孫立華，朱斌，王昕紅

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染疾病科，河南 新鄉(xiāng) 453100）

慢性乙肝患者血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1/PD-L1的表達(dá)與病情的相關(guān)性

孫立華，朱斌，王昕紅

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染疾病科，河南 新鄉(xiāng) 453100）

目的研究慢性乙型肝炎患者外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面程序性死亡分子-1（PD-1）/程序性死亡分子-1配體（PD-L1）的表達(dá)及其與病情的相關(guān)性。方法選擇慢性乙型肝炎患者90例和健康體檢者82例進(jìn)行研究。分別納入慢性乙肝組和健康對(duì)照組，檢測(cè)外周血細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1、PD-L1的表達(dá)量以及血清生化指標(biāo)。結(jié)果慢性乙肝組患者外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1和PD-L1的表達(dá)量顯著高于健康對(duì)照組，乙型肝炎病毒載量越高、外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1和PD-L1的表達(dá)量越高；慢性乙肝組患者血清中ALT、AST、IL-6、IL-8的含量均顯著高于健康對(duì)照組且與外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1和PD-L1的表達(dá)量呈正相關(guān)。結(jié)論慢性乙型肝炎患者外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1和PD-L1的表達(dá)量顯著升高且與肝損傷程度、炎癥反應(yīng)程度相關(guān)。

慢性乙型肝炎；細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；程序性死亡分子-1；炎癥反應(yīng)

慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的消化系統(tǒng)傳染性疾病，細(xì)胞免疫應(yīng)答是機(jī)體清除HBV病毒的重要機(jī)制，機(jī)體的免疫功能決定了慢性乙型肝炎的臨床預(yù)后和轉(zhuǎn)歸。T淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)細(xì)胞免疫最主要的細(xì)胞群，慢性乙型肝炎患者存在不同程度的T淋巴細(xì)胞質(zhì)量低下、數(shù)量不足，機(jī)體無(wú)法通過(guò)自身的細(xì)胞免疫功能來(lái)清除HBV病毒[1]。T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答功能的強(qiáng)弱受到了多種共刺激信號(hào)分子的調(diào)節(jié)，其中程序性死亡分子-1（programmed death-1，PD-1）是決定T細(xì)胞數(shù)目和功能最關(guān)鍵的負(fù)性共刺激信號(hào)分子，PD-1與其配體程序性死亡分子-1配體（programmed death ligand-1，PD-L1）結(jié)合能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡[2]。在下列研究中，筆者分析慢性乙型肝炎患者外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1/PD-L1的表達(dá)及其與病情的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2012年8月-2015年1月于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院接受治療的慢性乙型肝炎患者90例納入研究的慢性乙肝組。其中，男性51例，女性39例，年齡34～67歲，平均（47.12±8.05）歲，均符合世界衛(wèi)生組織對(duì)于慢性乙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)且未接受過(guò)抗病毒治療，入組患者在了解研究過(guò)程后簽署知情同意書(shū)。取同期在本院進(jìn)行健康體檢、不伴有肝功能異常的正常人群82例作為健康對(duì)照組。其中，男性43例，女性39例，年齡30～71歲，平均（45.84±8.31）歲。本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)，入組研究對(duì)象的基線資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可以進(jìn)行進(jìn)一步比較。

1.2血清生化指標(biāo)的檢測(cè)

取新鮮外周血10 ml，離心得到血清后，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase，AST）含量，采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測(cè)定白細(xì)胞介素6（interleukin6，IL-6）、白細(xì)胞介素8（interleukin8，IL-8）的含量。

1.3外周血細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1/PDL1表達(dá)

取新鮮外周血10ml，采用密度梯度法分離單個(gè)核細(xì)胞，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×107/ml。在每個(gè)反應(yīng)管中加入上述細(xì)胞懸液100μl，而后避光孵育APC標(biāo)記的CD3、PerCP標(biāo)記的CD8、FITC標(biāo)記的PD-1、FITC標(biāo)記的PD-L1抗體20 min，PBS洗滌2次后棄上清液，加入1%多聚甲醛300μl固定，在流式細(xì)胞儀上以CD3+T細(xì)胞為門(mén)，計(jì)數(shù)CD3+CD8+，測(cè)定PD-1、PD-L1陽(yáng)性細(xì)胞占CD3+CD8+細(xì)胞的比例。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用t檢驗(yàn)。多組間計(jì)量資料的比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，兩指標(biāo)間的相關(guān)性用Pearson檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1/PDL1的表達(dá)

慢性乙肝組患者外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1和PD-L1的表達(dá)量顯著高于健康對(duì)照組，兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1　兩組受試者外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1/PD-L1的表達(dá)（%±s）

表1　兩組受試者外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1/PD-L1的表達(dá)（%±s）

組別PD-1PD-L1慢性乙肝組（n=90）39.42±5.9547.26±6.61健康對(duì)照組（n=82）14.52±3.2227.62±3.64 t值17.4939.126 P值0.0010.005

2.2不同HBV載量患者外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1/PD-L1的表達(dá)

不同HBV載量患者外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1和PD-L1的表達(dá)量有差異；HBV載量越高，外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1和PD-L1的表達(dá)量越高。見(jiàn)表2。

表2　不同HBV載量患者外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1/PD-L1的表達(dá)（%±s）

表2　不同HBV載量患者外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1/PD-L1的表達(dá)（%±s）

HBV-DNA/（拷貝/ml）PD-1PD-L1 <3lg（n=21）24.22±4.5235.58±5.22 3～6lg（n=38）35.58±5.7145.29±6.38 >6lg（n=31）48.51±7.7458.25±8.14 F值8.3957.614 P值0.0060.009

2.3血清中生化指標(biāo)

慢性乙肝組患者血清中ALT、AST、IL-6、IL-8的含量均顯著高于健康對(duì)照組，兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3　兩組受試者的血清生化指標(biāo)比較（±s）

表3　兩組受試者的血清生化指標(biāo)比較（±s）

HBV-DNA/（拷貝/ml）ALT/（u/L）AST/（u/L）IL-6/（pg/L）IL-8/（pg/L）慢性乙肝組（n=90）93.69±12.5176.61±10.33204.51±34.86273.69±41.36健康對(duì)照組（n=82）18.92±2.6212.48±1.8524.68±5.1448.52±7.42 t值35.59542.91171.39858.592 P值0.0020.0010.0040.003

2.4PD-1/PD-L1表達(dá)量與血清生化指標(biāo)的相關(guān)性

外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1和PD-L1的表達(dá)量與血清ALT、AST、IL-6和IL-8的含量呈正相關(guān)。見(jiàn)表4。

表4　PD-1/PD-L1表達(dá)量與血清生化指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

目前的研究認(rèn)為，造成慢性乙型肝炎患者體內(nèi)HBV持續(xù)感染的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)是細(xì)胞免疫功能低下，尤其是細(xì)胞毒性T細(xì)胞所介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答低下。但是，關(guān)于細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能低下的原因尚未明確。細(xì)胞毒性T細(xì)胞的功能不僅受到輔助性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響，細(xì)胞毒性T細(xì)胞本身表達(dá)多種共刺激分子并且能夠影響細(xì)胞的數(shù)目和功能。在諸多共刺激信號(hào)分子中，PD-1/PD-L1是最關(guān)鍵的負(fù)性共刺激信號(hào)[3]。筆者對(duì)慢性乙肝患者外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1/PD-L1表達(dá)量的分析也證實(shí)，慢性乙肝組患者外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1和PD-L1的表達(dá)量顯著高于健康對(duì)照組。這就說(shuō)明慢性乙型肝炎患者體內(nèi)存在PD-1/PD-L1所介導(dǎo)的負(fù)性共刺激信號(hào)過(guò)度激活的現(xiàn)象。

PD-1是CD28/B7家族的成員之一，主要表達(dá)活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞，其配體PD-1L主要表達(dá)與B細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。PD-1與PDL1以配體-受體方式結(jié)合后能夠誘導(dǎo)靶細(xì)胞發(fā)生凋亡、造成細(xì)胞功能減退。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面的PD-1和PD-L1主要與細(xì)胞凋亡有關(guān)[4-5]。為了進(jìn)一步明確外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1/PD-L1與HBV感染的關(guān)系，筆者分析了不同HBV載量患者外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1/PD-L1的表達(dá)，結(jié)果顯示：HBV載量越高，外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1和PD-L1的表達(dá)量越高。這就說(shuō)明細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1/PD-L1表達(dá)量的增加與HBV感染加重、載量增加有關(guān)。

HBV持續(xù)感染會(huì)造成慢性乙型肝炎患者肝功能損傷，表現(xiàn)為肝細(xì)胞破裂、胞漿中多種轉(zhuǎn)氨酶釋放入血[6]。ALT和AST是臨床上評(píng)價(jià)肝功能損傷最常用的生化指標(biāo)，筆者的分析證實(shí)，慢性乙肝組患者血清中ALT、AST的含量顯著高于健康對(duì)照組且與外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1和PD-L1的表達(dá)量呈正相關(guān)。HBV感染所激活的炎癥反應(yīng)是造成肝細(xì)胞損傷的重要環(huán)節(jié)，IL-6和IL-8是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)關(guān)鍵的細(xì)胞因子[7-8]。筆者對(duì)血清炎癥因子含量的分析證實(shí)，慢性乙肝組患者血清中IL-6、IL-8的含量顯著高于健康對(duì)照組且與外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1和PD-L1的表達(dá)量呈正相關(guān)。由此說(shuō)明外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1和PD-L1的表達(dá)量與慢性乙肝患者肝功能損傷程度、炎癥反應(yīng)程度等病情密切相關(guān)。

綜上所述，慢性乙型肝炎患者外周血中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面PD-1和PD-L1的表達(dá)量顯著升高且與肝損傷程度、炎癥反應(yīng)程度相關(guān)。

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[3]王棟,顧錫炳,朱銀芳,等.乙肝肝硬化患者HBVDNA水平與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表面程序性死亡受體-1表達(dá)及肝功能的關(guān)系[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2015,31(7):1072-1075.

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（張蕾編輯）

Correlation of expression of PD-1/PD-L1 on cytotoxic T lymphocytes in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis B and disease severity

Li-hua Sun，Bin Zhu，Xin-hong Wang
（Department of Infectious Disease，the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Xinxiang，Henan 453100，China）

Objective To study the expression of PD-1/PD-L1 on cytotoxic T lymphocytes in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis B and its correlation with disease severity.Methods A total of 90 cases of chronic hepatitis B patients and 82 cases of healthy subjects were respectively enrolled into the chronic hepatitis B group and the healthy control group.Expressions of PD-1 and PD-L1 on cytotoxic T lymphocytes in the peripheral blood and serum biochemical indices were determined.Results Expressions of PD-1 and PD-L1 on cytotoxic T lymphocytes in the peripheral blood of the chronic hepatitis B group were significantly higher than those in the healthy control group.Patients with higher HBV load also had a higher expression of PD-1 and PD-L1 on cytotoxic T lymphocytes in the peripheral blood.And serum ALT，AST，IL-6，IL-8 contents of chronic hepatitis B groups were significantly higher than those in healthy control group and positively correlated with PD-1 and PD-L1 expression on cytotoxic T lymphocytes in the peripheral blood.Conclusions The expression of PD-1 and PD-L1 on cytotoxic T lymphocytes in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis B significantly elevates and correlates with the degree of liver injury and the degree of inflammation.

chronic hepatitis B；cytotoxic T lymphocyte；programmed death-1；inflammatory response

R 512.62

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.20.007

1005-8982（2016）20-0030-04

2016-04-05