孟永斌 徐 蕾 張子東 路 祺 劉 英 聶思銘 祖元剛*

(1.東北林業(yè)大學生物資源生態(tài)利用國家地方聯(lián)合工程實驗室，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

纖維剩余物發(fā)酵制備乙醇工藝研究

孟永斌1,2徐 蕾1,2張子東1,2路 祺1,2劉 英1,2聶思銘1,2祖元剛1,2*

(1.東北林業(yè)大學生物資源生態(tài)利用國家地方聯(lián)合工程實驗室，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學森林植物生態(tài)學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

單因素實驗和正交優(yōu)化對固定化酵母制備工藝條件進行優(yōu)化研究，并對固定化酵母的重復利用發(fā)酵能力進行了考察，其優(yōu)化工藝條件為海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比1∶2 g·g-1，底物糖濃度30%，酵母用量1.5 g，固定化酵母發(fā)酵120 h。在此條件下，乙醇產(chǎn)率均值為83.68%。為塔拉纖維剩余物的酶解液發(fā)酵制備乙醇提供技術支撐。

纖維剩余物;發(fā)酵;乙醇;固定化酵母

目前工業(yè)化制備沒食子酸方法，雖然具有工藝成熟等優(yōu)點，但也存在塔拉廢渣對環(huán)境造成嚴重污染等問題[1～2]。塔拉經(jīng)過堿提取沒食子酸后，其廢渣主要成分為綜纖維素[3]。酵母是一種單細胞真菌，在有氧和無氧環(huán)境下都能生存，屬于兼性厭氧菌[4]。發(fā)酵型的酵母無氧呼吸通過將糖類轉化成為二氧化碳和乙醇來獲取能量[5]。固定化酵母細胞技術[6～7]是20世紀60年代發(fā)展起來的生物技術，為近年來生物工程研究重點領域之一[8]。固定化酵母發(fā)酵將酵母細胞固定在不溶性物質(zhì)上進行發(fā)酵過程，具有高效、專一、可回收利用及便于反應過程管理化、連續(xù)化及自控化等優(yōu)點[9]。固定化的酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇反應結束后可以回收，重復發(fā)酵使用，提高了酵母的利用率，降低發(fā)酵成本。本研究是通過單因素實驗和正交優(yōu)化對固定化酵母制備工藝條件進行優(yōu)化研究，并對固定化酵母的重復利用發(fā)酵能力進行了考察，為塔拉纖維剩余物的酶解液發(fā)酵制備乙醇提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酵母，安琪酵母股份有限公司；乙醇(色譜級)；海藻酸鈉、氯化鈣、葡萄糖均為分析純。塔拉纖維剩余物酶解糖液制備是通過前期正交實驗得到纖維素酶水解塔拉纖維剩余物優(yōu)化工藝條件，即料液比1∶6 g·mL-1，酶解溫度55℃，pH6，酶解時間48 h。在此條件下，塔拉纖維剩余物酶解還原糖產(chǎn)率均值為43.95%。

7890A氣相色譜儀，HP-55%苯甲基硅氧烷毛細管柱(0.25 μm×320 μm×30 m)以及G1540N-210FID(氫氣火焰檢測器)檢測器；美國Agilent公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

本實驗采用單因素實驗設計探討固定化酵母發(fā)酵各因素對乙醇產(chǎn)率的影響。在單因素實驗基礎上對固定化酵母發(fā)酵進行正交優(yōu)化實驗[10]。

1.2.1 氣相色譜條件

柱箱子起始溫度40℃維持5 min，然后以20℃·min-1的速度升溫到200℃維持2 min。進樣口和檢測器溫度分別設置為200℃和220℃。氮氣作為載氣流量為30 mL·min-1，分流比25∶1。氫氣和空氣流量分別為35和320 mL·min-1。尾吹流量25 mL·min-1[11～12]。

1.2.2 乙醇產(chǎn)率測定

將40 mL待測乙醇液體置于150 mL圓底燒瓶中，添加40 mL蒸餾水后進行蒸餾，采用50 mL容量瓶接收餾出液50 mL[13]。利用氣相色譜測量乙醇PA利用乙醇標準曲線方程計算乙醇濃度CA。

(1)

1810年，Gay-Lussac建立了酵母菌發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)乙醇的反應式由式1可以看出，100 g的葡萄糖能夠產(chǎn)生乙醇51 g，二氧化碳49 g；理論產(chǎn)量以重量計為51%。本章中定義乙醇產(chǎn)率是產(chǎn)生乙醇的量與理論產(chǎn)量的比值，根據(jù)公式2計算乙醇產(chǎn)率Y(%)。

(2)

式中：CA為樣品蒸餾液乙醇濃度(mg·mL-1)；VA為樣品蒸餾液體積(mL)；CG為樣品葡萄糖溶液濃度(mg·mL-1)；VG為樣品溶液體積(mL)。

1.2.3 酵母固定化

酵母活化：釀酒干酵母1.5 g，放入2%葡萄糖溶液30 mL中于35℃恒溫條件下復水15 min，于35℃下恒溫活化1 h后作酒母備用。

海藻酸鈉—酵母懸液的制備：在30 mL蒸餾水中攪拌加熱溶解0.338 g海藻酸鈉，完全溶解后將溫度降至30℃，均勻混合海藻酸鈉溶液與活化酵母液，形成海藻酸鈉—酵母懸液。

酵母細胞的固定化：在150 mL蒸餾水中攪拌溶解28.3 g的氯化鈣，用5 mL注射器將海藻酸鈉一酵母懸液緩慢滴入氯化鈣溶液中進行造粒，混合后的菌懸液中的海藻酸鈉在CaCl2溶液中與鈣離子起到耦合作用，將海藻酸鈉羧基上的鈉換成鈣，形成多維網(wǎng)格結構，生成凝膠和氯化鈉；并將酵母固定在包埋劑中。固定化酵母凝膠珠在20℃下初步平衡1 h后，取出固定化酵母用蒸餾水洗去表面氯化鈣溶液后，放入濃度為0.05 mol·L-1的氯化鈣溶液中深度平衡24 h備用[13]。

2 結果與討論

2.1 乙醇標準曲線

以乙醇濃度為橫坐標，峰面積PA為縱坐標作圖。線性回歸方程y=525.61x+6.513，R2=0.999；乙醇標準曲線如圖1。

圖1 乙醇標準曲線Fig.1 Standard curve of alcohol

2.2 固定化酵母發(fā)酵制乙醇單因素實驗

2.2.1 固定化酵母底物糖濃度對乙醇產(chǎn)率的影響

由圖2可以看出底物糖濃度對固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率的影響。隨著底物糖濃度的增加，溶液單位體積可利用的糖量也隨之增加，固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率也隨之緩慢增加；底物糖濃度達到30%時，固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率達到最大值。但過高底物糖濃度會造成酵母細胞失水，不利于酵母生存，失水后會對酵母的生命活動產(chǎn)生抑制。所以底物糖濃度達到50%，固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率迅速下降。通過單因素實驗可知最適宜的底物糖濃度為30%。

2.2.2 固定化酵母用量對乙醇產(chǎn)率的影響

酵母用量對固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率的影響如圖3。隨著酵母用量的增加，固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率也隨之大幅度增加；當酵母用量超過1.5 g時，由于溶液中酵母可利用的底物糖量是有限的，隨著酵母用量繼續(xù)增加固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率不再增加。因此，最適宜的酵母用量為1.5 g。

圖2 固定化酵母底物糖濃度對乙醇產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of glucose concentration on immobilized yeast ethanol productivity

圖3 固定化酵母用量對乙醇產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of mass on immobilized yeast ethanol productivity

2.2.3固定化酵母的海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比對乙醇產(chǎn)率的影響

依據(jù)文獻海藻酸鈉溶液濃度選定為2.25%，海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比對固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率的影響見圖4。由圖可知，隨著海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比的增加，即海藻酸鈉用量逐漸增加時，固定化酵母凝膠珠數(shù)量逐漸增加，酵母與底物糖液接觸面積逐漸增加，固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率隨之增加[14]。當海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比超過1∶2時，固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率呈現(xiàn)下降趨勢，這是由于海藻酸鈉用量繼續(xù)增加時，固定化酵母凝膠珠雖然增多，但固定化酵母凝膠珠中酵母量降低幅度較大，不利于發(fā)酵，固定化酵母乙醇產(chǎn)率也隨之降低。因此適宜的海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比為1∶2，此條件下，固定化酵母發(fā)酵底物糖液制備乙醇產(chǎn)率為83.68%。

圖4 固定化酵母的海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比對乙醇產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of sodium alginate mass on immobilized yeast ethanol productivity

2.2.4固定化酵母發(fā)酵時間對發(fā)酵乙醇產(chǎn)率的影響

發(fā)酵時間對固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率的影響見圖5。隨著發(fā)酵時間延長，固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率呈現(xiàn)先逐漸增加后趨于平緩的趨勢。隨著固定化酵母發(fā)酵時間的延長，利用的底物糖量越來越少和乙醇產(chǎn)物的積累增加，導致固定化酵母發(fā)酵乙醇產(chǎn)率增加速率也逐漸緩慢；當固定化酵母發(fā)酵超過120 h，乙醇產(chǎn)率增加不明顯。

圖5 固定化酵母發(fā)酵時間對乙醇產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of time on immobilized yeast ethanol productivity

2.3 固定化酵母發(fā)酵制乙醇正交實驗

通過前面單因素實驗確定各因素取值范圍，以乙醇產(chǎn)率為固定化酵母發(fā)酵反應性能評價指標，對海藻酸鈉用量、底物糖濃度和酵母用量進行L9(3)4正交實驗設計，探討優(yōu)化實驗(表1～2)。

表1L9(3)4正交實驗水平因素表

Table1OrthogonalexperimenttablelevelfactorsofL9(3)4

水平因素LevelfactorsA海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比Theratioofsodiumalginate?yeast(g·g-1)B底物糖濃度Substratesugarconcentration(%)C酵母用量Yeastamount(g)11∶420121∶2301．531∶1．5403

表2L9(3)4正交實驗結果

Table2OrthogonalarraydesignL9(3)4andexperimentalresults

因素FactorABC實驗結果Results111176．37212279．73313374．90421282．59522381．16623179．18731377．69832180．59933278．49K177．0078．8878．71K280．9780．4980．27K378．9277．5277．92R3．9772．9702．353最優(yōu)條件A2B2C2

直觀分析表2正交實驗的結果，根據(jù)均值(K)，可知最優(yōu)實驗條件為A2B2C2。，海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比1∶2 g·g-1，底物糖濃度30%，酵母用量1.5 g為實驗最優(yōu)條件。從各因素極差值(R)可知，A>B>C；對固定化酵母發(fā)酵制乙醇的主次順序為：海藻酸鈉用量>底物糖濃度>酵母用量。

固定化酵母發(fā)酵制乙醇產(chǎn)率的方差分析數(shù)據(jù)見表3。查表有F0.01(2,2)=99；F0.05(2,2)=19；F0.1(2,2)=9。當F>F0.01，有高度顯著影響；當F0.01>F>F0.05，有顯著影響；當F0.05>F>F0.1時，有一定的影響；當F

計算結果表明，因素A的FA，為F0.01>FA>F0.05；因素B的FB，為F0.05>FB>F0.1；因素C的FC，為F0.05>FC>F0.1；因此，因素A對固定化酵母發(fā)酵制乙醇產(chǎn)率的影響顯著，因素B和因素C對固定化酵母發(fā)酵制乙醇產(chǎn)率有一定的影響。

表3 方差分析

通過正交實驗得到固定化酵母發(fā)酵葡萄糖液制乙醇的優(yōu)化工藝條件：海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比1∶2 g·g-1，底物糖濃度30%，酵母用量1.5 g；三次固定化酵母發(fā)酵制乙醇重復實驗的結果為84.73%，83.54%，82.77%，均值為83.68%，表明基本穩(wěn)定，重復性較好。

圖6 固定化酵母重復次數(shù)對乙醇產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of times of repetition on immobilized yeast ethanol productivity

2.4 固定化酵母重復發(fā)酵能力

由圖6可知，隨著固定化酵母重復利用次數(shù)的增加，乙醇轉化率逐漸降低，其中第四次發(fā)酵液乙醇產(chǎn)率為54.94%，在第四次循環(huán)發(fā)酵結束后，固定化酵母表面開始出現(xiàn)細裂紋。第六次發(fā)酵液底物糖轉化率為38.63%。固定化酵母重復發(fā)酵實驗結果表明，固定化酵母發(fā)酵能力隨發(fā)酵次數(shù)的增加逐漸下降，循環(huán)利用發(fā)酵四次后，固定化酵母包埋能力和發(fā)酵性能下降較大，這主要是由于酒精發(fā)酵過程中，乙醇濃度逐漸增大，產(chǎn)生反饋抑制，而且濃度越大，抑制作用越強。乙醇不僅可以抑制糖代謝和轉運途徑，還可抑制細胞膜上ATP酶活性，最終削弱細胞膜對酵母細胞的保護作用。另外，乙醇還可引起細胞內(nèi)線粒體的氧化損傷。隨著循環(huán)利用次數(shù)的增加，乙醇對酵母細胞抑制作用時間就越長，從而對酵母細胞造成不可逆的破壞，使部分菌體喪失了發(fā)酵能力，發(fā)酵性能逐漸下降[15]。

3 結論

通過單因素實驗確定固定化酵母發(fā)酵制乙醇工藝各個因素取值范圍，并通過正交實驗得到優(yōu)化工藝條件：海藻酸鈉與酵母質(zhì)量比1∶2 g·g-1，底物糖濃度30%，酵母用量1.5 g。固定化酵母發(fā)酵120 h乙醇產(chǎn)率均值為83.68%，表明實驗結果基本穩(wěn)定，重復性較好。葡萄糖溶液最優(yōu)條件下固定化酵母發(fā)酵可重復使用四次，第四次乙醇產(chǎn)率為54.94%；為下一步塔拉纖維剩余物酶解糖液發(fā)酵制備乙醇提供了理論基礎。

1.呂麗麗.電子級沒食子酸制備過程中若干基礎問題研究[D].杭州:浙江大學,2009:18-22.

2.路祺,彪林海,徐蕾,等.漂白前后塔拉纖維剩余物的酶動力學分析[J].植物研究,2015,35(5):791-794.

3.路祺,高悅,項鳳影,等.纖維剩余物酶解工藝研究[J].植物研究,2015,35(3):476-480.

4.劉國庫,丁亞光,胡勝男,等.柑橘果酒酵母菌發(fā)酵特性的研究[J].食品與發(fā)酵科技,2014,50(1):81-84.

5.何東東.產(chǎn)朊假絲酵母的發(fā)酵及功能性質(zhì)研究[D].天津:天津商業(yè)大學,2010:3-6.

6.Liu Ronghou,Li Jinxia L,Shen Fei,et al.Bioethanol Fermentation from Stalk Juice of Sweet Sorghum by Immobilized Yeast[J].Journal of Shanghai Jiaotong University,2005,S1:146-151.

7.Ken-ichi I,Mitsutoshi N,Hiroyuki S A.Rapid Ethanol Fermentation for Soy Sauce Production by Immobilized Yeast Cells[J].Agricultural and Biological Chemistry,1991,55(9):2201-2207.

8.陳智理,楊昌鵬,郭靜婕.固定化酵母發(fā)酵生產(chǎn)果酒研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2009,37(29):14357-14359.

9.鄭春明.多孔無機/聚合物復合材料的制備,表征及在制糖工業(yè)的中試應用[D].天津:南開大學,2009:5-10.

10.紀鐵鵬,肖冬光.雙菌順次發(fā)酵釀制乳清酒工藝研究[J].釀酒科技,2014,9(4):68-71.

11.甄會英,王頡,李長文,等.氣相色譜外標法測定葡萄酒中高級醇[J].中外葡萄與葡萄酒,2005,01:12-15.

12.Zhuang GuangChao,Lin Yushih,Marcus E,et al.Gas chromatographic analysis of methanol and ethanol in marine sediment pore waters:Validation and implementation of three pretreatment techniques[J].Marine Chemistry,2014,160:82-90.

13.吳諳宇.離子液體處理稻稈纖維素制備乙醇的研究[D].哈爾濱:哈爾濱理工大學,2014:3-20.

14.喻本青,閆云君,劉濤,等.海藻酸-SiO2雜化凝膠固定化洋蔥伯克霍爾德菌脂肪酶的研究[J].生物加工過程,2010,8(1):16-22.

15.張小玲,李文,王靖楠,等.固定化酵母重復發(fā)酵性能調(diào)控[J].中國環(huán)境科學,2014,34(7):1797-1803.

EthanolProductionTechnologybyFermentationformFiberResidues

MENG Yong-Bin1,2XU Lei1,2ZHANG Zhi-Dong1,2LU Qi1,2LIU Ying1,2NIE Si-Ming1,2ZU Yuan-Gang1,2*

(1.National Local Joint Engineering Laboratory for Ecological utilization of biological resources,Harbin 150040；2.Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Northeast Forestry University,Ministry of Education,Harbin 150040)

We studied the effects of various factors on the yield of ethanol from enzymatic hydrolysate of Tara fiber residues by the single factor experiment, and then optimized ethanol production technology by orthogonal experiments. The optimum conditions were the ratio of sodium alginate-yeast of 1∶2 g·g-1, substrate sugar concentration of 30%, the amount of yeast of 1.5 g, and fermentation time of 120 h, with the yield of ethanol of 83.68%.

fiber residues;fermentation;ethanol;immobilized yeast

黑龍江省博士后資助項目(LBH-Z14015)；中央高校基本科研業(yè)務費專項資金項目(2572014EA01-03)

孟永斌(1990—)，男，碩士研究生，主要從事生物質(zhì)資源化利用研究。

* 通信作者：E-mail:zuyuangangnefu@126.com

2015-09-11

Q539.3

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.01.023