王 化 周麗萍 李夢莎 朱良玉 穆立薔 倪紅偉*

(1.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，濕地與生態(tài)保育國家與地方聯(lián)合工程實驗室，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040)

微波輔助提取暴馬丁香中紫丁香苷和橄欖苦苷的工藝研究

王 化1,2周麗萍1,2李夢莎1朱良玉1,2穆立薔2倪紅偉1*

(1.黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，濕地與生態(tài)保育國家與地方聯(lián)合工程實驗室，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040)

主要采用微波輔助提取法對暴馬丁香中紫丁香苷和橄欖苦苷兩種重要活性成分的同時提取工藝進行了研究，通過Box-Behnken響應(yīng)面法分析建立二次多項式數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明，工藝所及因素對紫丁香苷和橄欖苦苷兩種物質(zhì)總得率影響大小的順序是乙醇體積分數(shù)>微波時間>微波功率，提取工藝最佳參數(shù)條件為：浸泡時間1 h，45%乙醇溶液，料液比例1∶20 g·mL-1，微波功率600 W，提取時間5 min。在此最佳條件下，紫丁香苷和橄欖苦苷總得率5.28%±0.102%。該工藝高效省時，投入一批原料，即可同時提取其中的紫丁香苷和橄欖苦苷，有利于暴馬丁香資源的綜合加工利用。

暴馬丁香;紫丁香苷;橄欖苦苷;微波輔助提取

暴馬丁香(Syringareticulata)木犀科(Oleaceae)丁香屬(Syringa)植物，為溫性樹種，適應(yīng)性強，喜光，稍耐陰，具有一定耐寒和耐旱能力，其樹干、樹皮、枝條均能入藥[1]，是重要的藥源植物。藥理學(xué)實驗證明暴馬丁香在清肺、祛痰、消炎、止咳、平喘、利尿等方面具有良好功效[2]，研究人員已從其中分離鑒定出紫丁香苷、橄欖苦苷、鵝掌楸苷、女貞子苷、齊墩果酸、白樺脂酸、槲皮素等40余種活性成分[3～5]，其中的紫丁香苷和橄欖苦苷含量較高，是具有多種藥理活性的天然藥用成分。

紫丁香苷又名刺五加苷B，具有調(diào)節(jié)機體免疫[6]、保肝[7]、抗炎[8]、降血壓[9]、提高耐受能力[10]等藥理活性。橄欖苦苷是一種無毒的裂環(huán)烯醚萜苷類化合物，具有抗氧化[11]、抗炎[12]、抗菌[13]、抗癌[14]、抗病毒[15]、抗動脈粥樣等活性[16]，及降血脂[17]、降糖[18]、保護心臟[19]的作用。兩種物質(zhì)在藥品、保健品和化妝品領(lǐng)域均有應(yīng)用，國際國內(nèi)市場的需求量逐年增大，供不應(yīng)求。李明華等[20]測定了不同產(chǎn)地暴馬子皮中紫丁香苷和橄欖苦苷的含量，最高可達2.76%和16.27%，表明從暴馬丁香中分離紫丁香苷和橄欖苦苷具有可行性。本文從提高暴馬丁香原料的有效利用率，實現(xiàn)資源綜合利用的角度出發(fā)，對同時提取暴馬丁香中橄欖苦苷及紫丁香苷的工藝進行了研究。

1 實驗材料與儀器

1.1 材料、試劑

暴馬丁香枝條，2014年采集于黑龍江省哈爾濱市；紫丁香苷和橄欖苦苷對照品(≥98%)購自天津一方科技有限公司；甲醇(色譜純)，無水乙醇(分析純)，超純水自制。

1.2 儀器

Waters高效液相色譜儀e2695-2998液相檢測系統(tǒng)；C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm，waters公司)；XH-100A型微波萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)裝置示意圖如圖1所示；3K30型離心機(美國Sigma公司)；Milli-Q超純水儀(法國默克化工技術(shù)有限公司)；手提式高速中藥粉碎機(溫嶺市大德中藥機械有限公司)；BS210S電子天平(北京Sartorious有限公司)。

圖1 微波提取裝置示意圖Fig.1 Microwave extraction device

2 實驗方法

2.1 HPLC測定

2.1.1 HPLC檢測條件

流動相為甲醇(A)-0.5%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～25 min，10%A→40%A)；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為230 nm；進樣量為10 μL；柱溫30℃。

2.1.2 標準曲線繪制

精密稱定紫丁香苷和橄欖苦苷對照品15 mg，用50%甲醇定容于5 mL容量瓶中，制成濃度為3.0 mg·mL-1的紫丁香苷和橄欖苦苷溶液作為對照品儲備液。精密量取對照品的儲備液，加入濃度為50%的甲醇，配制濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mg·mL-1的對照品溶液，分別以兩種對照品濃度(mg·mL-1)為橫坐標(X)，以HPLC檢測得到峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，進行線性回歸得紫丁香苷回歸方程為：Y1=232 273 42.63X1-253 568.20，R2=0.999 0；得橄欖苦苷回歸方程為：Y2=145 489 27.44X2+184 292.65，R2=0.999 1。結(jié)果表明：紫丁香苷和橄欖苦苷濃度在0.1～3.0 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2暴馬丁香中紫丁香苷、橄欖苦苷提取流程及含量測定

分別取暴馬丁香粉末1.00 g，置于100 mL錐形瓶中，分別加入一定體積、不同體積分數(shù)的乙醇溶液，浸泡一段時間后，在微波不同功率作用下，提取一定時間。將適量提取液至于離心管中，12 000 r·min-1，離心15 min，取上清液至于樣品瓶中進行HPLC檢測，每個樣品重復(fù)3次。得率計算公式:

YS=CS×V/1000/M×100%

(1)

YO=CO×V/1000/M×100%Y=YS+YO

(2)

式中:YS是紫丁香苷得率(%)；YO是橄欖苦苷得率(%)；Y是總得率(%)；CS是提取液中紫丁香苷的濃度(mg·mL-1)；CO是提取液中橄欖苦苷的濃度(mg·mL-1)；V是提取液的體積(mL)；M是原料的質(zhì)量(g)。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助提取暴馬丁香中紫丁香苷和橄欖苦苷的最佳條件

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，在預(yù)實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分數(shù)、微波時間和微波功率3個實驗因素和3個水平，對提取工藝進行響應(yīng)面分析實驗，實驗因素及水平見表1。

表1 因素水平表

3 結(jié)果與討論

3.1 初步實驗

為找出對暴馬丁香中紫丁香苷和橄欖苦苷得率影響比較大的因素，首先對選定因素進行了初步考察，選定因素包括：浸泡時間、乙醇體積分數(shù)、料液比例、微波功率、微波時間。料液比例對紫丁香苷和橄欖苦苷提取得率的影響如圖2(a)所示，料液比例1∶10和1∶15 g·mL-1時總得率均低于其它各組，1∶20～1∶30 g·mL-1條件下并未見提取率的顯著提高。因此，選取料液比例為1∶20 g·mL-1被確定為最佳條件。浸泡時間對紫丁香苷、橄欖苦苷提取得率的影響如圖2(b)所示，干燥的暴馬丁香原料提取前在提取溶劑中浸泡1、2、3、4 h均能提高紫丁香苷和橄欖苦苷的提取得率。隨著浸泡時間的延長，提取率并沒有顯著的提高，因此，選定最佳浸泡時間為1 h。

圖2 料液比例及浸泡時間對提取得率的影響Fig.2 Effects of solid to liquid ratio(a) and soaking time(b)

經(jīng)過初步實驗之后，浸泡時間1 h，料液比例為1∶20 g·mL-1被確定為最佳條件。乙醇體積分數(shù)、微波功率、微波時間對提取得率的影響較大，進行進一步優(yōu)化實驗。

3.2響應(yīng)面法優(yōu)選暴馬丁香中紫丁香苷和橄欖苦苷提取工藝的研究

3.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化實驗結(jié)果及擬合模型

在初步實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken響應(yīng)面分析法進行設(shè)計。實驗具體設(shè)置顯示在表2中，17個實驗中中心實驗5個，用以分析實驗誤差；析因?qū)嶒?2個。以暴馬丁香中紫丁香苷和橄欖苦苷總得率(Y)為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合各影響因子與響應(yīng)值的回歸方程為：

Y=5.24+0.17A-0.047B+0.19C-0.005AB+0.063AC-0.01BC-0.23A2-0.45B2-0.25C2

(3)

表2響應(yīng)面分析設(shè)計及實驗結(jié)果

Table2Designandexperimentresultofresponsesurfacemethodology

序號No．A：乙醇體積分數(shù)Thevolumefractionofethanol(%)B：微波功率Microwavepower(W)C：微波時間Microwavetime(min)YS(%)YO(%)Y(%)15080040．624．084．7024040060．963．864．8233080040．953．424．3745040040．634．124．7553060020．983．474．4564060041．034．225．2575060060．774．415．1884060041．054．265．3194060041．014．185．19104060041．034．215．24114040020．783．624．40124080020．813．464．27135060020．544．144．68144060041．024．195．21153060061．093．614．70163040041．053．354．40174080060．913．744．65

通過表3的方差分析結(jié)果可以看到總得率回歸方程各變量對指標影響的顯著性。概率P值越小，表明相應(yīng)變量的顯著程度也越高。各因素中A、C、A2、B2、C2對總得率的影響均為極顯著(P<0.01)，B和AC對總得率的影響為顯著(P<0.05)，可見，各個具體的試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，且影響大小的順序是乙醇體積分數(shù)>微波時間>微波功率?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)r=97.00%，表明可以利用該模型對暴馬丁香中紫丁香苷和橄欖苦苷提取效果進行分析。失擬項是用來評估方程可靠性的一個重要數(shù)據(jù)，方程分析結(jié)果顯示失擬項F值為1.03，不顯著，表明方程擬合的比較好，可以很好地描述各個因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，利用該方程確定暴馬丁香中兩種物質(zhì)的最佳提取條件。由二次回歸模型得到每兩個因素同時對響應(yīng)值的影響結(jié)果如圖3所示?？偟寐实捻憫?yīng)曲面均為開口向下凸面，且中心在考察區(qū)域之內(nèi)，表明在考察區(qū)域范圍內(nèi)存在響應(yīng)值的最大值。通過Design-Expert 8.0.6軟件分析，同時提取暴馬丁香中紫丁香苷和橄欖苦苷的最佳條件為：乙醇體積分數(shù)44.30%，微波功率為587.98 W，提取時間4.87 min，總得率為5.31%。

表3總得率回歸方程方差分析表

Table3Varianceanalysistableofregressionequationforsyringinandoleuropein

方差來源Source總和Sumofsquares自由度df均方MeansquareF值FvalueP值Prob>F模型Model2．0792．03108．44<0．0001A：乙醇體積分數(shù)Thevolumefractionofethanol(%)0．2410．24113．65<0．0001B：微波功率Microwavepower(W)0．01810．0188．490．0225C：微波時間Microwavetime(min)0．3010．30141．23<0．001AB1．000×10-411．000×10-40．0470．8344AC0．01610．0167．350．0301BC4．000×10-414．000×10-40．190．6774A20．2310．23108．26<0．0001B20．8610．86403．47<0．0001C20．2710．27127．58<0．0001殘差Residual0．01572．125×10-3失擬項Lackoffit6．475×10-332．158×10-31．030．4695凈誤差Pureerror8．400×10-342．100×10-3總離差Cortotal2．0916

3.2.2 最佳工藝條件的驗證實驗

對優(yōu)化所得最佳條件進行驗證實驗，為方便操作，選取各條件臨近整數(shù)值，具體為：稱取暴馬丁香樹枝粉末1.00 g，按照提取溶劑為體積分數(shù)45%的乙醇溶液，浸泡時間1 h，料液比例為1∶20 g·mL-1，微波功率600 W，提取時間為5 min，提取液經(jīng)離心后進行HPLC檢測，計算紫丁香苷和橄欖苦苷總得率，重復(fù)5次。實際測得紫丁香苷得率0.94±0.03%，橄欖苦苷得率為4.34±0.07%，總得率為5.28±0.102%，與模型預(yù)測值之間誤差為0.56%，驗證了模型的正確性。

圖3 各因素對總提取率的響應(yīng)曲面圖Fig.3 Effects of different factors on the yields of syringin and oleuropein

3.3 微波輔助提取法與其他常規(guī)提取方法的比較

本研究選擇了常規(guī)的常溫浸泡提取和加熱回流提取方法與微波輔助提取法進行比較。原料1.00 g，提取溶劑為體積分數(shù)45%的乙醇，料液比例1∶20 g·mL-1，3種方法提取效果的比較結(jié)果如表4所示。

由微波輔助提取法與常溫浸泡提取法和加熱回流提取法的比較結(jié)果可以看出，微波輔助提取暴馬丁香中的紫丁香苷和橄欖苦苷的得率高，且所需時間短，提取效果明顯優(yōu)于其他兩種方法。該工藝操作簡單，微波穿透力強，能夠使植物的細胞組織變形或破壁，增大了樣品與提取溶液間的接觸面積，有利于紫丁香苷和橄欖苦苷的溶出，可以充分、快速地提取有效成分，提高提取效率。

表4不同提取方法比較

Table4Comparisonofdifferentextractionmethods

方法名稱Methods提取溫度Temperature(℃)消耗時間Time(min)紫丁香苷得率Yieldofsyringin(%)橄欖苦苷得率Yieldofoleuropein(%)總得率Yieldofsyringinandoleuropein(%)常溫浸泡提取Roomtemperatureextraction254800．311．441．75加熱回流提取Refluxextraction802400．762．403．16微波輔助提取Microwaveassistedextraction80650．944．345．28

4 結(jié)論

本實驗首次采用微波輔助提取法從暴馬丁香中同時提取紫丁香苷及橄欖苦苷，對于浸泡時間、料液比例、乙醇體積分數(shù)、微波功率及微波時間等因素對提取工藝的影響進行了考察，采用響應(yīng)面法進行工藝優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝條件為：浸泡時間1 h、料液比例為1∶20 g·mL-1、乙醇體積分數(shù)45%、微波功率600 W、微波時間5 min。最佳條件下暴馬丁香紫丁香苷和橄欖苦苷的總得率為5.28±0.102%，為實現(xiàn)暴馬丁香資源高附加值的綜合加工利用奠定了基礎(chǔ)。

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OptimizationofMicrowave-assistedExtractionofSyringinandOleuropeinfromSyringareticulata

WANG Hua1,2ZHOU Li-Ping1,2LI Meng-Sha1ZHU Liang-Yu1,2MU Li-Qiang2NI Hong-Wei1*

(1.Institute of Natural Resources and Ecology,Heilongjiang Academy of Sciences,National Wetland and Ecological Conservation Engineering Lab,Harbin 150040；2.Northeast Forestry University,Harbin 150040)

We used microwave-assisted extraction to extract syringin and oleuropein from Syringa reticulate, and optimized the extraction process by the Box-Behnken response surface method. The order of the effect of factors on the yield of syringin and oleuropein was the concentration of ethanol>the microwave time>microwave power. The optimum conditions for the extraction were as follows: soaking time of 1 h, ethanol concentration of 45%, ratio of solid to liquid of 1∶20 g·mL-1, microwave output power of 600 W, and extraction time of 5 min. With the optimum extraction conditions, the yield of syringin and oleuropein from Syringa reticulate was 5.28%±0.102%. The microwave-assisted extraction was efficient and rapid for extraction syringin and oleuropein from Syringa reticulate, and was benefit for the comprehensive utilization of Syringa reticulate.

Syringareticulate;syringin;oleuropein;microwave-assisted extraction

黑龍江省科學(xué)院青年創(chuàng)新基金

王化(1981—)，女，助理研究員，博士，主要從事植物天然產(chǎn)物研發(fā)。

* 通信作者：E-mail：nihongwei2000@163.com

2015-05-18

TQ423

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.01.020