劑抗性情況, 并拔除對除草劑 Basta敏感的植株。本研究中獲得的PCR陽性和耐除草劑大豆用于后續(xù)試驗。

1.5 轉(zhuǎn)基因大豆Southern雜交檢測

選取T1代PCR陽性大豆植株進行Southern雜交檢測。采用高鹽CTAB法提取轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)化植株葉片總DNA[33]。利用Hind III酶切總DNA (30~50 μg), 0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段。采用高鹽轉(zhuǎn)移法, 將酶切片段轉(zhuǎn)移至帶正電荷的Hybond-N+尼龍膜(Amersham, USA)上。根據(jù) RNAi載體 pTF101-RBSC-P3中的bar基因序列設計引物(引物序列同上),并擴增探針模板。利用 DIG隨機引物標記試劑盒標記探針。根據(jù) Roche公司的 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II試劑盒說明書進行探針制備及雜交。雜交溫度為42℃, 以2×SSC (含0.1% SDS), 37℃條件下洗膜 2次, 每次 5 min; 0.5×SSC (含0.1% SDS), 66℃條件下洗膜2次, 每次15 min。然后利用BCIP/NBT在膜上化學顯色。

1.6 SMV田間抗性鑒定

采用汁液摩擦接種法, 對T2和T3代轉(zhuǎn)基因大豆進行抗SMV鑒定。每個株系種植3壟, 每壟30株, 隨機區(qū)組設計。待大豆植株第 1片三出復葉出現(xiàn)時, 參照Gao等[3]的方法接種SMV SC-3病毒。參照Zhi等[34]提出的SMV病情分級標準, 計算病情指數(shù)。高抗(IM),無可見系統(tǒng)癥狀, 病情指數(shù)為 0; 抗病(R), 病情指數(shù)在1~20之間; 中抗(MR), 病情指數(shù)在21~35之間; 中感(MS), 病情指數(shù)在36~50之間; 感病(S), 病情指數(shù)在51~70之間; 高感(HS), 病情指數(shù)大于70。對受體大豆和轉(zhuǎn)基因大豆的株系生育期(growing period duration, GPD)、葉形(leaf shape, LS)、花色(flower color, FC)、株高(plant height, PlH)、種皮色(seed coat color, SCC)、分枝數(shù)(branching number, BN)、節(jié)數(shù)(node number, NN)、結(jié)莢高度(podding height, PoH)、百粒重(100-seed weight, 100SW)、種臍色(hilum color, HC)等表型性狀進行調(diào)查。

1.7 統(tǒng)計分析

利用 Microsoft Excel軟件, 采用 t-檢驗分析轉(zhuǎn)基因大豆株系與對照受體品種對 SMV抗性水平的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)SMV-P3 RNAi大豆植株的獲得及分子鑒定

根據(jù) GenBank中已登錄大豆花葉病毒株系 P3基因的保守序列, 選取302 bp片段(2529~2822 nt)作為靶序列, 構(gòu)建攜帶該靶序列反向重復片段的RNAi表達載體(圖1)。采用農(nóng)桿菌介導法將SMV-P3 RNAi片段導入大豆栽培品種Williams 82和SN9。共轉(zhuǎn)化外植體2876個, 經(jīng)過分化、篩選和再生, 獲得耐6 mg L–1草丁膦再生植株146株。PAT/bar試紙和PCR檢測結(jié)果表明, 其中83株能擴增出目的條帶,擴增條帶分別為727 bp和441 bp, 與預期大小一致,而對照非轉(zhuǎn)基因植株則沒有相應的條帶(圖2和圖3), PCR陽性轉(zhuǎn)化率為 2.89%。轉(zhuǎn)基因植株移栽至溫室后能夠正常開花結(jié)實, 且在表型上與對照非轉(zhuǎn)基因植株無明顯差異。選取6個PCR陽性轉(zhuǎn)基因大豆植株進行 Southern雜交, 雜交探針為 bar基因序列。根據(jù)載體pTF101-RBSC-P3 T-DNA中Hind III酶切位點的位置, 預期雜交片段最小應為1.5 kb。檢測結(jié)果表明, 6個轉(zhuǎn)基因大豆植株均可以檢測到雜交信號,而對照非轉(zhuǎn)基因大豆則沒有雜交條帶出現(xiàn)(圖4), 表明外源片段已整合到大豆基因組中。在檢測的轉(zhuǎn)基因植株中, 外源T-DNA插入拷貝數(shù)為1~4個。

2.2 轉(zhuǎn)基因大豆外源片段遺傳穩(wěn)定性分析

除草劑噴施結(jié)果表明, 在500 mg L–1Basta處理條件下, 非轉(zhuǎn)基因大豆很快(7 d左右)出現(xiàn)葉片黃化或枯死現(xiàn)象, 而轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)正常(圖5)。3個轉(zhuǎn)基因大豆株系B013、B115和B127中, 除草劑抗性植株和敏感植株比例約為3∶1, 另外3個轉(zhuǎn)基因大豆株系B128、B163和B166分離比例約為15∶1。連續(xù)3代PCR檢測結(jié)果表明, 外源SMV-P3 RNAi片段在轉(zhuǎn)基因大豆不同代際間能夠穩(wěn)定遺傳(圖6)。

圖2 PAT/bar試紙檢測Fig.2 Liberty link strips test

圖3 T0代轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測Fig.3 PCR analysis of the T0transgenic plants

圖4 T1代轉(zhuǎn)基因大豆Southern雜交檢測Fig.4 Southern blot analysis of the T1transgenic plants

圖5 T3代轉(zhuǎn)基因大豆耐除草劑鑒定(500 mg L–1Basta)Fig.5 Herbicide tolerance with 500 mg L–1of Basta in T3transgenic lines

圖6 T1~T3代轉(zhuǎn)基因大豆PCR檢測Fig.6 PCR of the T1–T3transgenic lines

2.3 轉(zhuǎn)基因大豆抗SMV鑒定

接種SMV SC-3后, 對照非轉(zhuǎn)基因大豆出現(xiàn)葉片嚴重皺縮、花葉和植株矮化等 SMV感染典型癥狀。轉(zhuǎn)基因大豆植株則表現(xiàn)輕微或是無明顯癥狀(圖7和圖8), 表明RNAi介導SMV-P3基因沉默顯著降低了SMV的侵染及癥狀發(fā)展。也說明SMV-P3基因與 SMV感染寄主癥狀表型密切相關(guān)[23-24]。連續(xù) 2代抗性鑒定結(jié)果表明, 在鑒定的 6個株系中, B127 和 B163對 SMV抗性最強, 病情指數(shù)降低至4.37~11.11, 另外4個株系對SMV也表現(xiàn)出較高的抗性水平(表1)。6個株系的病情指數(shù)均顯著低于對照非轉(zhuǎn)基因大豆Williams 82 (病情指數(shù)36.81~45.24) 和SN9 (病情指數(shù)39.80~46.97), 說明轉(zhuǎn)基因大豆顯著提高了SMV抗性水平, 且抗性性狀能夠穩(wěn)定遺傳(表1)。另外, 對轉(zhuǎn)基因大豆田間表型性狀調(diào)查結(jié)果表明, 6個轉(zhuǎn)基因大豆株系在葉形(圓形)、花色(白色)、種皮色(黃色)、種臍色(黑色)、株高、節(jié)數(shù)、結(jié)莢高度、生育期等方面與受體大豆品種沒有明顯差異(表2)。初步說明, 外源片段的插入并沒有對轉(zhuǎn)基因大豆的表型性狀造成影響。

3 討論

圖7 摩擦接種SMV SC-3后轉(zhuǎn)基因植株葉片癥狀表現(xiàn)Fig.7 Leaf symptom of the transgenic plants inoculated with SMV SC-3 by rub infection

圖8 接種SMV后整株癥狀表現(xiàn)Fig.8 Plants of the transgenic lines after inoculation with SMV SC-3

表1 T2和T3代轉(zhuǎn)基因大豆接種SMV SC-3抗性鑒定結(jié)果Table1 SMV resistance evaluation of the T2and T3transgenic lines

已有的研究表明, 通過 RNAi干擾抑制或阻斷SMV關(guān)鍵基因的表達可以顯著增強大豆抗SMV能力[3,18-19,35]。在SMV基因組編碼的11個不同功能的成熟蛋白中, P3蛋白參與SMV復制和病毒粒子在宿主體內(nèi)的運動, 并與感染寄主癥狀表型密切相關(guān)[23-24]。最近的研究結(jié)果表明, P3蛋白可能是攜帶 Rsv1和Rsv4抗性位點大豆基因型的無毒決定因子[25-29]。進一步研究表明, Rsv1編碼蛋白可以識別P3蛋白, 并誘發(fā)大豆產(chǎn)生 Rsv1基因介導的過敏反應(hypersensitive response, HR)[26]。盡管目前尚沒有直接證據(jù)表明P3蛋白與植物非宿主抗性機制有關(guān), 但也提示P3蛋白在決定大豆宿主范圍中發(fā)揮著重要的作用, 并與SMV致病性有關(guān)[29]。因此, 抑制SMV-P3基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯可以干擾或影響SMV的致病性, 并在一定程度上影響SMV的宿主范圍?；谶@一思路, 本研究利用宿主RNAi介導SMV-P3基因沉默研究對大豆抗SMV的影響。研究結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)SMV-P3 RNAi片段大豆在接種SMV SC-3株系后, 其癥狀表現(xiàn)輕微或無明顯癥狀, 病情指數(shù)比受體對照品種顯著降低, 表明SMV-P3基因沉默顯著降低了SMV侵染或癥狀發(fā)展, 提高了轉(zhuǎn)基因大豆抗SMV的能力。本研究首次報道了RNAi介導SM-P3基因沉默可以顯著提高大豆抗SMV水平, 為培育廣譜、高抗SMV轉(zhuǎn)基因大豆新品種提供了一條新的路徑。

表2 轉(zhuǎn)基因大豆株系農(nóng)藝性狀的大田表現(xiàn)Table2 Agronomic performance of the transgenic lines in field condition

值得注意的是, 盡管抑制 SMV-P3基因的表達顯著了提高大豆抗SMV能力, 但就本實驗的研究結(jié)果來看, 轉(zhuǎn)基因大豆對SMV抗性并沒有達到免疫水平。這一點與Zhang等[18]和Kim等[19]等研究結(jié)果不同。其原因可能與RNAi干擾本身抑制效率有關(guān), 即SMV-P3 RNAi并沒有100%抑制或降解P3基因的表達; 也可能是抑制P3基因的表達僅對SMV在寄主體內(nèi)的運動造成干擾, 限制了SMV癥狀的發(fā)展, 但在高水平接種量條件下并沒有完全抑制 SMV的侵染。不過, 從育種和生產(chǎn)實際角度講, 低于免疫水平的抗性對于延緩SMV病毒生理小種進化速度, 提高大豆品種持久抗性水平又具有積極的意義。已有的研究表明, 由于位置效應、T-DNA插入拷貝數(shù)等因素的影響, 外源基因或片段在轉(zhuǎn)基因植株中易丟失或沉默, 從而導致轉(zhuǎn)基因后代遺傳不穩(wěn)定[36]。本研究結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)SMV-P3 RNAi大豆抗性性狀在不同代際間能夠穩(wěn)定遺傳。這可能是轉(zhuǎn)基因大豆中外源T-DNA插入拷貝數(shù)較少(1~3個)的緣故, 也可能與本研究選用的葉片特異性啟動子RBSC2有關(guān)。

研究表明, SMV-P3基因在不同SMV株系中存在著較高水平的變異[23,37]。楊清華[37]對不同來源SMV生理小種P3基因序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明, 來源于中國和韓國的SMV株系P3基因序列同源性相對較高, 核苷酸序列同源性為 92.4%~ 98.9%, 氨基酸序列同源性為96%~100%。與來源于美國的SMV株系P3基因序列同源性相對較低, 核苷酸序列同源性為 88.50%~99.79%, 氨基酸序列同源性為91.40%~99.86%[37]。本研究根據(jù)GenBank中已登錄SMV株系 P3基因保守序列(2529~2822 nt)設計反向重復片段, 并研究了轉(zhuǎn)SMV-P3 RNAi大豆對SMV SC-3株系抗性的影響。由于P3蛋白在決定SMV宿主范圍中發(fā)揮著重要的作用[23-24], 轉(zhuǎn)基因大豆對其他SMV株系的抗性是否也能夠顯著提高, 需要在后續(xù)研究中進一步鑒定評價。

4 結(jié)論

將編碼參與SMV運動和影響宿主域范圍的P3蛋白基因 RNAi片段導入大豆基因組中, 轉(zhuǎn)基因大豆對SMV SC-3抗性水平較受體品種Williams 82和SN9顯著提高, 病情指數(shù)降低至4.37~18.51, 且抗性能夠穩(wěn)定遺傳, 表明RNAi介導SM-P3基因沉默能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因大豆抗SMV水平。

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RNAi-mediated SMV-P3 Silencing Increases Soybean Resistance to Soybean Mosaic Virus

YANG Xiang-Dong, NIU Lu, ZHANG Wei, YANG Jing, DU Qian, XING Guo-Jie, GUO Dong-Quan, LI Qi-Yun, and DONG Ying-Shan*

Agricultural Biotechnology Institute, Jilin Academy of Agricultural Sciences / Jilin Provincial Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, Changchun 130033, China

Soybean mosaic virus (SMV) is one of the most important diseases in major soybean production areas and has severe effects on soybean production and seed quality in China.Breeding disease-resistant varieties is the most economical and effective strategy to prevent and control SMV.In this study, RNAi fragments of the gene encoding P3 protein, which is involved in SMV mobility and affecting host range, were introduced into soybean by plant-mediated RNA interference (RNAi) techniques to explore the influence of RNAi-mediated SMV-P3 silencing on soybean SMV resistance.Southern blot analysis revealed that exogenous RNAi fragments were integrated into the soybean genome at low copy numbers (1–4).T1–T3generation transgenic soybeans were sprayed with herbicide and inserted fragments were examined using PCR.The results indicated that T-DNA insertion fragments could be stably inherited between generations of transgenic soybean.Inoculation of T2and T3generation transgenic soybeans with SMV suggested that transgenic soybeans exhibited significantly higher resistance to the prevailing SMV strain, SC-3, in major soybean production areas than the non-transgenic control varieties Williams 82 and SN9.The disease index was reduced by 4.37–18.51.Further, the resistance could be stably inherited.In conclusion, RNAi-mediated SMV-P3 silencing can significantly increase the SMV resistance of the transgenic soybean.

Soybean; Soybean mosaic virus; SMV-P3; RNAi-mediated gene silencing

10.3724/SP.J.1006.2016.01647

本研究由國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(2016ZX08004-004)和吉林省科技發(fā)展計劃項目(20150204011NY)資助。

This study was supported by the China National Major Project for Developing New GM Crops (2016ZX08004-004) and the Science & Technology Development Project of Jilin Province (20150204011NY)。

*通訊作者(Corresponding author): 董英山, E-mail: ysdong@cjaas.com, Tel: +86-431-87063008

聯(lián)系方式: E-mail: xdyang020918@126.com, Tel: +86-431-87063044

稿日期): 2016-02-16; Accepted(接受日期): 2016-06-20; Published online(

日期): 2016-07-04.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160704.0826.002.html