何文平 王新霞 張旭強(qiáng) 楊鵬軍 仇奕之 楊 寧

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

低溫脅迫下外源脫落酸對高山離子芥抗氧化酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

何文平 王新霞 張旭強(qiáng) 楊鵬軍 仇奕之 楊 寧*

(西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070)

以高山離子芥(Chorisporabungeana)試管苗為實驗材料，研究了低溫冷害(4℃)、低溫凍害(-4℃)和臨界溫度(0℃)脅迫下外源ABA對抗氧化酶及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響。結(jié)果表明在4和-4℃脅迫下陰性對照組中SOD和CAT活性高于空白對照組；POD活性在4℃脅迫下高于空白對照組；APX活性在4和-4℃脅迫的晚期升高。與此同時，陰性對照組中膜的相對電導(dǎo)率增加、脯氨酸、可溶性糖含量降低。0℃脅迫下陰性對照組中POD活性降低；APX活性呈波動式變化；脯氨酸和可溶性糖含量分別在72和48 h時高于空白對照組；而可溶性蛋白含量低于空白對照組。添加外源ABA處理后4、-4和0℃脅迫下POD、SOD、CAT和APX活性較陰性對照組均得到不同程度增加；ABA的處理顯著降低了細(xì)胞膜的相對電導(dǎo)率，提高脯氨酸，可溶性糖和可溶性蛋白的含量。

低溫脅迫；高山離子芥；脫落酸；抗氧化酶；滲透調(diào)節(jié)物

在我國西北地區(qū)極端低溫是其氣候變化的主要特征之一。低溫冷害和凍害對農(nóng)作物正常生長產(chǎn)生了極大的危害[1]。據(jù)統(tǒng)計，全球每年因低溫傷害造成的農(nóng)林作物損失高達(dá)數(shù)千億元[2]。除此之外，低溫往往與環(huán)境中其它的脅迫因子如干旱，紫外輻射等結(jié)合起來形成復(fù)雜的脅迫條件進(jìn)而加劇了對農(nóng)林作物的傷害。因此研究在低溫環(huán)境中如何提高植物的抗寒性，預(yù)防低溫對植物造成傷害具有重要的意義。在很早的時候人們發(fā)現(xiàn)植物激素與植物的抗寒性可能存在某種聯(lián)系，因為在低溫鍛煉過程中油菜、玉米等作物中游離ABA含量增加，進(jìn)而有人提出低溫引起植物中ABA含量的積累[3]。隨后的研究表明，植物在感知非生物脅迫的過程中，ABA的生物合成是其早期事件中的一個[4]，然后產(chǎn)生的ABA被轉(zhuǎn)運(yùn)到植物體中的各個地方并激活一些列的生理過程促使植物適應(yīng)環(huán)境的脅迫[5]。植物遭受低溫脅迫時往往伴隨著ROS的過量產(chǎn)生并且影響植物的滲透調(diào)節(jié)作用，ROS對細(xì)胞中生物大分子如蛋白質(zhì)，DNA，生物膜造成氧化損傷，進(jìn)而危害細(xì)胞正常的新陳代謝；當(dāng)滲透調(diào)節(jié)受到破壞后，會改變細(xì)胞膨壓及細(xì)胞濃度，進(jìn)而影響細(xì)胞水分的正常供給[6～8]。而在植物中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)是抗氧化酶系統(tǒng)的主要組成部分[9～10]。抗氧化酶在逆境中清除過量的ROS，使植物體中的ROS含量維持在正常生理平衡中。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與植物抗寒性關(guān)系密切，脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖作為滲透調(diào)節(jié)的主要物質(zhì)，在一定脅迫下維持植物細(xì)胞的正常膨壓和生理代謝，并且對細(xì)胞無毒，對代謝無抑制作用[11]。因此在低溫脅迫下抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化在一定程度上能反應(yīng)植物抗寒性的高低。在前人的研究中關(guān)于在低溫脅迫下ABA對植物中抗氧化酶及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響的研究比較多，但是對生長在高山冰緣極端環(huán)境中相關(guān)植物抗逆性的研究較少。高山冰緣多年生草本植物高山離子芥生境溫度寒冷是研究植物抵抗低溫機(jī)制的理想材料[12～13]。

本研究中，以高山離子芥試管苗為材料，以低溫為脅迫因子，研究在低溫冷害(4℃)，低溫凍害(-4℃)及兩者的臨界溫度(0℃)脅迫下外源ABA對高山離子芥抗氧化系統(tǒng)及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響，以期揭示植物激素ABA對高山離子芥抗寒性的作用機(jī)制，進(jìn)而為深入了解ABA參與植物抗寒性響應(yīng)的低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)鋪墊實驗依據(jù)。

1 材料與方法

材料的培養(yǎng)：高山離子芥試管苗的培養(yǎng)參照楊寧等方法[14]，將高山離子芥(Chorasporabungeana)試管苗接種于培養(yǎng)基(MS+0.2 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+7.8 g·L-1瓊脂，pH5.8)中，于25℃,2 000 lx,12 h光周期脅迫下培養(yǎng)。ABA的處理：選取生長旺盛，長勢良好一致的高山離子芥試管苗接種于含50 μmol·L-1ABA的MS培養(yǎng)基中，每瓶至少接種3株，每處理3個平行。以上處理的材料均置于人工培養(yǎng)箱中，分別在4、0和-4℃中低溫培養(yǎng)6、24、48、72 h，然后在各脅迫時間點(diǎn)取材實驗。實驗設(shè)置0 h作為空白對照組，設(shè)置未添加ABA處理的處理組作為陰性對照組，設(shè)置添加ABA處理的處理組為實驗組。

2 測定方法

SOD活性的測定參照Dhindsa氮藍(lán)四銼(NBT)光照化學(xué)合成還原法[15];用愈創(chuàng)木酚顯色法測定POD活性[16];CAT活性測定參照李仕飛等的方法[17];APX活性的測定參照李忠光等的方法[18]。細(xì)胞膜透性采用電導(dǎo)率法測定[19],可溶性糖含量的測定參照張憲政蒽酮比色法[20]，可溶性蛋白含量的測定參照考馬斯亮藍(lán)G-250法[21]，脯氨酸含量的測定，參照Bates磺基水楊酸法[22]。

本實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0對組間隨時間變化的差異性多重比較采用LSD法分析，作圖在origin pro9.0中進(jìn)行。

3 結(jié)果與分析

3.1低溫脅迫下，ABA對高山離子芥試管苗葉片中保護(hù)酶活性的影響

用50 μmol·L-1ABA處理高山離子芥試管苗并置于4、0和-4℃條件下培養(yǎng)，SOD活性變化如圖1所示。在4、0和-4℃脅迫下陰性對照組中SOD活性較空白對照組均得到不同程度的提高。當(dāng)添加ABA處理后SOD活性與陰性對照組相比進(jìn)一步提高。在4℃脅迫下，ABA處理組SOD活性在6～72 h過程中分別較陰性對照組上升663.42%、312.26%、341.31%和328.08%；在0℃脅迫下ABA處理組SOD活性較陰性對照組上升1 532.26%、1 882.12%、1 786.72%和320.89%；在-4℃脅迫下ABA處理組SOD活性較陰性對照組上升4 502.35%、8 997.09%、5 687.96%和2 337.39%。

圖1 4、0和-4℃脅迫下50 μmol·L-1ABA對高山離子芥試管苗中SOD活性的影響 “*”表示在同一溫度脅迫下陰性對照組與實驗組在P<0.05水平上具有差異顯著性，下同。Fig.1 The effects of 50 μmol·L-1 exogenous ABA on SOD activity in C.bungeana plantlets under 4,0 and -4℃ The“*” at the same temperature indicated the significant differences between the negative control group and the experimental group at P<0.05 level,the same as below.

POD活性變化如圖2所示。在4℃脅迫下陰性對照組中POD活性在6～72 h過程中較0 h處理組升高。在0℃脅迫下陰性對照組POD活性除48 h處理組與空白對照組無顯著差異外，其余均顯著低于空白對照組POD活性。在-4℃脅迫下陰性對照組POD活性在0～72 h過程中，表現(xiàn)出降低—增加—降低—增加的波動變化。添加ABA處理后，在4、0和-4℃脅迫下POD活性較陰性對照組表現(xiàn)出不同程度的提高。在4℃脅迫下ABA處理組POD活性在6～72 h過程中分別較陰性對照組POD活性上升154.68%、210.98%、317.57%和116.33%；0℃脅迫下ABA處理組POD活性較陰性對照組POD活性上升669.51%、399.68%、371.76%和370.19%；-4℃脅迫下ABA處理組POD活較陰性對照組POD活性上升187.18%、105.73%、259.65%和169.04%。

圖2 4、0和-4℃脅迫下高山離子芥試管苗中POD活性的變化Fig.2 The effects of 50 μmol·L-1 exogenous ABA on POD activity in C.bungeana plantlets under 4,0 and -4℃

CAT活性的變化如圖3所示。在4、0和-4℃脅迫下6～72 h過程中，陰性對照組CAT活性均較空白對照組CAT活性升高。當(dāng)添加ABA處理后3個溫度脅迫下的CAT活性高于陰性對照組中CAT活性。在4℃脅迫下ABA處理組CAT活性在6～72 h過程較陰性對照組CAT活性分別上升237.25%、975.44%、221.70%和115.32%;0℃脅迫下ABA處理組CAT活性較陰性對照組CAT活性上升177.93%、291.56%、214.77%和172.98%；-4℃脅迫下ABA處理組CAT活性較陰性對照組CAT活性上升209.82%、129.37%、399.43%和272.84%。

圖3 4、0和-4℃脅迫下高山離子芥試管苗中CAT活性的變化Fig.3 The effects of 50 μmol·L-1 exogenous ABA on CAT activity in C.bungeana plantlets under 4,0 and -4℃

APX活性變化如圖4所示。在4和-4℃脅迫下陰性對照組APX活性在6、24和48 h時低于空白對照組，到72 h活性升高。在0℃脅迫下陰性對照組APX活性在6～72 h過程中表現(xiàn)出升高—降低—升高的趨勢。添加ABA處理后3個溫度脅迫下APX活性在6～72 h過程中均較陰性對照組APX活性均升高。4℃脅迫下ABA處理組APX活性在6～72 h過程中較陰性對照組APX活性升高172.08%、135.86%、132.77%和129.81%；0℃脅迫下ABA處理組APX活性較陰性對照組APX活性升高108.88%、186.17%、139.23%和109.67%；-4℃脅迫下ABA處理組APX活性較陰性對照組APX活性上升108.10%、429.14%、205.12%和196.04%。

圖4 4、0和-4℃脅迫下高山離子芥試管苗中CAT活性的變化Fig.4 The effects of 50 μmol·L-1 exogenous ABA on APX activity in C.bungeana plantlets under 4,0 and -4℃

3.2低溫脅迫下ABA對高山離子芥試管苗葉片細(xì)胞膜相對透性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

50 μmol·L-1ABA處理高山離子芥試管苗并置于4、0和-4℃脅迫下培養(yǎng)，相對電導(dǎo)率的變化如圖5所示。在4、0和-4℃脅迫下陰性對照組中相對電導(dǎo)率成增—降—增的變化趨勢。陰性對照組中在6 h時3個溫度脅迫下相對電導(dǎo)率均增加，隨后4和0℃脅迫下相對電導(dǎo)率均在24 h后降低；-4℃脅迫下電導(dǎo)率下降出現(xiàn)在6 h。添加ABA處理后3個溫度脅迫下相對電導(dǎo)率較陰性對照組出現(xiàn)不同程度降低。在4℃脅迫下ABA處理組相對電導(dǎo)率較陰性對照組在6～72 h過程中下降6.45%、37.14%、33.33%和15.56%。0℃脅迫下ABA處理組相對電導(dǎo)率較陰性對照組下降26.15%、34.72%、9.38%和36.00%。-4℃脅迫下ABA處理組相對電導(dǎo)率較陰性對照組下降31.34%、24.39%、60.22%和7.86%。

圖5 4、0和-4℃脅迫下高山離子芥試管苗中相對電導(dǎo)率的變化Fig.5 The effects of 50 μmol·L-1 exogenous ABA on relative conductivity in C.bungeana plantlets under 4,0 and -4℃

脯氨酸含量變化如圖6所示。4和-4℃脅迫下，陰性對照組中脯氨酸含量與空白對照組相比均表現(xiàn)出不同程度的降低，而0℃脅迫下脯氨酸含量表現(xiàn)出降—增的趨勢。當(dāng)添加ABA處理后，在4、0和-4℃脅迫下脯氨酸含量較陰性對照組出現(xiàn)不同程度的升高。其中在4℃脅迫下ABA處理組較陰性對照組在6～72 h過程中分別升高了261.50%、221.19%、309.68%和218.68%；0℃脅迫下ABA處理組較陰性對照組升高了134.64%、123.00%、117.26%和103.40%；-4℃脅迫下ABA處理組較陰性對照組升高了146.28%、111.38%、63.66%和118.64%。

可溶性糖含量變化如圖7所示。陰性對照組中可溶性糖含量在4℃脅迫下呈降—增的趨勢，到72 h時與空白對照組相比沒有顯著差異。0℃脅迫下，陰性對照組中除48 h時可溶性糖含量高于空白對照組外，其余時間點(diǎn)均低于空白對照組。在-4℃脅迫下可溶性糖含量均低于空白對照組。添加ABA處理后3個溫度下可溶性糖含量均較陰性對照組升高。在4℃脅迫下ABA處理組與陰性對照組相比在6～72 h過程中分別升高了151.50%、169.79%、150.61%和153.50%；0℃脅迫下ABA處理組較陰性對照組升高了146.01%、168.95%、108.35%和105.09%；-4℃脅迫下ABA處理組較陰性對照組升高了141.91%、146.01%、194.38%和144.96%。

圖7 4、0和-4℃脅迫下高山離子芥試管苗中可溶性糖含量的變化Fig.7 The effects of 50 μmol·L-1 exogenous ABA on soluble sugar in C.bungeana plantlets under 4,0 and -4℃

可溶性蛋白含量的變化如圖8所示。在4和-4℃脅迫下6 h時陰性對照組中可溶性蛋白含量增加隨后降低；但在4℃脅迫6～72 h過程中可溶性蛋白含量均高于空白對照組。而0℃脅迫下，陰性對照組中可溶性蛋白含量在6～72 h過程中均低于空白對照組。添加ABA處理后在3個溫度脅迫下各時間點(diǎn)上可溶性蛋白含量均增加且高于陰性對照組中可溶性蛋白含量。4℃脅迫下ABA處理組較陰性對照組在6～72 h過程中分別升高了138.56%、130.53%、115.14%和129.78%；0℃脅迫下ABA處理組較陰性對照組升高了151.18%、125.45%、118.26%和129.67%；-4℃脅迫下ABA處理組較陰性對照組升高了112.69%、204.81%、327.41%和425.35%。

圖8 4、0和-4℃脅迫下高山離子芥試管苗中可溶性蛋白含量的變化Fig.8 The effects of 50 μmol·L-1 exogenous ABA on soluble proteinin C.bungeana plantlets under 4,0 and -4℃

4 討論

4.1低溫脅迫下ABA對高山離子芥試管苗抗氧化酶活性的影響

POD，SOD，CAT和APX是抗氧化過程中重要的酶，SOD作為第一道防線來清除細(xì)胞中多余的超氧陰離子。而POD、CAT和APX清除H2O2生成水和氧氣[23～24]。在本研究中，陰性對照組SOD活性和CAT活性在4和-4℃脅迫下與空白對照相比均升高，說明4和-4℃激活了植物抗氧化的第一道防線，引發(fā)下游清除H2O2的反應(yīng)(圖1和3)。抗氧化酶之間的作用具有協(xié)同性[23]。陰性對照組中4℃脅迫下POD活性高于空白對照組，-4℃脅迫下活性圍繞空白對照組上下波動(圖2)；APX在4和-4℃脅迫下的早期和中期(6～48 h)時活性被抑制，低于空白對照組，之后在72 h活性升高(圖4)。說明POD、CAT和APX作用中，CAT發(fā)揮主要作用，POD隨著低溫脅迫強(qiáng)度增加作用降低或者不穩(wěn)定，APX主要在脅迫晚期發(fā)揮作用。在陰性對照組中，0℃脅迫下POD活性低于空白對照組；APX活性隨著脅迫時間的持續(xù)呈現(xiàn)波動式變化；CAT和SOD活性高于空白對照組(圖1～4)。表明在0℃脅迫下CAT和SOD發(fā)揮主要抗氧化作用。添加ABA處理后，在4、0和-4℃脅迫下SOD、POD、CAT和APX活性均較陰性對照組出現(xiàn)不同程度升高(圖1～4)，表明ABA促進(jìn)了SOD、POD、CAT和APX活性，外源ABA提高了高山離子芥試管苗的抗氧化能力。這與李雪梅等[25]研究中得出ABA能夠不同程度的提高抗氧化酶CAT、POD和SOD活性的結(jié)論相似。同時也和黃杏等[26]研究中得出低溫脅迫下ABA能夠提高甘蔗幼苗中CAT、POD、SOD和APX活性的結(jié)論相同。羅立津等[27]研究也表明ABA對甜椒幼苗的抗寒性具有誘導(dǎo)作用。劉祖祺等認(rèn)為[28]ABA通過誘導(dǎo)抗寒特異性蛋白的合成提高柑橘的抗寒能力。Chen等[29]認(rèn)為ABA激活植物的抗寒鍛煉且可以代替低溫對植物的抗寒性進(jìn)行誘導(dǎo)，從而增加植物的抗寒能力。在本研究中ABA誘導(dǎo)SOD、POD、CAT和APX活性增加，說明ABA提高了高山離子芥試管苗的抗寒性。

4.2低溫脅迫下ABA對高山離子芥試管苗滲透調(diào)節(jié)物的影響

滲透調(diào)節(jié)作用是植物適應(yīng)環(huán)境，增強(qiáng)抗逆性的基礎(chǔ)。人們認(rèn)為植物對低溫脅迫主要的適應(yīng)機(jī)制可能是滲透調(diào)節(jié)[30]。脯氨酸參與滲透調(diào)節(jié)，保護(hù)生物大分子；可溶性糖作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)穩(wěn)定細(xì)胞膜和原生質(zhì)膠體；可溶性蛋白可維持較低的滲透勢[31～33]。在本研究中，陰性對照組中脯氨酸含量在4和-4℃脅迫下較空白對照組表現(xiàn)為降低(圖6)，表明4和-4℃引起高山離子芥試管苗水合能力降低可能出現(xiàn)了低溫脫水。陰性對照組中可溶性糖在4℃脅迫晚期(72 h)時較空白對照組相當(dāng)而在-4℃脅迫下低于空白對照組(圖7)，說明這兩個脅迫溫度引起了可溶性糖的分解，也可能降低了可溶性糖的生物合成速率。陰性對照組中可溶性蛋白在4℃脅迫下含量高于空白對照組，在-4℃脅迫的早期和中期(6和24 h)高于空白對照組之后含量下降，而相對電導(dǎo)率高于空白對照組(圖5和8)。表明可溶性蛋白發(fā)揮作用是建立在一定的溫度范圍上，而4和-4℃脅迫引起了細(xì)胞膜的損傷。在0℃脅迫下陰性對照組中脯氨酸和可溶性糖含量分別在72和48 h高于空白對照組；可溶性蛋白含量低于空白對照組；相對電導(dǎo)率增加并高于空白對照組(圖5～8)。表明在0℃脅迫下，高山離子芥試管苗的滲透調(diào)節(jié)作用中可溶性蛋白的作用被抑制而脯氨酸和可溶性糖在脅迫晚期發(fā)揮作用，并引起了細(xì)胞膜的損傷。植物細(xì)胞中電導(dǎo)率的變化，能反映細(xì)胞膜的傷害程度[34]，在本研究中，添加外源ABA后，4、-4和0℃脅迫下降低了細(xì)胞膜的電導(dǎo)率(圖5)，而說明ABA緩解了低溫引起的細(xì)胞膜損傷。同時在4、-4和0℃脅迫下外源ABA促進(jìn)了脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量增加(圖6～8)，表明植物激素ABA能夠提高高山離子芥試管苗的滲透調(diào)節(jié)作用，從而保證細(xì)胞代謝的正常進(jìn)行。低溫脅迫ABA可以啟動植物固有抗凍性基因的表達(dá)，在維持植物滲透調(diào)節(jié)過程中ABA發(fā)揮作用的途徑有多種。例如促進(jìn)氣孔關(guān)閉、增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量等[35～36]。本研究結(jié)果表明外源ABA通過調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量參與了植物抗低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

綜上所述，低溫冷害(4℃)、低溫凍害(-4℃)和臨界溫度(0℃)脅迫下ABA通過促進(jìn)抗氧化酶活性提高高山離子芥試管苗的抗氧化能力同時緩解細(xì)胞膜的損傷程度并增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量提高滲透調(diào)節(jié)作用進(jìn)而提高了高山離子芥試管苗的抗寒性。但是0℃作為臨界溫度，來自物理和化學(xué)的影響因素較多并且在植物抗寒性的研究中有關(guān)0℃的報道極為少見。因此關(guān)于0℃脅迫下細(xì)胞響應(yīng)的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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Supported by National Natural Science Foundation of China(31360061,31660116)

introduction：HE Wen-Ping(1987—),male,Master,mainly engages in research of plant cell signal transduction.

date:2016-09-06

ExogenousABAAffectedonAntioxidantEnzymesandOsmoticAdjustmentinChorasporabungeanaUnderLowTemperatureStress

HE Wen-Ping WANG Xin-Xia ZHANG Xu-Qiang YANG Peng-Jun QIU Yi-Zhi YANG Ning*

(College of Life Sciences,Northwest Normal University,Lanzhou 730070)

Using plantlets ofChorasporabungeanaas material, researched the effect of exogenous ABA on antioxidant enzyme and osmotic regulation substances under chilling(4℃), freezing(-4℃) and critical temperature(0℃) were studied. The results showed the activities of SOD and CAT in negative control group were higher than blank control group under 4℃ and -4℃. In negative control group the POD activity was higher than blank control group under 4℃. The APX activity increased at the late period of 4℃ and -4℃ treatment in negative control group. Meanwhile the relative conductivity increased but proline and soluble sugar decreased in negative control group. At 0℃, in negative control group the POD activity decreased and the APX activity changed with fluctuation. The content of proline and soluble sugar was higher than blank control group at 72 h and 48h respectively and soluble protein was lower than blank control group under 0℃. Exogenous ABA treatment, increased the antioxidant enzymes activities with different extent under low temperature stress. For the osmotic regulation substances, exogenous ABA treatment decreased the relative conductivity and increased the content of proline, soluble sugar and soluble protein.

low temperature stress;Chorasporabungeana;abscisic acid;antioxidant enzymes;osmotic regulation substances

國家自然科學(xué)基金(31360061、31660116)

何文平(1987—)，男，碩士研究生，主要從事植物細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的研究。

* 通信作者：E-mail:xbsd-yn@163.com

2016-09-06

* Corresponding author：E-mail:xbsd-yn@163.com

Q949.748.3

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.06.010