高　原，王福玲，賈　琦，劉　微，周艷巖

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院 細胞與分子生物學(xué)研究所，黑龍江 哈爾濱150076）

工程師園地

紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的抗氧化活性比較*

高原*，王福玲，賈琦，劉微，周艷巖

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院 細胞與分子生物學(xué)研究所，黑龍江 哈爾濱150076）

本文比較了紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的總酚含量及抗氧化活性差異。通過比較紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的總酚含量、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力、Fe3+總抗氧化能力（FRAP）、鐵還原能力、清除羥基自由基能力等試驗，評價不同種類葡萄酒的抗氧化活性。實驗結(jié)果表明，紅葡萄酒總酚含量最高，達到GAE 2120mg·L-1。其中紅葡萄酒的DPPH自由基清除試驗、鐵還原能力試驗、清除羥基自由基能力試驗的半數(shù)抑制濃度（IC50）值所對應(yīng)的葡萄酒稀釋倍數(shù)分別為：0.046、0.033和0.13，F(xiàn)e3+總抗氧化能力（FRAP）試驗結(jié)果為449.57μmol·L-1FeSO4。紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒均具有一定的抗氧化活性，活性強弱依次為紅葡萄酒＞桃紅葡萄酒＞白葡萄酒。

葡萄酒；總酚；抗氧化；自由基；還原能力

葡萄酒是以葡萄或葡萄汁為原料經(jīng)發(fā)酵釀制而成含有酒精的飲料，它含有花青素、兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、山奈酚、白藜蘆醇等多酚類抗氧化活性物質(zhì)［1］。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上講，多酚物質(zhì)是含有酚羥基的物質(zhì)，在苯環(huán)上聯(lián)有一個或多個羥基的化合物。這類物質(zhì)決定了葡萄酒的感官特征和質(zhì)量指標，如葡萄酒的顏色、口感、香氣、骨架和結(jié)構(gòu)等。適量飲用葡萄酒具有防治心腦血管疾病、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、預(yù)防老年癡呆癥等多種保健功能。

氧自由基（ROO·、O～·）和羥自由基（OH-）能引起生物膜過氧化作用而導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)和功能損傷，多酚類物質(zhì)可通過與羥基所提供的氫自由基（H·）的結(jié)合而消除自由基，從而保護細胞組織免受氧化作用的損害［2］。自由基和脂質(zhì)過氧化損傷是動脈粥樣硬化、癌癥、肝病和老化的主要因素。葡萄酒中的多酚類化合物對一些嚴重危害人體健康的疾病如肥胖、心臟病、癌癥等都具有一定的治療或預(yù)防作用［3］。

本文通過對紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的總酚含量測定、DPPH清除自由基實驗、Fe3+總抗氧化能力實驗、鐵還原能力實驗、清除羥基自由基能力等實驗綜合比較了3種葡萄酒的抗氧化活性。

1　實驗部分

1.1材料與試劑

葡萄酒（京東商城澳洲奔富洛神山莊），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（Ruitaibio），2，4，6-三吡啶基 -1，3，5-三嗪 （TPTZ）（MYM Biological Technology）；生育酚 Trolox（Sigma），維生素 C（Sigma），福林-酚試劑（天津市光復(fù)精細化工研究所）；三氯乙酸（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；醋酸鈉（天津市福晨化學(xué)試劑廠），HAc（西隴化工股份有限公司）；FeSO4（西隴化工股份有限公司），KCN（西隴化工股份有限公司），F(xiàn)eCl3（西隴化工股份有限公司）；水楊酸（西隴化工股份有限公司），甲醇（天津市天力化學(xué)試劑有限公司），乙醇（天津市天力化學(xué)試劑有限公司），H2O2（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司），以上試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

BSA223S-CW型分析天平（上海精天電子儀器公司）；HH-ZK型二孔多能水浴鍋（鄭州英裕予華儀器有限公司）；T6新世紀紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.3方法

1.3.1總酚含量的測定總酚含量的測定采用Folin-酚比色法［4］。

1.3.2DPPH清除自由基實驗精密稱取DPPH 4.0mg，用無水乙醇溶解并定容至10mL中，得濃度為0.04%的DPPH貯存溶液，避光保存，備用。使用時將DPPH貯存液進行10倍稀釋，得到濃度為0.004%DPPH溶液。分別取稀釋不同稀釋倍數(shù)的葡萄酒溶液（1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125）100μL，置4mL離心管中，加入1.4mL無水乙醇，1.0mL的DPPH溶液，室溫避光反應(yīng)70min，同時以無水乙醇為空白，于517nm波長處測定吸光值；以1.5mL無水乙醇加1mL DPPH為對照。按下列公式計算DPPH自由基清除率。用無水乙醇做空白對照［5］。

清除率Ai=（Ac-Ao）Ac×100%

式中Ac：1.5mL無水乙醇+1mL DPPH；Ao：100μL樣品+1.4mL無水乙醇+1mLDPPH

1.3.3Fe3+總抗氧化能力（FRAP法） 取0.3mol·L-1醋酸鹽緩沖液（NaAc-HAc pH=3.6）25mL，加入2.5mL經(jīng)過十倍稀釋的10mmol·L-1TPTZ（溶解于40mmol·L-1鹽酸），最后加入 20mmol·L-1FeCl32.5mL，混合均與即為FRAP工作液。取300μL不同稀釋濃度的葡萄酒樣品（1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125）與2.7mL FRAP工作液混合，在37℃恒溫水浴鍋中保溫30min，593nm測吸光度。將300μL無水乙醇和2.7mL FRAP工作液的混合液作對照?？瞻资菬o水乙醇［6］。

同時進行FeSO4標準曲線的繪制，以1μmol·L-1FeSO4為標準，樣品抗氧化活性以達到同樣吸光度所需的FeSO4的微摩爾數(shù)表示。

1.3.4鐵還原能力實驗取不同稀釋濃度的葡萄酒樣品，分別為1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125的樣品0.35mL，加入相應(yīng)體積的的PBS（625mL 0.2 mol·mL-1Na2HPO4及375mL 0.2mol NaH2PO4混合，pH=6.6）及1%的鐵氰化鉀（K3［Fe（CN）6］），混合均勻后在50℃中水浴20min后冷卻至室溫，再加入0.35mL 10%三氯乙酸，在3000rpm下離心10min，取上清液1.2mL，分別加1.2mL蒸餾水和0.24mL 0.1% FeCl3，室溫靜置10min，在700nm下測OD。以Trolox作為陽性對照。陰性對照中以水為代替，其余與待測樣品步驟相同［7］。

1.3.5清除羥基自由基能力的測定取稀釋濃度分別1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.03125的葡萄酒樣品1mL，9mmol·L-1FeSO4溶液1mL，9mmol·L-1水楊酸乙醇溶液1mL、8.8mmol·L-1H2O2溶液1mL。搖勻，37℃保存30min。在3000rpm下離心10min，取上清液，以水為參比液于510nm處測光密度Ax；每管中加入與待測液濃度及體積相同的待測液，其余試劑用水代替，測得本底光密度Axo；Trolox作為陽性對照，陰性對照以水代替測得陰性對照光密度A0［8］。按下式計算清除率：

清除率（%）S=［1-（Ax-Axo）/A0］×100%

式中Ax：加入水解液后的吸光度值；Axo：水解液本底吸光度值；A0：空白對照液吸光度值。

1.3.6統(tǒng)計學(xué)處理及方法應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理。采用ANOVA方差分析并行方差齊性檢驗；結(jié)果以X±S表示。

2　結(jié)果與討論

2.1總酚含量的測定

葡萄酒中的酚類物質(zhì)具有較強的抗氧化活性和清除自由基的能力，對人體有很好的保健作用，因此，葡萄酒的抗氧化活性可以作為評價葡萄酒質(zhì)量高低的一個指標，含有酚類物質(zhì)是酒精性飲料具有抗氧化化功能的主要原因之一［9］。通過對紅葡萄酒、桃紅葡萄酒及白葡萄酒中總酚含量的測定結(jié)果進行比較，見圖1，我們發(fā)現(xiàn)紅葡萄酒中的總酚含量最高，與桃紅葡萄酒和白葡萄酒存在顯著性差異，達到2120mg·L-1，其次是桃紅葡萄酒，含量為1255mg·L-1，白葡萄酒的含量最低，約為290mg·L-1。

圖1　葡萄酒中總酚含量的測定Fig.1　Total phenol content in wine

2.2DPPH清除自由基實驗

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基是一種穩(wěn)定的有機自由基，常用來評價抗氧化物質(zhì)的體外抗氧化能力。其能力用清除率來表示，清除率越大，其抗氧化能力越強［10］。DPPH清除自由基實驗測定結(jié)果見圖2，當紅葡萄酒、桃紅葡萄酒及白葡萄酒的IC50值分別為0.046，0.17和0.29，即當紅葡萄酒、桃紅葡萄酒及白葡萄酒分別稀釋至0.046，0.17和0.29時，DPPH清除率達到50%。葡萄酒具有較好的清除自由基能力，且紅葡萄酒的清除自由基能力最強。陽性對照維生素C的DPPH清除自由基實驗其IC50值為0.711μg·mL-1。

圖2　DPPH清除自由基實驗Fig.2　DPPH radical scavenging assay

2.3Fe3+總抗氧化能力（FRAP法）

Fe3+總抗氧化能力（FRAP）實驗利用Fe3+被還原成Fe2+，從而使其與三吡啶三吖嗪（TPTZ）形成的復(fù)合物在593nm下吸光度發(fā)生變化這一原理來測定樣品的抗氧化活性。而且該方法不是針對某一種特定自由基的清除能力測定，而是反應(yīng)樣品的總抗氧化能力。葡萄酒稀釋液通過FRAP總抗氧化能力實驗的測定，表明3種葡萄酒具有均具有較強的抗氧化能力，通過繪制FeSO4標準曲線，得到回歸方程：y=0.0023x+0.193（R2=0.9991）。以1μmol·L-1FeSO4為標準，樣品抗氧化活性以達到同樣吸光度所需的FeSO4的微摩爾數(shù)表示。實驗結(jié)果見圖3，當葡萄酒稀釋倍數(shù)為1時，紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的總抗氧化能力為分別為 449.57、380.25和264.05μMFeSO4。陽性對照維生素C的FRAP值為11.38mMFeSO4。

圖3　總抗氧化能力實驗Fig.3　Ferric ion total antioxidant power assay

2.4鐵還原能力實驗

在鐵還原能力實驗中，抗氧化劑通過自身的還原作用給出電子而清除自由基。樣品中的抗氧化劑可使鐵氰化鉀（K3［Fe（CN）6］）的Fe3+被還原成Fe2+，與氯化鐵生成普魯士蘭（Fe4［Fe（CN）6］3），在700nm處有最大吸光度，因此，可通過測定還原力來說明其抗氧化活性的大小，還原力越強，抗氧化性越強。經(jīng)實驗測得3種葡萄酒均具有一定的鐵還原能力，紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的IC50值分別為0.033、0.085和0.17，表示在吸光度值為0.5時紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的稀釋濃度為0.033、0.085和0.17。

見圖4。陽性對照生育酚（Trolox）的IC50值為0.9600μg·mL-1。

圖4　鐵還原能力實驗Fig.4　Reducing power assay

2.5清除羥基自由基能力的測定

羥自由基是活性氧中對生物體危害最大的一種自由基，可造成生物體內(nèi)的氨基酸、糖類、核酸及脂類等大分子物質(zhì)發(fā)生氧化損傷，使其失去正常的生理功能。水楊酸可以捕獲羥基自由基生成2，3-二羥基苯甲酸和2，5-二羥基苯甲酸，在波長510nm處有最大吸收值。基于以上原理可間接反應(yīng)樣品清除羥基自由基能力。羥基自由基清除率實驗結(jié)果見圖5。

圖5　羥自由基清除實驗Fig.5　Hydroxyl radical scavenging assay

由圖5檢測結(jié)果可計算得，紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的 IC50值分別為 0.13、0.19和0.26，表示在清除率為50.00%時，紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒的稀釋濃度分別為0.13、0.19和0.26。陽性對照生育酚（Trolox）的羥自由基清除能力IC50值為0.0220mg·mL-1。

3　結(jié)論

紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒在成分含量上有所區(qū)別。其中不同顏色的葡萄酒中多酚含量不同，其抗氧化活性也有所差別。葡萄酒中的酚類物質(zhì)具有較強的抗氧化性和清除自由基的能力，對人體有很好的保健作用，因此，葡萄酒的抗氧化活性可以作為評價葡萄酒質(zhì)量高低的一個指標。

本研究通過比較紅葡萄酒、白葡萄酒、桃紅葡萄酒的總酚含量及抗氧化活性的差異，并通過多種方法對3種葡萄酒的抗氧化功能進行了綜合性的評價。結(jié)果表明，紅葡萄酒、桃紅葡萄酒和白葡萄酒對DPPH自由基、羥基自由基均具有清除和抑制作用。FRAP實驗和鐵還原能力實驗表明3種葡萄酒均具有抗氧化能力及還原能力。綜合評價可知，紅葡萄酒抗氧化能力最強，白葡萄酒最弱。

［1］ 史紅梅，丁燕，孫玉霞，等.葡萄酒中多酚物質(zhì)抗氧化活性測定方法的研究［J］.釀酒科技，2011，（7）：95-97.

［2］ 高川，繆冰旋，馬三梅，等.葡萄酒抗氧化的研究進展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39（5）：149-153.

［4］ Oktay，M.，Gulcin，I.，&Kufrevioglu，O.I.Determination ofin vitro antioxidant activity of fennel（Foeniculum vulgare）seed extracts. Lebensmittel-Wissenschaftund-Technologie［J］.Food Science，2003，36：263-271.

［5］ Sokmen，M.，Angelova，M.，Krumova，E.，et al.In vitro antioxidant activity ofpolyphenolextracts with antiviralproperties from Geranium sanguineum L［J］.Life Science，2005，76：2981-2993.

［6］ 韓洪坤，楊曉彤，楊慶堯，等.鐵離子還原法（FRAP）測定中國被毛孢菌絲體提取物抗氧化活性［J］.上海師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，40（3）：272-275.

［7］ Wu，N.，Zu，Y.G.，F(xiàn)u，Y.J.，et al.Antioxidantactivities and xanthine oxidase inhibitory effects of extracts and main polyphenolic compoundsobtained from Geraniumsibiricum L［J］.JournalofAgriculturaland Food Chemistry，2010，58：4737-4743.

［8］ 孫娟，鄭朝輝，劉磊，等.種珍稀食用菌粗多糖的抗氧化活性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，38（3）：404-4094.

［9］ 翁夏蒙，魯光耀，王鴦妮，等.白及愈傷組織總酚含量測定及抗氧化作用研究［J］.中藥材，2013，36（1）：32-35.

［10］ 胡博然，陰淑貞，聞雯，等.干白葡萄酒清除自由基的能力及其與總酚含量的關(guān)系［J］.食品發(fā)酵工業(yè)，2011，37（11）：60-64.

Antioxidant activity difference in red wine，rose wine and white wine research*

GAO Yuan ，WANG Fu-ling，JIA Qi，LIU Wei，ZHOU Yan-yan
（College of pharmacy，Cell and molecular biology research institute，Harbin commercial university，Harbin 150076，China）

In this study antioxidant activity of wines was evaluated by comparing the red wine，rose wine and white wine，including the total phenol content，1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH）radical scavenging capacity，ferric iron ion total antioxidant capacity（FRAP），reducing power assay and hydroxyl radical scavenging assay. The results showed that the red wine has the highest total phenol content which was Gallic acid（GAE）2120mg· L-1.Red wine has better antioxidant activity than rose wine and white wine，the IC50value was 0.046、0.033 and 0.13 dilution ratio wine in DPPH radical scavenging assay，iron reducing power experimental and hydroxyl radical scavenging assay，respectively，results of ferric iron ion total antioxidant capacity was 449.57μM FeSO4.Red wine，rose wine and white wine has a certain antioxidant activity，and the antioxidant power was that red wine was greater than rose wine，rose wine was greater than white wine.

wine；total phenol；antioxidant；free radicals；reducing power

TS262

A

2016-06-16

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（12541204）資助

高原（1983-），女，博士，講師，2012年畢業(yè)于東北林業(yè)大學(xué)植物學(xué)專業(yè)，研究方向：抗氧化活性作用機制。