朱孟炎 于博帆 陳華峰

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

外源硝態(tài)氮水平對長春花生理代謝的影響

朱孟炎 于博帆 陳華峰*

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

以長春花為實驗材料，采用珍珠巖為培養(yǎng)基質(zhì)，設(shè)置不同氮素濃度，對其各器官的初生和次生代謝進行了初步研究,結(jié)果如下：植株中3種主要生物堿含量均是隨著外源氮水平的降低而降低，外源硝態(tài)氮水平對長春花文朵靈和長春質(zhì)堿在不同葉位葉片中的積累特點影響較明顯，而對長春堿的積累影響較小。在高氮條件下，植物體內(nèi)合成和積累較高水平的游離氨基酸，可能為部分生物堿的合成提供了骨架，并能促進生物堿含量的提高。蔗糖含量在不同葉位葉片中也是隨著葉齡的增加而緩慢增加。同時，高氮水平下，葉片中蔗糖含量明顯高于正常供氮水平下的含量。本研究為提高長春花中具有重要藥用價值生物堿的含量提供參考依據(jù)。

長春花；硝態(tài)氮；物堿；次生代謝

氮元素(N)是植物生長和發(fā)育的必須營養(yǎng)元素，也是植物發(fā)育過程中重要的限制因素[1]，主要以硝態(tài)氮(nitrate)和氨態(tài)氮(ammonium)兩種形式被植物所吸收利用。這兩種形態(tài)的氮在植物的生長和代謝過程中發(fā)揮著重要作用，其中硝態(tài)氮是自然界大多數(shù)植物吸收氮的主要形式[2]。硝酸鹽既是營養(yǎng)成分，也是氮代謝的主要調(diào)控因子，指導(dǎo)植物的碳流向，合成有利于碳同化生成氨基酸的化合物，它對植物生長和新陳代謝有著重要的影響[3]。研究表明，為植物提供較高水平的硝態(tài)氮，會對植物地上部生長起到積極的促進作用，同時也推遲了植物衰老進程[4]。氮素通常是作物生產(chǎn)中的主要限制因子[5]。雖然工業(yè)化的氮肥生產(chǎn)解決了土壤—植物之間的氮素供需矛盾,但由于人們片面追求高產(chǎn),盲目大量施用氮肥,一定程度上使作物產(chǎn)量有所提高,但也造成了人力資源浪費,同時帶來諸多弊端如經(jīng)濟效益下降,利用率下降,環(huán)境污染,生態(tài)環(huán)境條件惡化[6]。植物次生代謝產(chǎn)物的環(huán)境調(diào)控近年來頗受人們關(guān)注,也有研究報告光對植物次生代謝過程的影響,如對銀杏中的黃酮苷、高山紅景天中的紅景天苷、喜樹中的喜樹堿等次生代謝產(chǎn)物的影響等，但將氮素與可溶性糖聯(lián)系起來對長春花堿的研究不多[7～9]。為了在人工栽培長春花過程中提高氮素利用率,并保證目的生物堿含量穩(wěn)定提高，本研究圍繞外源氮水平對長春花利用氮素的生理生化特性及氮素對植物生理生化代謝進程的影響，研究氮素水平對長春花生理生態(tài)學(xué)，特別是次生代謝產(chǎn)物積累的影響，同時分析了氮素水平對不同葉位文朵靈、長春質(zhì)堿和長春堿含量積累的影響，以及氮素水平對不同葉位中可溶性及游離氨基酸積累的影響。

1 材料與方法

試驗于2014年3月上旬～7月下旬在東北林業(yè)大學(xué)森林生態(tài)教育部重點實驗室內(nèi)進行。試驗植株為播種于本試驗室溫室中的長春花。長春花種子萌發(fā)后形成的幼苗置于人工氣候箱(CONV IRON,Canada)中進行對照培養(yǎng)[10]。根據(jù)長春花幼苗光合作用的特點，氣候箱設(shè)置為(500±10) μmol·m-2·s-1，光照時間6:00～18:00，培養(yǎng)條件為溫度28℃，濕度60%左右。澆灌Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)。待長春花幼苗出現(xiàn)4對葉片時開始進行光強脅迫試驗，從培養(yǎng)箱選取長勢相近的幼苗轉(zhuǎn)入人工培養(yǎng)架上，分為3個營養(yǎng)梯度，低氮水平(6 mmol·L-1nitrate)中氮水平(12 mmol·L-1nitrate)和高氮水平(24 mmol·L-1nitrate)，培養(yǎng)3周后取樣,進行形態(tài)學(xué)和生理學(xué)參數(shù)測定，重復(fù)次數(shù)分別為3次。在此試驗的基礎(chǔ)上，對比正常氮水平(12 mmol·L-1nitrate)和高氮水平(24 mmol·L-1nitrate)培養(yǎng)6周情況下，長春花不同葉位初生和次生代謝產(chǎn)物的影響，以揭示植物在不同氮水平條件下如何分配體內(nèi)能量和物質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源硝態(tài)氮水平對長春花生物堿含量的影響

對比外源氮水平對長春花葉片和葉柄中文朵靈、長春質(zhì)堿和長春堿含量的影響特點(圖1)。圖1可以看出，不管是葉片中還是葉柄中三種主要生物堿含量均是隨著外源氮水平的降低而降低[11]。在低氮水平下，植物葉片中三種主要生物堿含量，包括文朵靈、長春質(zhì)堿和長春堿，均顯著低于正常和高氮水平。但高氮水平條件下，植物葉片中生物堿含量與正常氮水平下無顯著差別，但葉柄中長春堿含量在高氮水平下顯著高于正常和低氮水平下的含量。

由圖2可知，根部檢測出長春質(zhì)堿含量達到3 mg·g-1DW，顯著高于葉片中長春質(zhì)堿含量。同時低氮水平下，其含量顯著低于其它兩種氮水平下。

2.2外源硝態(tài)氮水平對長春花不同葉位生物堿含量的影響

由圖3可知，在正常氮水平條件下，長春花葉片中文朵靈和長春質(zhì)堿含量雖然總體上隨著葉片由幼嫩向成熟變化而呈降低的趨勢，但差異不大；長春堿的含量在不同葉位中分布趨勢性不明顯。

高氮水平條件下，長春花葉片中文朵靈和長春質(zhì)堿含量在不同葉位中均明顯高于正常供氮條件，同時也隨著葉齡的增加而線性降低；長春堿含量在第四對葉片中最高，表明長春堿優(yōu)先積累在成熟葉片中，幼嫩葉片中含量次之。

總體上看，外源硝態(tài)氮水平對長春花文朵靈和長春質(zhì)堿在不同葉位葉片中的積累特點影響較明顯，而對長春堿的積累影響較小[12]。

2.3外源硝態(tài)氮水平對長春花不同葉位游離氨基酸含量的影響

植物生物堿的合成和積累與游離氨基酸密切相關(guān)。供氮水平的改變能影響植物葉片中氨基酸的積累，因此對不同葉位中游離氨基酸含量進行檢測，以觀察不同氮水平對氨基酸含量的影響特點。

脯氨酸是研究較多的植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，一般與滲透脅迫等逆境響應(yīng)密切相關(guān)。結(jié)果顯示，脯氨酸隨著葉片年齡的增加而呈趨勢性下降的特點，特別是第四對葉片中脯氨酸含量在正常和高氮水平條件下均顯著低于其它葉位葉片的含量。另外，高氮水平條件下，較幼嫩葉片(第一和第二對)中脯氨酸含量顯著高于正常氮水平條件下的對照葉片。

圖1 外源氮水平對長春花葉片和葉柄中文朵靈、長春質(zhì)堿和長春堿含量的影響 A.文朵靈；B.長春質(zhì)堿；C.長春堿Fig.1 Effects of exogenous nitrate levels on vindoline,catharanthine and vinblastine contents in Catharanthus leaf and leafstalk A.Vindoline; B.Catharanthine; C.Vinblastine

圖2 外源氮水平對長春花根中長春質(zhì)堿含量的影響Fig.2 Effects of exogenous nitrate levels on Catharanthus catharanthine contents in roots

谷氨酸是植物中重要的轉(zhuǎn)運和儲存氮元素的氨基酸之一，也是脯氨酸等化合物合成的前體。由圖4可知，在正?；蚋叩较?，谷氨酸與脯氨酸在不同葉位中的分布情況相反，它隨著葉齡增加而增加，在成熟葉片中含量最高，是前三對葉片中含量的2倍左右[13]。

不同葉位葉片中總游離氨基酸含量與游離氨的含量變化趨勢相似，均隨著葉齡增加而呈明顯下降趨勢，該趨勢在高氮水平條件下更加顯著。同時，高氮條件下，不同葉位葉片中的總游離氨基酸含量與游離氨均顯著高于正常供氮條件?？梢钥闯?，游離氨的含量對總游離氨基酸含量的提高具有一定的促進作用。

相關(guān)性分析表明，總游離氨基酸含量與游離氨在不同葉位中的分布情況與文朵靈及長春質(zhì)堿含量變化特點相關(guān)性顯著(P<0.05)。由于生物堿是含氮化合物，在高氮條件下，植物體內(nèi)合成和積累較高水平的游離氨基酸，可能為部分生物堿的合成提供了骨架，能促進生物堿含量的提高。

圖3 不同供氮水平對長春花不同葉位葉片中3種生物堿含量的影響 A.文朵靈；B.長春質(zhì)堿；C.長春堿Fig.3 Effects of exogenous nitrate levels on the contents of three kinds of alkaloids in C.roseus leaves A.Vindoline; B.Catharanthine; C.Vinblastine

圖4 不同供氮水平對長春花不同葉位葉片中游離氨基酸含量的影響 A.脯氨酸；B.谷氨酸；C.游離氨基酸；D.游離氨Fig.4 Effects of exogenous nitrate levels on the contents of free amino acids in C.roseus leaves A.Proline; B.Glutarmate; C.Free amino acide; D.Ammonium

2.4外源硝態(tài)氮水平對長春花不同葉位可溶性糖含量的影響

由圖5可知，長春花葡萄糖含量在不同葉位中差異不顯著，但高氮水平下，不同葉位葉片中葡萄糖的含量均顯著高于正常供氮水平。

正常供氮水平條件下，長春花葉片中果糖含量隨著葉齡增加而線性提高，但在高氮水平下，不同葉位葉片中果糖含量變化不顯著，并明顯低于正常供氮水平下不同葉片中的含量。果糖含量在葉片中能反映植物衰老的情況，正常供氮情況下，由于氮源有限，因此植物將固定的能量和物質(zhì)優(yōu)先分配于幼嫩葉片中，果糖較低。而在高氮水平下，由于植物氮資源較豐富，延緩了葉片的衰老進程，因此葉片中果糖含量變化不顯著。

蔗糖含量在不同葉位葉片中也是隨著葉齡的增加，而緩慢增加，第4對葉片中的蔗糖含量達到最高值。同時，高氮水平下，葉片中蔗糖含量明顯高于正常供氮水平下的含量。原因可能是，較豐富的氮資源促進了植物光合作用，提高了植物碳固定量，蔗糖作為碳水化合物轉(zhuǎn)運的重要分子，因此在高氮水平下其含量呈現(xiàn)上升趨勢。

圖5 不同供氮水平對長春花不同葉位葉片中可溶性含量的影響 A.葡萄糖；B.果糖；C.蔗糖Fig.5 Effects of exogenous nitrate levels on the contents of free amino acids in different leaf position leaves of C.roseus A.Glucose; B.Fructose; C.Sucrose

2.5外源硝態(tài)氮水平下長春花不同葉位初生和次生代謝物質(zhì)含量之間相關(guān)性分析

為了揭示長春花主要三種生物堿積累受不同氮水平和發(fā)育階段的調(diào)控特點，我們對所有數(shù)據(jù)進行了相關(guān)性分析(n=40)。由表1可知，文朵靈與長春質(zhì)堿含量顯著相關(guān)，同時這兩種生物堿與總游離氨基酸、脯氨酸及游離氨之間呈現(xiàn)極顯著相關(guān)性(P<0.01)。但長春堿積累與其它代謝物質(zhì)積累之間相關(guān)性不顯著。

表1長春花不同葉位葉片中三種生物堿含量與其它代謝物質(zhì)含量的相關(guān)性分析

Table1CorrelationanalysisbetweenthreekindsofalkaloidswiththeothermetabolitesindifferentlypositionalleavesofC.roseus

注：*表示顯著水平小于0.05;**表示顯著水平小于0.01。

Note：*Correlation is significant at the 0.05 level;**Correlation is significant at the 0.01 level.

3 討論

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《植物研究》編輯部

National Natural Science Foundation of Youth Science Foundation(31400337)

introduction：ZHU Meng-Yan(1991—),female,senior engineer,mainly engaged in plantphysiology research work.

date:2016-01-15

EffectsofNitrateNitrogenLevelsonPhysiologicalMetabolismofCatharanthusroseus

ZHU Meng-Yan YU Bo-Fan CHEN Hua-Feng*

(Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

WithCatharanthusroseus, we used perlite as culture substrate to study the biomass and secondary metabolism. Three main alkaloids in plants were decreased with reduced levels of nitrogen. The level of exogenous nitrate on vindoline and Catharanthine inC.roseuswas with more significant accumulation in the leaves at different leaf positions, but with little effect on the accumulation of vinblastine. In high nitrogen condition, the plant synthesis and accumulation were at higher levels of free amino acids, which may provide the skeleton and promote the improvement of alkaloids in the partial synthesis. The content of sucrose in different position leaves was increased slowly with the increase of age. The content of sucrose in leaf at higher nitrogen level was significantly higher than that at normal nitrogen level. This research provide the reference basis that the important medicinal value for improving the content of alkaloid.

Catharanthusroseus;nitrate nitrogen;alkaloid;secondary metabolism

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目(31400337)

朱孟炎(1991—)，女，碩士研究生，主要從事植物生理生態(tài)學(xué)研究工作。

* 通信作者：E-mail:biginsect2002@163.com

2016-01-15

* Corresponding author：E-mail:biginsect2002@163.com

S143.1

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.04.008