羅本華　羅梅桂　王 燕　薛麗飛　覃斌寧

臍內(nèi)環(huán)針與安定片對PCPA失眠大鼠神經(jīng)行為學影響的對照研究

羅本華1羅梅桂2王 燕2薛麗飛3覃斌寧3

（1.廣西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530001；3.廣西中醫(yī)藥大學壯醫(yī)藥學院，廣西 南寧 530001）

目的：探討臍內(nèi)環(huán)穴針刺對PCPA失眠大鼠認知功能的影響。方法：50只經(jīng)過篩選的大鼠，隨機分為PCPA失眠大鼠模型組、臍內(nèi)環(huán)穴針刺組、安定對照組、針刺非穴組和正常組，每組10只。臍內(nèi)環(huán)穴針刺組采用針刺臍內(nèi)環(huán)穴的五臟點；針刺非穴組取雙側(cè)脅下兩個固定非經(jīng)非穴點；安定對照組采用安定灌胃處理；模型組和正常組均不給予任何特殊處理。應(yīng)用Morris水迷宮評價各組大鼠空間參考記憶能力的變化。結(jié)果：（1）PCPA大鼠存在空間記憶的學習能力、保留能力和再學習能力方面的認知損害；（2）在隱蔽平臺和反向試驗中，臍內(nèi)環(huán)穴針刺組顯示改善空間記憶的學習能力、再學習的作用，療效與安定藥物作用相當，且顯示穴位特異性，在改善學習能力出現(xiàn)較早；（3）探索試驗中，二種療法在改善大鼠空間記憶保留能力上，沒有顯示統(tǒng)計學意義；（4）可視平臺中，各組在平均潛伏期、平均速度上均無差異。結(jié)論：PCPA失眠大鼠存在全面的認知功能障礙，安定藥物和臍內(nèi)環(huán)穴針刺方法均能較全面改善PCPA失眠癥認知功能障礙，二者作用相當。

PCPA失眠大鼠；認知功能；臍內(nèi)環(huán)穴；安定

失眠是以入睡及睡眠維持困難為特征的一種最常見的睡眠障礙，是睡眠質(zhì)量或數(shù)量達不到正常需求的一種主觀體驗；明顯影響患者白天活動。隨近年社會變革加速，生活工作節(jié)奏加快，失眠癥發(fā)生更加頻繁。睡眠作為人生命的重要組成部分，對人體保持充沛的精力體力，維持神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等系統(tǒng)功能正常均有重要意義，因而，失眠是嚴重影響人們生活質(zhì)量或危害生命的疾病。失眠癥西醫(yī)治療大多在于改善癥狀，改善病因效果差，且副作用大；臨床上呈現(xiàn)回歸尋求中醫(yī)、針灸和民族醫(yī)學等安全可靠療法的熱潮；臍內(nèi)環(huán)穴針刺就是這樣一種新創(chuàng)的壯醫(yī)民族針法，有頗深的壯醫(yī)理論根基，是失眠癥臨床頗有效驗和療效的方法。本實驗研究了其對PCPA失眠大鼠神經(jīng)行為學的影響，并同安定藥物干預(yù)對照，旨在為失眠癥臨床提供基礎(chǔ)依據(jù)，實驗取得較滿意療效，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1研究對象

健康成年Wistar雄性大鼠60只，體重250±15g，由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供；室溫20～25℃飼養(yǎng)，室內(nèi)采光按照白晝循環(huán)模式，定時喂食，自由飲水，預(yù)養(yǎng)15天。

1.2動物分組

所有實驗動物隨機分為5組，毎組10只。將60只大鼠隨機抽取10只分為正常組，其余50只大鼠在注射PCPA造模后，通過觀察晝夜節(jié)律等變化，篩選得模型大鼠40例，再按隨機數(shù)字表法分，隨機分為模型組、臍內(nèi)環(huán)穴針刺組、安定對照組、非穴組4組，每組10只。

1.3動物造模方法

PCPA失眠大鼠模型：對氯苯丙氨酸（PCPA，公司：Alfa，批號：A13323），臨用前按大鼠45mg/lml/100g用量，用弱堿性生理鹽水（PH7-8）配置成混懸液備用。

于每日上午 8：00～8：15，每只大鼠腹腔注射 PCPA 混懸液lml/100g，每日一次，連續(xù)注射2日，在第二次腹腔注射PCPA28～30h后，動物出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，白天也活動不停，整體觀察與正常組有明顯不同，表明模型復制成功。

正常組：腹腔注射同體積的弱堿性生理鹽水，連續(xù)注射2日。

1.4處理方法

于PCPA失眠造模成功并篩選分組后，次日開始實驗干預(yù)治療。

（1）正常組10只：不予任何治療，只給予同臍內(nèi)環(huán)穴針刺組相同時間（3分鐘）及相同強度的抓摸刺激。

（2）模型組10只：不予任何治療，只給予同臍內(nèi)環(huán)穴針刺組相同時間（3分鐘）及相同強度的抓摸刺激。

（3）臍內(nèi)環(huán)針組10只：給予壯醫(yī)針刺臍環(huán)內(nèi)穴針刺治療。刺入臍內(nèi)環(huán)穴點后不行手法，每穴點留針30秒后出針，每次共3分鐘。

取穴：參壯醫(yī)臍內(nèi)環(huán)穴［1］，取大鼠神闕穴［2］：在大鼠臍中央。在臍環(huán)周旁開 2.5mm處一圈（據(jù)上書神闕至中脘約20mm拆算），以正上方為心，正下方為腎，右為肝，左為脾胃，左上、右上均為肺，共6個穴點。

針刺方法：以25×13mm粗細的毫針，由內(nèi)向外以 15～ 30°刺入2～4mm，針后不行捻轉(zhuǎn)提插手法，每處留針30秒鐘。每次心肝脾肺腎穴點均取，每日針刺1次，共針刺6次。

（4）安定組10只：于實驗干預(yù)第1天開始，用安定注射液腹腔注射治療。給藥方法：將安定（地西洋）注射液（10mg/2ml，上海旭東海普藥業(yè)有限公司），按成人催眠劑量10mg/天，用人和鼠給藥劑量體表面積折算公式計算出應(yīng)給予大鼠藥劑量為0.92mg/kg，使用前進行生理鹽水稀釋，每次灌注1ml，每天1次，連續(xù)6天。

（5）非穴組［3］10只：給予針刺兩肋下的非穴刺激，每穴行 90 秒后出針。

1.5實驗方案

（1）神經(jīng)行為學測試。Morris水迷宮參照文獻制作［4-5］。實驗時，一攝像頭置于水迷宮水池中央的上方約2m處，自動采集動物游泳圖像，所收集信號直接輸入計算機，由圖像自動采集和分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司，TM-vision行為學實驗系統(tǒng)）自動分析和處理，包括動物的逃避潛伏期、游泳路徑、穿越原平臺的次數(shù)、游泳路線的長度等參數(shù)。水迷宮實驗方法與操作參考文獻進行［5］。

（2）實驗程序［5，6］。試驗前1天，讓動物在不含平臺的水池中自由游泳90s（每次），上午及下午從2個入水點各訓練各1次，使其熟悉迷宮環(huán)境。實驗程序包括第1至第5天的隱蔽平臺試驗，第6天為探索試驗，第7至第9天的反向試驗及第10天的可視平臺試驗。探索試驗當天只測量1次，記錄時間為60秒s，余9天每天均測量2次，每次記錄時間為90秒s，每次間隔2小時以上，取2次的算術(shù)平均值作為當日的學習成績。

1.6數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

2　實驗結(jié)果

2.1各組大鼠在水迷宮的平均潛伏期和穿越原平臺的次數(shù)的實驗數(shù)據(jù)

表1　各組大鼠在水迷宮的實驗數(shù)據(jù)

2.2 神經(jīng)行為學統(tǒng)計結(jié)果

2.2.1隱蔽平臺試驗

在連續(xù)5天（表1第1天至第5天數(shù)據(jù)）的隱蔽平臺試驗中，雙因素方差分析檢驗結(jié)果為F（4，48）=36.34，P≤0.01，所有PCPA大鼠和正常組大鼠的逃避潛伏期均隨訓練天數(shù)的增加而明顯縮短，學習成績穩(wěn)步提高，反映臍內(nèi)環(huán)穴針刺治療和水迷宮的訓練有顯著性的改善學習和記憶作用；交互作用檢驗為F（16，192）=0.557，P≥0.05，說明訓練天數(shù)與組間因素沒有交互作用。每訓練日組間比較發(fā)現(xiàn)：（1）PCPA模型組的平均潛伏期下降緩慢而正常對照組下降明顯，于第3天二者就出現(xiàn)顯著性的差異；（2）臍內(nèi)環(huán)穴于第3天出現(xiàn)與PCPA模型組的顯著性差異，早于安定對照組，此后差異保持穩(wěn)定，于第4天出現(xiàn)了穴位特異性差異；（3）安定對照組從第4天到第5天，其逃避潛伏期均較PCPA模型組出現(xiàn)顯著性差異；第5天也顯現(xiàn)穴位特異性差異；但與臍內(nèi)環(huán)穴組差異無統(tǒng)計學意義；（4）平均潛伏期時間呈現(xiàn)“正常組＜臍內(nèi)環(huán)穴針刺組＜安定組針刺背俞穴組”的趨勢。

2.2.2反向試驗

反向試驗見表1第7天至第9天數(shù)據(jù)。在連續(xù)3天的反向試驗中，雙因素方差分析檢驗結(jié)果為F（4，48）=10.147，P≤0.01，所有PCPA大鼠和正常大鼠的逃避潛伏期均隨訓練天數(shù)的增加，呈逐漸下降趨勢，再學習成績穩(wěn)步提高，反映臍內(nèi)環(huán)穴針刺治療和水迷宮的訓練有顯著性的改善再學習作用；交互作用檢驗為F（8，144）=0.315，P≥0.05，說明訓練天數(shù)與組間因素之間沒有交互作用。每訓練日組間因素比較發(fā)現(xiàn)：（1）模型組和非穴組的逃避潛伏期時間下降緩慢，而正常組下降較顯著；（2）于第9天，正常組與模型組比較，平均潛伏期時間比更短，組間有統(tǒng)計學意義（P≤0.05），而和非穴組沒有顯著性差異；（3）在同一天的訓練成績中，余各組間差異均未有統(tǒng)計學意義。

2.2.3空間探索試驗

實驗動物穿越原平臺次數(shù)見表1第6天數(shù)據(jù)。單因素方差統(tǒng)計顯組間差異沒有統(tǒng)計學意義（F（4，48）=1.861，P≥0.05）；模型組比正常對照組穿越原平臺次數(shù)（P≤0.01）更少，且差異有統(tǒng)計學意義；而臍內(nèi)環(huán)穴針刺、安定對照組等組間雖然數(shù)據(jù)有差異，以臍內(nèi)環(huán)組次數(shù)稍多，但各組差異沒有統(tǒng)計學意義。

2.2.4可視平臺試驗

在空間訓練的第10天最后進行，見表1第10天數(shù)據(jù)。在平均逃避潛伏期方面，單因素方差分析結(jié)果為F（4，49）=0.346，P≥0.05，組間平均逃避潛伏期時間總體差異無統(tǒng)計學意義；但兩兩比較也未發(fā)現(xiàn)（表2）顯著性差異。對運動速度的單因素分析顯示，五組總體比較F（4，49）=0.713，P≥0.05，組間沒有統(tǒng)計學意義；兩兩比較發(fā)現(xiàn)也發(fā)現(xiàn)有顯著性差異。

表2　可視平臺各組大鼠在水迷宮中平均速度

3　討論

失眠癥多因某些長期的精神因素引起腦功能活動過度緊張，導致精神活動能力的減弱，既易于興奮又易于疲勞，又常與焦慮抑郁互為因果。失眠動物模型常有宏觀神經(jīng)行為學異常，宏觀神經(jīng)行為學異常應(yīng)是失眠動物模型的成功標志。王海棠［7］等證明原發(fā)性失眠和繼發(fā)性失眠患者的空間工作記憶功能均有損害，抑郁因素（SDS）和失眠因素（PSQI）均對其有貢獻，但抑郁的影響更大；繼發(fā)性失眠患者再認記憶有負荷依賴性受損，二者均有感知記憶受損。多種有效治療失眠的針灸療法證明有改善失眠大鼠模型的這種神經(jīng)行為學的異常。如胡曉輝［8］等證實PCPA失眠大鼠模型在不同行為學檢測方法中行為學變化趨勢基本一致，而失眠模型大鼠中縫背核（DRN）galanin神經(jīng)元變化與PCPA失眠病理發(fā)生、神經(jīng)行為學變化相關(guān)的。韓岳珊［9］電項針項部風池、供血（頸4夾脊）等穴對學習記憶障礙的失眠模型大鼠有恢復學習記憶能力。然而目前多種針灸療法的實驗研究缺少或忽視其失眠模型的宏觀行為學基礎(chǔ)研究，且缺少多種神經(jīng)行為學檢測方法的相互參考資料，如然，動物實驗微觀指標檢測將很難讓人信服地對應(yīng)著解釋人類失眠的機制。

臍內(nèi)環(huán)針是黃瑾明新創(chuàng)的針法，是壯醫(yī)針刺主要調(diào)氣方法和基礎(chǔ)針法，常采用臍內(nèi)環(huán)針結(jié)合其他穴位或針灸經(jīng)穴運用，廣泛用于臨床諸多病癥，而臍內(nèi)環(huán)穴的穴點選擇?？砂次迮K點同取法應(yīng)用。多年來，壯醫(yī)門診及針灸門診單獨運用臍內(nèi)環(huán)［10，11］治療失眠癥，取得肯定療效，臨床科研方面已取得有效證明［12］，而基礎(chǔ)研究的尚處于起步階段，本實驗試著從PCPA失眠模型大鼠的宏觀神經(jīng)行為學方面研究其失眠大鼠的模擬宏觀基礎(chǔ)。Morris水迷宮隱蔽平臺實驗主要反映模型動物的學習能力；結(jié)果提示：PCPA大鼠存在空間記憶的學習能力損害，表現(xiàn)出認知功能損害，而臍內(nèi)環(huán)穴針刺方法和安定口服法均能顯著地改善這種認知功能損害且顯示穴位特異性；但臍內(nèi)環(huán)穴針刺組起效稍早；可以認為臍內(nèi)環(huán)針刺改善PCPA失眠大鼠的空間學習能力同安定片大致相當，臍內(nèi)環(huán)還呈顯稍微的療效優(yōu)勢。反向平臺試驗反映動物再學習的能力；結(jié)果提示：PCPA失眠大鼠存在空間記憶再學習能力的損害，臍內(nèi)環(huán)穴針刺和安定藥物干預(yù)方法均能顯著的改善這種認識功能損害，但組間無顯著性差異和未顯示穴位特異性。探索試驗主要反映動物記憶保持能力；結(jié)果提示PCPA失眠大鼠在記憶保持能力方面也有損害，臍內(nèi)環(huán)穴針刺和安定給藥方法雖能增加穿越原平臺的頻次，但未達到統(tǒng)計學意義。可視平臺實驗平均逃避期時間和平均速度諸組間統(tǒng)計，均不存在顯著性差異，說明水迷宮實驗，諸組間動物存在基線處于同一水準，存在可比性。綜合實驗結(jié)果可得出，PCPA失眠大鼠存在空間記憶的學習能力、再學習能力和記憶保留等全面障礙，臍內(nèi)環(huán)穴針刺能改善PCPA失眠大鼠的學習、再學習能力，有較全面的改善認知功能作用，療效與安定藥物方法相當；提示臍內(nèi)環(huán)穴針刺可作為失眠癥臨床的一種有效治療方法。

推究臍內(nèi)環(huán)穴針刺治療失眠癥能取得療效的理由，與其淵源的壯醫(yī)中醫(yī)理論基礎(chǔ)有關(guān)的。臍是壯醫(yī)臟腑天地人三部

位的中心，能全息反映臟腑信息功能，通過針向迎隨，善調(diào)五臟氣機，暢通龍火二路，調(diào)氣谷水三道，有極好的調(diào)氣作用；運用于失眠癥治療，從腹陰部治療，較切合失眠陰陽失調(diào)的總病機，也有利于壯醫(yī)失眠癥天地人三氣同步異常的恢復，從而達到治療失眠之目的；而臍內(nèi)環(huán)穴位于臍周，臍通五臟神、善調(diào)五臟氣，契合針刺最基礎(chǔ)的調(diào)氣調(diào)神之功用，能整體調(diào)理臟腑陰陽氣血，平衡失眠癥的陰陽失調(diào)的總病機。

［1］ 黃瑾明，黃貴華，黃由之，等，壯醫(yī)臍環(huán)穴及其臨床應(yīng)用［J］.中國針灸，2013，33（6）：561-564.

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Control study of umbilical inner acupoints acupuncture and stable drug improving cognitive deficits in water maze of PCPA insomnia rats.

Objective： Study the effect of umbilical inner acupuncture on the cognitive functions of PCPA model rats. Methods： After screening， 50 rats were randomly divided into five groups： model group of PCPA insomnia， umbilical inner acupuncture group， diazepam control， non-acupuncture points and normal group each of which was 10. The umbilical inner acupuncture group were acupunctured at five Zang points of umbilical inner acupoints， the non-acupoint control group rats were stimulated on the non-acupoint， the diazepam control group were treated orally diazepam， and the model group and the normal group were not given any special treatment. Cognitive function was evaluated by the Morris water maze test. Results：（1）The data showed that PCPA insomnia rats displayed obvious impairments of learning， retention and relearning ability of spatial memory. （2） In the hidden platform and reverse experiment， the umbilical inner acupuncture group showed improvement in relearning ability of spatial memory， and its effect was quite that of diazepam drug with acupoint-related specificity. But its effect appeared earlier than that of diazepam drug group in improving learning ability. （3）In exploration test， two kinds of therapy showed no statistically significant in improving retention in spatial memory. （4） In visual platform， there was no difference in the two index on the average incubation period and the average speed. Conclusion： The results suggested that the PCPA insomnia rats exist overall cognitive dysfunction， and both the diazepam drug and umbilical inner acupuncture methods can improve the overall cognitive dysfunction of the PCPA insomnia rats with the same effects.

PCPA insomnia rats； Cognitive function； Umbilical inner acupoints； diazepam

R254

A

1008-1151（2016）02-0090-03

2016-01-11

廣西自然科學基金項目任務(wù)書（2013GXNSFAA019133，桂財教［2013］19號）；廣西中醫(yī)藥大學重大課題（ZD12005）。

羅本華（1968－），廣西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院主任醫(yī)師，博士，研究方向為針灸與壯醫(yī)防治神經(jīng)系統(tǒng)及老年性疾病基礎(chǔ)與臨床研究。