蔡深文徐仲瑞熊治廷，3王加真陳瑤

（1. 遵義師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，遵義 563002；2. 武漢大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，武漢 430079；3. 生物質(zhì)資源化學(xué)與環(huán)境生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079；4. 遵義師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遵義 563002）

海州香薷不同抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶基因EhvINV序列趨異及表達(dá)差異分析

蔡深文1，3徐仲瑞2熊治廷2，3王加真4陳瑤4

（1. 遵義師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，遵義 563002；2. 武漢大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，武漢 430079；3. 生物質(zhì)資源化學(xué)與環(huán)境生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430079；4. 遵義師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遵義 563002）

根據(jù)GenBank中海州香薷（Elsholtzia haichowensis）液泡轉(zhuǎn)化酶基因EhNvINV（JX500755）和EhCvINV（JX500756）的序列設(shè)計(jì)特異性引物，克隆cDNA全長(zhǎng)序列，并通過生物信息學(xué)分析基因及推導(dǎo)的蛋白序列，利用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模，并與蔗糖分子進(jìn)行模擬對(duì)接，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析EhNvINV和EhCvINV在銅脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。結(jié)果表明，海州香薷非抗性和抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白EhNvINV和EhCvINV在114和346處存在氨基酸趨異位點(diǎn)，模擬3D結(jié)構(gòu)相似，僅在趨異位點(diǎn)Glu114/ Gln114和Leu346/Pro346處有差別。EhNvINV、EhCvINV和模擬突變體（EhNvINV-E114Q和EhNvINV-L346P）與蔗糖分子對(duì)接形成的活性中心構(gòu)象基本一致，但在空間位置上存在細(xì)微差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明銅脅迫7 d后，EhCvINV的表達(dá)受銅的誘導(dǎo)，而EhNvINV受銅的抑制。

海州香薷；液泡轉(zhuǎn)化酶；銅脅迫；轉(zhuǎn)錄表達(dá)

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.021

生長(zhǎng)在重金屬污染土壤中的植物，其生長(zhǎng)受重金屬的脅迫，為了維持正常生長(zhǎng)代謝和重金屬抗性機(jī)制，必須獲得足夠的碳源和能量。在大多數(shù)高等植物中，產(chǎn)自葉的光合同化物以蔗糖的形式經(jīng)韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)到各個(gè)庫器官中［1］。庫器官對(duì)韌皮部蔗糖的卸載和利用促進(jìn)蔗糖向庫器官流動(dòng)，因此庫器官中與蔗糖卸載和利用相關(guān)的酶對(duì)調(diào)控同化物分配具有關(guān)鍵作用［2］，然而蔗糖必須通過蔗糖合酶或轉(zhuǎn)化酶水解為己糖才能被植物生長(zhǎng)代謝所利用。液泡轉(zhuǎn)化酶（vacuolar invertase，vINV），也稱作可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶，最適pH為酸性（pH5.0-5.5），在水解蔗糖和應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫等方面具有重要的作用［3］，研究表明液泡轉(zhuǎn)化酶參與低溫、低氧、水分脅迫等環(huán)境逆境的調(diào)控過程［4］。重金屬作為一種重要的環(huán)境脅迫因子，往往影響植物的生長(zhǎng)，但關(guān)于液泡轉(zhuǎn)化酶與重金屬脅迫之間的關(guān)系報(bào)道較少。

大多數(shù)植物在高濃度銅含量的土壤中無法生長(zhǎng)和繁殖，但某些植物在長(zhǎng)期的脅迫環(huán)境下進(jìn)化出銅抗性機(jī)制，能夠在銅礦區(qū)或銅污染的土壤中生存，海州香薷（Elsholtzia haichowensis）便是其中的代表性植物［5］。海州香薷在非礦區(qū)也有分布，但礦區(qū)種群比非礦區(qū)種群具有更高的銅抗性，這可能是由于銅礦區(qū)的海州香薷長(zhǎng)期生活在高濃度銅污染的環(huán)境下，發(fā)生了與銅污染相適應(yīng)的抗性進(jìn)化，形成了與非礦區(qū)種群不同的抗性生態(tài)型。海州香薷已逐漸成為研究植物銅吸收、耐性與解毒機(jī)理的模式植物，但其基因信息還較少報(bào)道，前期研究表明海州香薷兩個(gè)不同抗性種群的液泡轉(zhuǎn)化酶活性在銅脅迫下存在差異［6］，而酶活性通常與基因及其表達(dá)調(diào)控過程相關(guān)，因此研究海州香薷不同抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶基因編碼的蛋白信息及在銅脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對(duì)于進(jìn)一步深入研究銅脅迫下不同抗性種群酶活性差異的分子機(jī)制具有重要的參考意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料 海州香薷（E. haichowensis）種子分別采自湖北大冶銅綠山古銅礦遺址（抗性種群）和湖北紅安（非抗性種群）。水培14 d后剪取新鮮的根尖（約2 cm）用于RNA提取，水培及銅處理均在人工培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，光周期14 h光照、10 h黑暗，光照強(qiáng)度122 μmol·m-2s-1，溫度控制25/15℃。

1.1.2試劑 RNA提取使用的Trizol購自Invitrogen公司；PCR反應(yīng)所用的Ex Taq，dNTP mixture，pMD18-T載體，RNase Inhibitor，PrimeScript?RT reagent Kit（Perfect Real Time），SYBR?Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time），均購自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV RT購自Promega公司；DNA凝膠回收試劑盒和PCR清潔試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技有限公司；其他生化試劑購自丁香園生物技術(shù)有限公司，引物由上海博道生物技術(shù)公司合成，序列測(cè)定由華大基因完成。

1.2方法

1.2.1海州香薷總RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法提取兩個(gè)種群海州香薷根部的總RNA，具體操作步驟參照說明書。反轉(zhuǎn)錄酶與引物Oligo（dT）18引導(dǎo)cDNA第一鏈的合成。0.2 mL離心管中依次加入12.5 μL總RNA，3 μL Oligo（dT）18，11 μL DEPC處理的水，70℃溫浴5 min，迅速置于冰上冷卻，微離心收集溶液至離心管底部，再依次加入5×M-MLV RT Buffer 10 μL，RNase Inhibitor 1.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）10 μL，M-MLV RT 2 μL，用移液槍吸打混勻，42℃反應(yīng)60 min，70℃溫浴10 min失活反轉(zhuǎn)錄酶，冰上分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2EhNvINV和EhCvINVcDNA全長(zhǎng)序列克隆 根據(jù)GenBank中海州香薷非抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶基因EhNvINV（JX500755）和抗性種群轉(zhuǎn)化酶基因EhCvINV（JX500756）序列，設(shè)計(jì)特異性引物V-FullF和V-FullR（表1）。以反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL：10× Ex Taq Buffer（Mg2+plus）2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）1 μL，PrimerF 1 μL，PrimerR 1 μL，cDNA 1μL，Ex Taq 0.2 μL，ddH2O 13.8 μL。全長(zhǎng)PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，50℃退火15 s，72℃延伸2 min，32個(gè)循環(huán)72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR檢測(cè)和陽性克隆測(cè)序。

表1　海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶基因cDNA全長(zhǎng)克隆及RT-PCR引物

1.2.3基因序列分析 使用NCBI網(wǎng)站的BLAST在線軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）進(jìn)行海州香薷兩個(gè)種群液泡轉(zhuǎn)化酶基因全長(zhǎng)序列的同源性比對(duì)分析與相似性搜索。使用ClustalX軟件將海州香薷和其他物種液泡轉(zhuǎn)化酶基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)［7］。使用MEGA4.1軟件構(gòu)建海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶基因的無根系統(tǒng)進(jìn)化樹［8］。

1.2.4蛋白結(jié)構(gòu)分析 使用在線ExPASy序列分析工具（http：//au.expasy.org/tools/）對(duì)推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析，ProtParam分析蛋白的氨基酸序列組成、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)。將海州香薷兩個(gè)種群液泡轉(zhuǎn)化酶的氨基酸序列提交至在線分析工具SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行同源建模，選擇擬南芥（Arabidopsis thaliana）酸性轉(zhuǎn)化酶基因AtcwINV1的3D蛋白結(jié)構(gòu)（PDB：2AC1，www.pdb.org）為模板，預(yù)測(cè)海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白EhNvINV和EhCvINV的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.5分子模擬對(duì)接 海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白與蔗糖分子的模擬對(duì)接采用自動(dòng)對(duì)接軟件AutoDock4.0完成。蔗糖分子結(jié)構(gòu)來自于MMsINC數(shù)據(jù)庫（http：// mms.dsfarm.unipd.it/MMsINC/）。選擇液泡轉(zhuǎn)化酶活性中心的GLU299設(shè)置為柔性殘基。蛋白分子和蔗糖分子在對(duì)接過程中同時(shí)被賦予Geister Huckel電荷，Grid大小設(shè)置為26×28×28（x、y和z），格點(diǎn)間隔為默認(rèn)值0.375 ?，Grid中心坐標(biāo)設(shè)置為74.158，112.502，-4.938（x、y和z）。Number of GA Runs設(shè)置為30，其他參數(shù)均使用系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)。對(duì)接過程使用拉馬克遺傳算法（lamarckian genetic algorithm，LGA）對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行搜索和能量評(píng)價(jià)，選擇結(jié)合自由能最低的構(gòu)象為最終的結(jié)合模式。同源模擬生成的PDB文件以及分子對(duì)接結(jié)果均使用PyMOL軟件顯示和分析。

1.2.6Real-time PCR反應(yīng) 根據(jù)海州香薷EhNvINV和EhCvINV基因的序列，設(shè)計(jì)Real-time PCR的上下游引物V-rtF和V-rtR（表1）。以EhACT為內(nèi)參基因［9］，設(shè)計(jì)定量PCR引物Actin-F和Actin-R（表1）。使用StepOneTMReal-Time PCR System（Applied Bio-systems，USA）分析EhNvINV和EhCvINV在銅脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。幼苗水培10 d后進(jìn)行銅處理，銅處理設(shè)對(duì)照組（不加銅）和處理組（加10 μmol/L Cu2+），Cu2+以CuCl2·2H2O的形式加入營(yíng)養(yǎng)液中。銅分別處理1 d和7 d后收獲植物，RNA提取方法同上所述，按照PrimeScript?RT reagent Kit說明書的步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，染料使用SYBR?Green I（TaKaRa，Japan）。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30 s后，用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，即95℃變性5 s，60℃退火和延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，PCR擴(kuò)增結(jié)束后作60-95℃的熔解曲線。所有Real-time PCR試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)操作重復(fù)。結(jié)果表示為樣品基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量相對(duì)于非抗性種群對(duì)照組表達(dá)量的倍數(shù)。反應(yīng)結(jié)束后收集Ct值，基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

2　結(jié)果

2.1海州香薷總RNA提取

海州香薷根中的總RNA經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)呈現(xiàn)3條清晰的條帶，其中28S rRNA的亮度約為18S rRNA的兩倍，5S rRNA亮度較低，無明顯降解，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品OD260/OD280的平均值為1.91，表明所提取的總RNA質(zhì)量較好，可用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

2.2海州香薷EhNvINV和EhCvINV基因序列分析

PCR擴(kuò)增分別得到約1 900 bp大小條帶，經(jīng)測(cè)序，非抗性和抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶基因的開放閱讀框均為1 914 bp，編碼637個(gè)氨基酸，EhNvINV和EhCvINV的核苷酸序列相似性為98.80%，編碼的氨基酸序列相似性為99.69%。海州香薷與NCBI上公布的其他部分雙子葉植物液泡轉(zhuǎn)化酶氨基酸推導(dǎo)序列的同源性比較，見表2。海州香薷與胡蘿卜（Daucus carota）和咖啡（Coffea canephora）的相似性最高，達(dá)75%。

表2　海州香薷非礦區(qū)種群與其他物種液泡轉(zhuǎn)化酶氨基酸推導(dǎo)序列的同源性比較

海州香薷與部分其他物種液泡轉(zhuǎn)化酶基因推導(dǎo)的氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果，見圖1。EhNvINV和EhCvINV均具有植物液泡轉(zhuǎn)化酶的13個(gè)保守區(qū)域，其中包括液泡轉(zhuǎn)化酶的兩個(gè)最為保守的特征序列β-呋喃果糖苷基序（NDPN）和半胱氨酸殘基催化區(qū)（WECVD），EhNvINV和EhCvINV具有5個(gè)糖基化位點(diǎn)（NXS/T）。兩個(gè)不同抗性種群的液泡轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列存在趨異位點(diǎn)，EhNvINV的第114和346位氨基酸分別為Glu和Leu，而EhCvINV對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸為Gln和Pro。這些趨異位點(diǎn)都位于13個(gè)保守區(qū)域外。

為進(jìn)一步證實(shí)所克隆的基因?qū)儆诤Ｖ菹戕敢号蒉D(zhuǎn)化酶基因，構(gòu)建了與其他物種液泡轉(zhuǎn)化酶、細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的無根進(jìn)化樹。結(jié)果（圖2）顯示，進(jìn)化樹分為4個(gè)類群，分別為（Ⅰ）果糖基轉(zhuǎn)移酶、（Ⅱ）單子葉植物液泡轉(zhuǎn)化酶、（Ⅲ）雙子葉植物液泡轉(zhuǎn)化酶、（Ⅳ）雙子葉植物細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶。EhNvINV和EhCvINV屬于雙子葉植物液泡壁轉(zhuǎn)化酶。

2.3海州香薷EhNvINV和EhCvINV蛋白基本特征

兩個(gè)種群海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白的氨基酸組成基本一致，天冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）和纈氨酸（Val）含量較高，均高于6%，無吡咯賴氨酸（Pyl）和含硒半胱氨酸（Sec）（圖3）。推導(dǎo)的非抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白

原子總數(shù)為9 933個(gè)，分子式C3226H4910N822O964S11，分子量為70.986 kD，理論等電點(diǎn)為4.89?？剐苑N群液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白原子總數(shù)為9 929個(gè)，分子式C3225H4907N823O963S11，分子量為70.969 kD，理論等電點(diǎn)為4.91。

2.4海州香薷EhNvINV和EhCvINV蛋白3D結(jié)構(gòu)

非抗性和抗性種群海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白的3D結(jié)構(gòu)相似，僅在趨異位點(diǎn)Glu114/Gln114和Leu346/Pro346處有細(xì)微的差別，如圖4所示。液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白由N-末端類似螺旋槳形狀的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)域和C-末端的β-折疊區(qū)組成，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)較短的α螺旋連接。其中N-末端的結(jié)構(gòu)域由5個(gè)β轉(zhuǎn)角組成，主要負(fù)責(zé)與底物蔗糖結(jié)合，是酶的催化中心，C-末端的結(jié)構(gòu)域由2組反向平行的β折疊組成。

2.5海州香薷EhNvINV和EhCvINV蛋白模擬突變與分子對(duì)接

本研究從液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白與底物結(jié)合的角度進(jìn)行了計(jì)算機(jī)模擬分析，以EhNvINV為基礎(chǔ)，在兩個(gè)種群間的趨異位點(diǎn)處進(jìn)行模擬定點(diǎn)突變，獲得突變體酶蛋白分子EhNvINV-E114Q和EhNvINV-L346P，并分別與蔗糖分子進(jìn)行對(duì)接。首先使用擬南芥酸性轉(zhuǎn)化酶蛋白AtcwINV1（PDB ID：2AC1）［10］、突變體AtcwINV1-E203Q（PDB ID：2OXB）、AtcwINV1-E203A（PDB ID：2QQV）和AtcwINV1-D239A（PDB ID：2QQU）［11］的晶體結(jié)構(gòu)模型檢測(cè)海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白與蔗糖的對(duì)接程序，確保對(duì)接結(jié)果的可靠性。

液泡轉(zhuǎn)化酶與蔗糖分子的對(duì)接模擬結(jié)果（圖5）顯示，蔗糖分子在EhNvINV和EhCvINV催化活性中心的構(gòu)象基本一致，呋喃果糖環(huán)上的氧原子O6分別與Q136上的OE1和W144上的NE1，O4分別與T180上的N和D244上的OD1，O3分別與D244上的OD2、R243上的NE和E299上的OE2，O2與N119上的ND2，O1與D120上的OD1之間形成氫鍵相互作用。吡喃葡萄糖環(huán)上的O2與E299上的OE2，O3與D332上的OD2之間也形成了氫鍵相互作用，使蔗糖分子穩(wěn)定地結(jié)合在液泡轉(zhuǎn)化酶的催化活性中心。

突變體EhNvINV-E114Q和蔗糖分子的對(duì)接構(gòu)象與EhNvINV基本一致，而對(duì)于EhNvINV-L346P，與EhNvINV和蔗糖分子的對(duì)接構(gòu)象相比較，呋喃果糖環(huán)上的氧原子O6與W144上的NE1，O3與R243上的NE無氫鍵相互作用，而O4與Q136上的OE1，O1與N119上的ND2之間具有氫鍵相互作用。EhNvINV、EhCvINV、EhNvINV-E114Q、EhNvINVL346P與蔗糖分子的對(duì)接模型表明蔗糖分子在酶活性中心的空間位置上存在細(xì)微差異，計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接的結(jié)合能差異較?。ū?），分別為-6.03 kcal/ mol、-6.00 kcal/mol、-6.04 kcal/mol和-5.99 kcal/mol。

圖1　海州香薷與其他物種液泡轉(zhuǎn)化酶氨基酸序列的多重比對(duì)結(jié)果

2.6銅脅迫下海州香薷EhNvINV和EhCvINV基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異

銅脅迫下海州香薷EhNvINV和EhCvINV基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量如圖6所示，銅處理1 d后，與對(duì)照組相比，海州香薷EhNvINV基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量顯著升高（P ＜ 0.05），銅脅迫下，EhNvINV的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量顯著高于EhCvINV（P ＜ 0.05）。銅處理7 d后，EhNvINV基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與對(duì)照組無顯著表達(dá)差異，而EhCvINV基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著升高（P ＜ 0.05），且比EhNvINV基因在銅脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量高約4.5倍。

圖2　海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶與其他植物酸性轉(zhuǎn)化酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的無根進(jìn)化樹分析

圖3　海州香薷非抗性和抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白氨基酸組成

3　討論

圖4　海州香薷兩個(gè)種群液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白模擬3D結(jié)構(gòu)

本研究克隆的EhNvINV和EhCvINV具有植物液泡轉(zhuǎn)化酶基因的多個(gè)保守序列（圖1），包括β-呋喃果糖苷酶（NDPN）和催化區(qū)域的重要組成部分（WECP/VD）這兩個(gè)最為保守的特征基序。幾乎所有高等植物的液泡轉(zhuǎn)化酶在催化區(qū)域的保守位點(diǎn)上都有一個(gè)纈氨酸（V）［12］，海州香薷非抗性和抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶（EhNvINV和EhCvINV）也同樣如此。植物酸性轉(zhuǎn)化酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的同源性較高，具有相同的保守區(qū)域，如蔗糖結(jié)合基序、RDP基序和EC基序［13］。但液泡轉(zhuǎn)化酶與細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶和果糖基轉(zhuǎn)移酶的區(qū)別主要在于前者具有一些典型的特征序列，如所有雙子葉植物和大部分單子葉植物的液泡轉(zhuǎn)化酶在前肽區(qū)域具有一個(gè)保守序列R［G/A/P］XXXGVS［E/D/M］K，所有已知的液泡轉(zhuǎn)化酶在成熟蛋白起始位點(diǎn)附近有一個(gè)保守序列WXXX［M/IV］LXWQ［14］。EhNvINV和EhCvINV具有這兩個(gè)保存序列RGVAQGVSEK（第74-83位氨基酸）和WTNVMLSWQ（第97-105位氨基酸）。分子進(jìn)化樹分析也表明EhNvINV和EhCvINV屬于雙子葉植物液泡轉(zhuǎn)化酶基因家族成員。

表3　海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶及模擬突變體與蔗糖對(duì)接的最佳結(jié)合能

圖5　海州香薷細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶蛋白及模擬突變體與蔗糖的對(duì)接模型示意圖

圖6　銅處理1 d和7 d后海州香薷兩個(gè)種群根中EhNvINV和EhCvINV基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量

海州香薷非抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶EhNvINV與抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶EhCvINV的氨基酸序列存在兩個(gè)趨異位點(diǎn)，這可能是由于抗性種群長(zhǎng)期生活在銅脅迫下發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化。研究表明氨基酸序列的改變可能會(huì)導(dǎo)致蛋白活性的改變，如Ritsema等［15］報(bào)道，替換洋蔥（Allium cepa）液泡轉(zhuǎn)化酶中的33個(gè)氨基酸（第143-175位），將會(huì)使液泡轉(zhuǎn)化酶的蛋白活性從水解蔗糖變?yōu)樘腔D(zhuǎn)移（把蔗糖轉(zhuǎn)換成果聚糖）。NDPN基序和EC基序在轉(zhuǎn)化酶中高度保守，如果將Asp23替換為Asn23，或者將Glu203替換為Ala203，轉(zhuǎn)化酶將失去活性［16］。除高度保守的NDPN、RDP和EC基序外，其附近的氨基酸殘基Trp82、Asp239和Lys242對(duì)于底物分子結(jié)合的穩(wěn)定性也具有重要意義，這些位點(diǎn)的突變將改變轉(zhuǎn)化酶水解蔗糖的活性參數(shù)，如Km和Kcat值［11，17，18］。海州香薷液泡轉(zhuǎn)化酶EhNvINV和EhCvINV對(duì)應(yīng)的NDPN、EC和RDP基序中3個(gè)保守的同源氨基酸分別為Asp120、Asp244和Glu299。AtcwINV1的Trp82、Asp239和Lys242同氨基酸在EhNvINV和EhCvINV中分別為Trp144、Asp332和Lys335，EhNvINV和EhCvINV的趨異氨基酸位點(diǎn)均不在上述活性位點(diǎn)或其附近。

EhNvINV和EhCvINV的2個(gè)趨異位點(diǎn)雖然不在活性中心，但Glu114/Gln114靠近活性中心，且Glu114/Gln114緊鄰保守區(qū)域YHFQP（109-113）和WMNDPNGP（117-124）。這些氨基酸殘基結(jié)構(gòu)的差異可能會(huì)導(dǎo)致其臨近區(qū)域的蛋白構(gòu)象發(fā)生細(xì)微改變，而這種細(xì)微改變可能會(huì)影響到蛋白的穩(wěn)定性或活性。在玉米（Zea mays）細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶INCW2中，C末端的一個(gè)胞嘧啶突變?yōu)樾叵汆奏?dǎo)致Pro變?yōu)長(zhǎng)eu，盡管這個(gè)突變位點(diǎn)不在催化活性中心（WECPD），不在糖基化位點(diǎn)，也不在β-呋喃果糖基序（NDPNG）中，但突變使INCW2的蛋白活性在Incw2轉(zhuǎn)錄正常的情況下僅為正常值的6%，這可能是由于該位點(diǎn)的Pro被替換后降低了整個(gè)蛋白的穩(wěn)定性［19］。計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果（圖4）顯示，海州香薷不同抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶的趨異位點(diǎn)未造成蛋白構(gòu)象的顯著差異，分子對(duì)接結(jié)果表明EhNvINV和EhCvINV與蔗糖分子的結(jié)合構(gòu)象基本一致，且與蔗糖分子對(duì)接的結(jié)合能差異較小，可能趨異的氨基酸位點(diǎn)對(duì)活性中心的構(gòu)象沒有產(chǎn)生影響。然而蔗糖分子與液泡轉(zhuǎn)化酶蛋白催化活性中心氨基酸之間的空間距離具有細(xì)微差異（圖5），這種細(xì)微差別可能是由于趨異氨基酸的結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致其附近的氨基酸殘基的構(gòu)象發(fā)生了改變，盡管這種改變很小，但也可能會(huì)傳遞至活性中心的氨基酸，從而使活性中心底物結(jié)合的口袋構(gòu)象表現(xiàn)出細(xì)微的差異，這種構(gòu)象上的細(xì)微差異是否會(huì)導(dǎo)致不同種群間液泡轉(zhuǎn)化酶的活性表現(xiàn)出顯著差異還需實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果（圖6）表明，銅脅迫1 d后EhNvINV的表達(dá)顯著高于EhCvINV，這可能是由于非抗性種群在受到銅脅迫后產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)液泡轉(zhuǎn)化酶大量表達(dá)。銅脅迫7 d后，EhNvINV基因的表達(dá)受到抑制，這可能與液泡轉(zhuǎn)化酶受多種脅迫調(diào)控相關(guān)。液泡轉(zhuǎn)化酶基因的表達(dá)會(huì)受到外界環(huán)境條件的抑制，如小麥（Triticum aestivum）在受到短暫的缺水脅迫后，其花藥的液泡轉(zhuǎn)化酶基因Ivr5在雄性減數(shù)分裂期下調(diào)表達(dá)［20］。玉米子房在干旱脅迫下也表現(xiàn)出液泡轉(zhuǎn)化酶mRNA表達(dá)量下降［21］。銅脅迫7 d后EhCvINV表達(dá)量顯著升高，這可能是因?yàn)榭剐苑N群在長(zhǎng)期的銅脅迫環(huán)境下進(jìn)化的抗性機(jī)制使之與非抗性種群的液泡轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)存在差異。由于在銅脅迫下抗性種群的海州香薷需要大量的己糖提供碳源和能量用于維持脅迫響應(yīng)，液泡轉(zhuǎn)化酶基因可能在銅脅迫條件下對(duì)海州香薷的微進(jìn)化過程中起著輔助基因的作用。因此，在海州香薷定居銅綠山高濃度銅含量環(huán)境的進(jìn)化過程中，銅脅迫誘導(dǎo)作用可能強(qiáng)化了液泡轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)的水平，從而使EhCvINV的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量高于EhNvINV。環(huán)境脅迫抗性植物通常通過上調(diào)表達(dá)酸性轉(zhuǎn)化酶基因，產(chǎn)生更多的小分子碳水化合物（葡萄糖和果糖）作為碳源和能量用于適應(yīng)環(huán)境脅迫。如耐低溫水稻品種R31的細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶基因OSINV4表達(dá)不會(huì)受到低溫的抑制［22］。液泡轉(zhuǎn)化酶基因在銅脅迫下的表達(dá)差異不僅在海州香薷的兩個(gè)不同抗性種群中表現(xiàn)，在羊蹄［23］和齒果酸模［24］中也有報(bào)道，均表現(xiàn)為非抗性種群的液泡轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)受到銅的抑制，而抗性種群受銅的誘導(dǎo)。

4　結(jié)論

本研究克隆的EhNvINV和EhCvINV基因?qū)儆谝号蒉D(zhuǎn)化酶基因家族成員，推導(dǎo)的蛋白序列存在2個(gè)氨基酸趨異位點(diǎn)，其中非抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶EhNvINV在114和346位分別為谷氨酸和亮氨酸，而抗性種群液泡轉(zhuǎn)化酶EhCvINV在這兩個(gè)位點(diǎn)分別為谷氨酰胺和脯氨酸。

同源模擬表明二者的3D結(jié)構(gòu)相似，僅在趨異位點(diǎn)Glu114/Gln114和Leu346/Pro346處有細(xì)微的差別。EhNvINV、EhCvINV和模擬突變體（EhNvINVE114Q和EhNvINV-L346P）與蔗糖分子對(duì)接形成的活性中心構(gòu)象基本一致，但在空間位置上存在細(xì)微差異，這些結(jié)構(gòu)上的差異可能是造成兩個(gè)種群細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶活性差異的原因之一。

銅脅迫7 d后，EhCvINV的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量顯著高于EhNvINV，可能是抗性種群在長(zhǎng)期的銅脅迫環(huán)境下進(jìn)化的抗性機(jī)制需要更多的己糖提供碳源和能量來維持。

［1］Rolland F， Baena-Gonzalez E， Sheen J. Sugar sensing and signaling in plants：conserved and novel mechanisms［J］. Annual Review of Plant Biology， 2006， 58（1）：675-709.

［2］Koch K. Sucrose metabolism：regulatory mechanisms and pivotal roles in sugar sensing and plant development［J］. Current Opinion in Plant Biology， 2004， 7（3）：235-246.

［3］Ruan YL， Jin Y， Yang YJ， et al. Sugar input， metabolism， and signaling mediated by invertase：roles in development， yield potential， and response to drought and heat［J］. Molecular Plant，2010， 3（6）：942-955.

［4］Albacete A， Grosskinsky DK， Roitsch T. Trick and treat：a review on the function and regulation of plant invertases in the abiotic stress response［J］. Phyton， 2011， 50（2）：181-204.

［5］Liu J， Xiong Z. Differences in accumulation and physiological response to copper stress in three populations of Elsholtzia haichowensis S［J］. Water， Air， and Soil Pollution， 2005， 168（1-4）：5-16.

［6］Cai SW， Xiong ZT， Li L， et al. Differential responses of root growth， acid invertase activity and transcript level to copper stress in two contrasting populations of Elsholtzia haichowensis［J］. Ecotoxicology， 2014， 23（1）：76-91.

［7］Thompson JD， Gibson TJ， Plewniak F， et al. The CLUSTAL_ X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality qnalysis tools［J］. Nucleic Acids Research， 1997， 25（24）：4876-4882.

［8］Tamura K， Dudley J， Nei M， et al. MEGA4：molecular evolutionary genetics analysis（MEGA）software version 4.0［J］. Molecular Biology and Evolution， 2007， 24（8）：1596-1599.

［9］蔡深文， 熊治廷， 劉晨， 等. 海州香薷Actin基因片段克隆及表達(dá)分析［J］. 生物技術(shù)通報(bào)， 2015， 31（2）：111-115.

［10］Verhaest M， Lammens W， Le Roy K， et al. X-ray diffraction structure of a cell-wall invertase from Arabidopsis thaliana［J］. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography， 2006，62（12）：1555-1563.

［11］Lammens W， Le Roy K， Van Laere A， et al. Crystal structures of Arabidopsis thaliana cell-wall invertase mutants in complex with sucrose［J］. Journal of Molecular Biology， 2008， 377（2）：378-385.

［12］Tymowska-Lalanne Z， Kreis M. The plant invertases：physiology，biochemistry and molecular biology［J］. Advances in Botanical Research， 1998， 28（3）：71-117.

［13］Ritsema T， Smeekens SCM. Engineering fructan metabolism in plants［J］. Journal of Plant Physiology， 2003， 160（7）：811-820.

［14］Van den Ende W， Michiels A， Le Roy K， et al. Cloning of a vacuolar invertase from Belgian endive leaves（Cichorium intybus）［J］. Physiologia Plantarum， 2002， 115（4）：504-512.

［15］Ritsema T， Hernandez L， Verhaar A， et al. Developing fructansynthesizing capability in a plant invertase via mutations in the sucrose-binding box［J］. Plant Journal， 2006， 48（2）：228-237.

［16］Goetz M， Roitsch T. Identification of amino acids essential for enzymatic activity of plant invertases［J］. Journal of Plant Physiology， 2000， 157（5）：581-585.

［17］Le Roy K， Lammens W， Verhaest M， et al. Unraveling the difference between invertases and fructan exohydrolases：A single mmino acid（Asp-239）substitution transforms Arabidopsis cell wall invertase1 into a fructan 1-exohydrolase［J］. Plant Physiology， 2007， 145（3）：616-625.

［18］Mátrai J， Lammens W， Jonckheer A， et al. An alternate sucrose binding mode in the E203Q Arabidopsis invertase mutant：An X-ray crystallography and docking study［J］. Proteins：Structure，F(xiàn)unction， and Bioinformatics， 2008， 71（2）：552-564.

［19］Carlson SJ， Shanker S， Chourey PS. A point mutation at the Miniature1 seed locus reduces levels of the encoded protein， but not its mRNA， in maize［J］. Molecular and General Genetics MGG， 2000， 263（2）：367-373.

［20］Koonjul PK， Minhas JS， Nunes C， et al. Selective transcriptional down-regulation of anther invertases precedes the failure of pollen development in water-stressed wheat［J］. Journal of Experimental Botany， 2005， 56（409）：179-190.

［21］Andersen MN， Asch F， Wu Y， et al. Soluble invertase expression is an early target of drought stress during the critical， abortionsensitive phase of young ovary development in maize［J］. Plant Physiology， 2002， 130（2）：591-604.

［22］Oliver SN， Van Dongen JT， Alfred SC， et al. Cold-induced repression of the rice anther-specific cell wall invertase gene OSINV4 is correlated with sucrose accumulation and pollen sterility［J］. Plant， Cell and Environment， 2005， 28（12）：1534-1551.

［23］Huang WX， Cao Y， Huang LJ， et al. Differential expression of acid invertase genes in roots of metallicolous and non-metallicolous populations of Rumex japonicus under copper stress［J］. Chemosphere， 2011， 84（10）：1432-1439.

［24］Cai SW， Huang WX， Xiong ZT， et al. Comparative study of root growth and sucrose-cleaving enzymes in metallicolous and nonmetallicolous populations of Rumex dentatus under copper stress［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2013， 98（11）：95-102.

（責(zé)任編輯 李楠）

Sequence Divergence and Analysis of Expression Difference of Vacuolar Invertase Gene EhvINV from Different Resistant Populations in Elsholtzia haichowensis

CAI Shen-wen1，3XU Zhong-rui2XIONG Zhi-ting2，3WANG Jia-zhen4CHEN Yao4
（1. College of Resources and Environment，Zunyi Normal College，Zunyi 563002；2. School of Resource and Environmental Sciences，Wuhan University，Wuhan 430079；3. Hubei Biomass-Resource Chemistry and Environmental Biotechnology Key Laboratory，Wuhan 430079；4. College of Life Science，Zunyi Normal College，Zunyi 563002）

Specific primers were designed to clone the cDNA sequences according to the EhNvINV（JX500755）and EhCvINV（JX500756）from GenBank. The DNA and deduced amino acid sequences were analyzed by bioinformatics methods. The three-dimensional structures were constructed by homologous modeling. The structures of vacuolar invertase from two populations of E. haichowensis and nontolerant population with each single point mutation in complex with sucrose were simulated by AutoDock 4.0. Transcript expression of EhNvINV and EhCvINV under copper tress was analyzed by real-time PCR. The results showed that there were two divergent amino acids at position 114 and 346 between EhNvINV and EhCcINV. The three-dimensional structures were exactly similar between EhNvINV and EhCvINV. It showed difference at Glu114/Gln114 and Leu346/Pro346，which were divergent sites. The structures of catalytic active center of EhNvINV，EhCvINV，and simulated mutants（EhNvINV-E114Q，EhNvINV-L346P）binding with sucrose showed no significant differences. However，there were differences on spatial position. The result of real-time PCR indicated that the transcript expression of EhCvINV induced by copper stress after 7 days，however，the transcript expression of EhNvINV inhibited by copper stress after 7 days.

Elsholtzia haichowensis；vacuolar invertase；copper stress；transcript expression

2016-04-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21477093，31270432），生物質(zhì)資源化學(xué)與環(huán)境生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（HBRCEBL-2013-2014004），遵義師范學(xué)院博士基金項(xiàng)目（遵師BS［2014］20號(hào)）

蔡深文，男，博士，副教授，研究方向：環(huán)境生物學(xué)；E-mail：caishenwen@163.com