蘇艷張亦弛胡德活鄭會全

（1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣州 510642；2. 廣東省林業(yè)科學(xué)研究院 廣東省森林病蟲害生物防治重點實驗室，廣州 510520）

杉木無性系耐旱分析及SRAP種質(zhì)鑒別

蘇艷1張亦弛1胡德活2鄭會全2

（1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣州 510642；2. 廣東省林業(yè)科學(xué)研究院 廣東省森林病蟲害生物防治重點實驗室，廣州 510520）

旨在測評杉木［Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook］優(yōu)良無性系耐旱性，并建立精準(zhǔn)DNA數(shù)字指紋圖譜，為無性系推廣應(yīng)用與品種保護(hù)提供依據(jù)。測定無性系在PEG-6000模擬干旱下的生理生化指標(biāo)，運(yùn)用隸屬函數(shù)法綜合評價耐旱性；利用SRAP技術(shù)進(jìn)行無性系種質(zhì)鑒別。結(jié)果顯示，參試杉木無性系在干旱脅迫條件下葉片相對含水量、丙二醛和脯氨酸含量、超氧化物歧化酶和過氧化物酶及過氧化氫酶活性均發(fā)生不同程度變化，綜合調(diào)控模式也存在一定程度差異，無性系耐旱性綜合排序為：T-c01 ＞ T-c22 ＞ T-cF1 ＞ T-c07 ＞ T-c04 ＞ T-c08。16對SRAP引物組合共擴(kuò)增到131個清晰、穩(wěn)定譜帶，多態(tài)性比例66.8%，基于此構(gòu)建了無性系DNA-SRAP 數(shù)字指紋圖譜。杉木無性系耐旱性存在差異，T-c01 耐旱性較強(qiáng)，T-c08耐旱性較弱；利用SRAP引物組合Me1/Em1+Me4/Em21+Me11/Em5可快速鑒別各無性系，置信概率99.99998%。

杉木；耐旱性；分子多態(tài)性；指紋圖譜

DOI：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.10.026

杉木［Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook］是中國特有的造林與用材樹種，具有速生、材質(zhì)優(yōu)良、用途廣等特點［1，2］。近年來，國內(nèi)多個科研院所、高校甚至是地方林業(yè)生產(chǎn)單位不斷強(qiáng)化杉木優(yōu)良無性系選育與快繁技術(shù)研究并取得可喜的進(jìn)展。為提高繁育系數(shù)，一些研究團(tuán)隊還探索建立了適于杉木無性系擴(kuò)繁的組織培養(yǎng)技術(shù)，為其規(guī)?；庇c推廣奠定了基礎(chǔ)［3-6］。然而，為更好地應(yīng)用這些組培無性系，有必要對它們的抗逆特性尤其是耐旱性進(jìn)行綜合測評。目前，有關(guān)杉木優(yōu)良無性系耐旱性/抗旱性評價的報道尚少［7-8］。

不同杉木無性系形態(tài)相近，依靠形態(tài)特征難以對無性系種質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確地鑒別，而利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建不同無性系指紋圖譜是進(jìn)行種質(zhì)鑒別最有效的手段。目前，適于杉木遺傳多態(tài)性研究的DNA標(biāo)記技術(shù)包括RAPD（random amplified polymorphic DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism）、ISSR（inter simple sequence repeat）、SSR（simple sequence repeat）以及SRAP（sequencerelated amplified polymorphism）等［9］。其中，針對功能序列擴(kuò)增的SRAP技術(shù)具有簡單、高效、穩(wěn)定、部分共顯性、擴(kuò)增片段易測序等特點，優(yōu)勢明顯［9-12］，但利用SRAP技術(shù)構(gòu)建杉木無性系指紋圖譜以進(jìn)行種質(zhì)鑒別的研究尚未見報道。

本研究以6個杉木優(yōu)良無性系組培移栽苗為試材，采用聚乙二醇（PEG-6000）溶液培養(yǎng)法模擬干旱脅迫，對不同無性系耐旱相關(guān)生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定分析并運(yùn)用隸屬函數(shù)法對參試無性系耐旱性作出綜合評價，以期為耐旱無性系的選用提供參考。同時，利用SRAP技術(shù)對無性系DNA分子多態(tài)性進(jìn)行檢測并構(gòu)建不同無性系的DNA-SRAP數(shù)字指紋圖譜，為無性系種質(zhì)鑒別及品種保護(hù)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

以廣東省林業(yè)科學(xué)研究院選育的6個杉木優(yōu)良無性系組培移栽苗（無性系編號：T-c01、T-c04、T-c07、T-c08、T-c22、T-cF1）為試材，苗齡1年，培養(yǎng)基質(zhì)為新鮮黃心土，苗木生長勢較為一致。

1.2方法

1.2.1模擬干旱處理 參考李樹斌等［8］的方法。將參試苗木從基質(zhì)中除出，用清水將根部洗凈，隨后移入盛有1/2 Hoagland營養(yǎng)液的塑料桶（外壁套上黑色塑料袋）內(nèi)水培馴化2 d。隨后，將試驗苗木移入到-2.0 MPa聚乙二醇（PEG-6000）溶液（用1/2Hoagland 營養(yǎng)液配制PEG-6000溶液，PEG-6000濃度為300 g/L）進(jìn)行模擬干旱脅迫處理（T），每個無性系苗木處理3個重復(fù)，每個重復(fù)3株苗，同時以1/2 Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)的苗木作為對照。處理和對照試樣在23℃、光周期為16/8 h光照/黑暗的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后，部分無性系出現(xiàn)脫水萎蔫現(xiàn)象，剪取每個重復(fù)苗木株高1/2以上部分的葉片，將每個重復(fù)3株苗木葉片進(jìn)行混合作為1個待測樣品，隨后進(jìn)行各項生理生化指標(biāo)測定。

1.2.2生理生化指標(biāo)測定 葉片相對含水量（RWC）測定即稱取鮮葉質(zhì)量后用蒸餾水浸泡24 h，隨后稱飽和鮮質(zhì)量，最后105℃下烘干，稱干質(zhì)量，根據(jù)公式計算RWC。RWC =［（鮮葉質(zhì)量-干質(zhì)量）/（飽和鮮質(zhì)量-干質(zhì)量）］×100%。丙二醛（MDA）含量、脯氨酸（PRO）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性測定均采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒進(jìn)行，具體操作步驟參考說明書。

《孫子兵法·虛實篇》中提出“夫兵形象水，水之形，避高而趨下；兵之形，避實而擊虛?！痹趹?zhàn)爭中，“實”和“虛”實戰(zhàn)爭中的兩種基本態(tài)勢。如：防守堅固時就是“實”；防守薄弱就是“虛”；人數(shù)和兵力占優(yōu)的時候就是“實”，反之就是“虛”；進(jìn)攻的火力強(qiáng)大就是“實”，進(jìn)攻的火力薄弱就是“虛”。這種“實”和“虛”實相對的，并在一定條件下互相轉(zhuǎn)化的。所以善戰(zhàn)者首先要理清“實”和“虛”的辯證關(guān)系和轉(zhuǎn)化條件，并且做好針對性的部署才能取得最終的勝利。

1.2.3基因組總DNA提取 采用天根生化科技（北京）有限公司提供的新型植物基因組DNA提取試劑盒（DNAsecure Plant Kit）提取杉木無性系葉片基因組總DNA，具體操作步驟參考說明書。采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定DNA的質(zhì)量和濃度，并將濃度稀釋至100 ng/μL，于-20℃冰箱內(nèi)保存、備用。

1.2.4SRAP-PCR擴(kuò)增 采用前期建立的適于杉木SRAP-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系及引物進(jìn)行［12］，反應(yīng)體系25 μL，包括0.5 μL基因組總DNA（約50 ng）溶液、0.5 μL上游引物（10 μmol/L）、0.5 μL下游引物（10μmol/L）、12.5 μL 2 × Taq Plus PCR MasterMix（購自天根生化科技有限公司）及11 μL雙蒸水。擴(kuò)增程序參照Li和Quiros［10］的通用程序進(jìn)行，即94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，5個循環(huán)；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保溫。PCR擴(kuò)增完畢后，以D2000 DNA Marker（購自天根生化科技有限公司）為參照，對擴(kuò)增產(chǎn)物作2%（g/v）瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外凝膠成像系統(tǒng)顯示結(jié)果，并照相記錄。

1.2.5數(shù)據(jù)處理與分析 采用Excel 2010和SAS v8.1軟件對生理生化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。應(yīng)用隸屬函數(shù)法對各無性系耐旱性進(jìn)行綜合排序，計算各無性系各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，當(dāng)測定指標(biāo)與耐旱性為正相關(guān)時，隸屬函數(shù)值計算采用公式：

μ（Xij）=（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin） （1）

當(dāng)測定指標(biāo)與耐旱性為負(fù)相關(guān)時，隸屬函數(shù)值計算采用公式：

μ（Xij）=1-（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin） （2）

式中，μ（Xij）：i無性系j性狀的耐旱隸屬函數(shù)值，Xij：i無性系j性狀值，Xjmin：各無性系j性狀中最小值，Xjmax：各無性系j性狀中最大值。

隨后求出各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值綜合平均值，平均值越大，耐旱性越強(qiáng)。

表1　PEG-6000模擬干旱條件不同杉木無性系生理生化指標(biāo)變化

2　結(jié)果

2.1模擬干旱條件下杉木無性系生理生化響應(yīng)

6個杉木無性系在干旱脅迫條件下葉片各生理生化指標(biāo)均發(fā)生變化，但變化程度各異（表1）。T-c01、T-c04、T-c08、T-c22、T-cF1等5個無性系葉片相對含水量（RWC）明顯下降（P＜0.05或P＜0.01），而T-c07、T-c08、T-c22的丙二醛（MDA）含量增幅顯著（P＜0.01），此時T-c04、T-c22和T-cF1脯氨酸含量（PRO）也顯著提高（P＜0.05或P＜0.01）。在超氧化物歧化酶活性（SOD）方面，僅T-c22出現(xiàn)較明顯的變化（P＜0.01）；與對照相比，無性系T-c04、T-c07、T-c08、T-c22、T-cF1葉片過氧化物酶（POD）活性大幅提高（P＜0.05或P＜0.01），其中以T-c22變化最為顯著，POD活性是對照的3.0倍。另外，不同無性系在干旱脅迫下調(diào)控過氧化氫酶（CAT）活性方式上有所差異，如無性系T-c01、T-c04、T-c08和T-c22 CAT活性因干旱脅迫呈上調(diào)模式（P＜0.05或P＜0.01），而無性系T-c07和T-cF1 CAT活性則表現(xiàn)為下調(diào)。事實上，參試的6個無性系在干旱脅迫下其生理生化指標(biāo)綜合調(diào)控模式也存在差異，如T-c01在RWC、MDA、PRO、SOD、POD、CAT活性分別表現(xiàn)為：下調(diào)-上調(diào)-上調(diào)-上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)模式，而T-c08則表現(xiàn)為下調(diào)-上調(diào)-上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)-上調(diào)模式。值得一提的是，各無性系在非干旱條件下（對照）其生理生化指標(biāo)同樣存在差異，表明參試的6個無性系自身的預(yù)抗性方面也有所不同。

2.2杉木無性系耐旱性綜合評價

采用隸屬函數(shù)法對參試無性系耐旱性進(jìn)行綜合評價。各無性系RWC、MDA、PRO、SOD、POD和CAT隸屬函數(shù)值詳見表2，求取各無性系各指標(biāo)隸屬函數(shù)值均值發(fā)現(xiàn)，無性系T-c01耐旱性最強(qiáng)，而T-c08較差，6個無性系耐旱性排序為：T-c01 ＞ T-c22＞ T-cF1 ＞ T-c07 ＞ T-c04 ＞ T-c08。

表2　杉木無性系各指標(biāo)隸屬函數(shù)值及耐旱性綜合評價

表3　六個杉木無性系SRAP-PCR概況

2.3杉木無性系SRAP多態(tài)性分析

選取16對SRAP引物組合對供試的6個杉木無性系基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共檢測到131個清晰、穩(wěn)定的譜帶，其中多態(tài)性條帶88條，多態(tài)性條帶比例達(dá)66.8%（表3）。每對引物組合可擴(kuò)增出5-13條條帶，平均8.2條；其中多態(tài)性條帶2-11條，平均5.5條，多態(tài)性條帶比例介于22.2%（引物組合Me4/Em5）-87.5%（引物組合Me4/Em21）間。不同引物組合對無性系的辨別力也有所差異，例如，利用引物組合Me11/Em5、Me11/Em13進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均可將無性系一一辨清，但采用引物組合Me4/Em5則只能分辨出3類種質(zhì)：（1）T-c01、T-c08、T-cF1；（2）T-c04和T-c07；（3）T-c22。

基于各無性系基因組DNA SRAP-PCR多態(tài)性信息，運(yùn)用NTSYSpc v2.10e軟件計算不同無性系間遺傳相似系數(shù)發(fā)現(xiàn)（表4），6個無性系遺傳相似性（DICE系數(shù)）介于0.6909（無性系T-c07和T-c22）-0.9133（無性系T-c04和T-c07）間，但無性系相似性多數(shù)（60.0%）在0.7000-0.8000范圍內(nèi)。

表4　不同杉木無性系遺傳相似性系數(shù)（DICE系數(shù)）

2.4杉木無性系DNA-SRAP數(shù)字指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)多態(tài)性條帶比例≥75%、無性系辨別力≥5、差異條帶大小和亮度易辨且在不同無性系內(nèi)分布均勻、所用引物組合類型多樣等原則，從現(xiàn)有16對引物組合中選取3對引物組合（Me1/Em1+Me4/ Em21+Me11/Em5）構(gòu)建無性系指紋圖譜（圖1），經(jīng)數(shù)字化后，形成了無性系DNA-SRAP身份證號碼，詳見表5。因3對引物組合多態(tài)性條帶總數(shù)22，根據(jù)概率公式1/2n可知，在222=4 194 304種無性系中才有可能存在2個無性系電泳譜帶完全相同，指紋圖譜置信概率為99.99998%。因此，利用該指紋圖譜能夠準(zhǔn)確地檢測出其中任何一個無性系。

圖1　杉木無性系SRAP-PCR擴(kuò)增譜帶（引物組合：Me1/Em1、Me4/Em21、Me11/Em5）

3　討論

與其它樹種相比，杉木屬中等耐旱/抗旱類型［15-17］。譚建偉和陳建新［18］對杉木全分布區(qū)種源試驗林氣孔阻抗、蒸騰強(qiáng)度、根部形態(tài)及旱季生長率進(jìn)行分析還發(fā)現(xiàn)，不同種源杉木抗旱生理、形態(tài)和生長性狀差異顯著，種源間抗旱力存在明顯的遺傳分化。而何貴平和陳益泰［19］測定了抗旱較強(qiáng)杉木家系和較差家系在干旱脅迫下的脯氨酸含量，結(jié)果表明不同家系抗旱性與脯氨酸累積量沒有一定的相關(guān)性。在無性系水平，劉愛琴等［20］的研究顯示，參試的杉木無性系對干旱脅迫反應(yīng)敏感，不同無性系生理反應(yīng)（無性系水勢、蒸騰速率、葉綠素含量、NR活力下降、自然飽和虧、脯氨酸含量）差異明顯。李樹斌等［8］則采用PEG溶液培養(yǎng)法模擬干旱脅迫，比較了10個速生杉木無性系在干旱條件下葉片相對含水量、葉片蒸騰速率、葉片保水力、葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化模式，也發(fā)現(xiàn)不同無性系抗旱性存在較顯著的差異。事實上，植物的耐旱性/抗旱性是一個綜合體現(xiàn)。本研究同樣采用PEG溶液培養(yǎng)法模擬干旱脅迫，當(dāng)部分無性系出現(xiàn)脫水萎蔫現(xiàn)象時（培養(yǎng)24 h后），旋即對參試無性系RWC、MDA、PRO及保護(hù)酶系統(tǒng)（SOD、POD和CAT）進(jìn)而測定分析，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用隸屬函數(shù)法對無性系耐旱性做出快速、綜合評價（排序）。因參試無性系均為新選育并成功實現(xiàn)規(guī)?；M培擴(kuò)繁的品系，應(yīng)用潛力大，對其耐旱性做出評價顯然為這些無性系下一步大規(guī)模推廣應(yīng)用提供重要參考。值得一提的是，不同無性系在干旱脅迫下其生理生化指標(biāo)調(diào)控模式有所差異，而事實上各無性系自身的預(yù)抗性方面也有所不同，反映出不同無性系耐旱力存在一定程度的遺傳分化。根據(jù)隸屬函數(shù)值均值可知，無性系T-c01 耐旱性較強(qiáng)，而T-c08耐旱性較弱。

表5　不同杉木無性系DNA-SRAP 數(shù)字指紋圖譜（DNASRAP身份證號碼）

為快速、準(zhǔn)確鑒別各無性系，本研究利用前期建立的SRAP分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建各無性系指紋圖譜［12］，其操作程序簡單，穩(wěn)定性強(qiáng)，有效降低了多種試劑操作，包括Mg2+、dNTPs、DNA聚合酶、PCR buffer、引物等對擴(kuò)增結(jié)果的影響［21，22］；同時，擴(kuò)增結(jié)果可采用2%（g/v）瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，操作簡便、效果理想且成本低。而選用其中3對引物組合（Me1/Em1+Me4/Em21+Me11/Em5）可準(zhǔn)確鑒別出各無性系（T-c01、T-c04、T-c07、T-c08、T-c22、T-cF1），置信概率達(dá)99.99998%。為區(qū)分外觀相近的4個白楊新品種及其父母本和3個近緣種，樊蓉等［23］同樣利用SRAP標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建不同品種的DNA-SRAP指紋圖譜，效果也較為理想。另外，李婷婷等［24］聯(lián)用毛細(xì)管電泳技術(shù)（CE）構(gòu)建了不同來源的櫸樹優(yōu)良單株CE-SRAP指紋圖譜，為優(yōu)良單株無性系分子鑒定、遺傳資源管理及品種保護(hù)提供了參考依據(jù)。本研究則為SRAP技術(shù)應(yīng)用于杉木指紋圖譜構(gòu)建及無性系種質(zhì)鑒別方面提供了例證。

4　結(jié)論

本研究采用PEG溶液培養(yǎng)法模擬干旱脅迫，對具有較大應(yīng)用潛力的6個杉木優(yōu)良無性系耐旱性進(jìn)行綜合測評，不同無性系耐旱性排序為：T-c01 ＞ T-c22＞ T-cF1 ＞ T-c07 ＞ T-c04 ＞ T-c08。應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對參試無性系遺傳多態(tài)性進(jìn)行檢測并構(gòu)建了無性系的DNA-SRAP數(shù)字指紋圖譜，為無性系種質(zhì)鑒別和品種保護(hù)提供了分子依據(jù)。

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（責(zé)任編輯李楠）

Drought-tolerance Analysis and SRAP-based Germplasm Identification of Chinese Fir Clones

SU Yan1ZHANG Yi-chi1HU De-huo2ZHENG Hui-quan2
（1. College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Bio-control for the Forest Disease and Pest，Guangdong Academy of Forestry，Guangzhou 510520）

It was to evaluate the drought-tolerance of the elite clones（T-c01，T-c04，T-c07，T-c08，T-c22，T-cF1）of Chinese fir（Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook），and to generate clone-specific digital DNA fingerprinting ID，aiming to provide basis for the application and protection of these clones. Different plant physiological and biochemistry indexes including relative water content，malondialdehyde and proline content，and activity of superoxide dismutase，peroxidase and catalase，were measured for the present clones under PEG-6000 simulated drought condition. The results indicated that there had comprehensive change in physiological and biochemistry indexes among clones，while different clone seemed to have rather different systematic drought-response manner. According to the subordinate function values，a sequenced drought-tolerant order was identified，showing as T-c01 ＞ T-c22 ＞ T-cF1 ＞ T-c07 ＞ T-c04 ＞ T-c08. For sequence-related amplified polymorphism（SRAP）based-germplasm discrimination assay，16 SRAP primer combinations produced 131 clear and stable bands with a percentage of polymorphic bands of 66.8%，allowing a generation of clone-specific digital DNA fingerprinting ID by primer set of Me1/Em1+Me4/Em21+Me11/Em5 with confidence probability of 99.99998%.

Chinese fir；drought-tolerance；molecular polymorphism；fingerprinting

2016-05-31

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費（201404127），“廣東特支計劃”科技創(chuàng)新青年拔尖人才項目（2014TQ01N140），華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教改項目

蘇艷，女，實驗師，研究方向：林木生理生態(tài)；E-mail：suyan@scau.edu.cn

鄭會全，男，高級工程師，研究方向：林木遺傳育種與生物技術(shù)；E-mail：zhenghq@sinogaf.cn