焦興蘋(píng) 昝珂 過(guò)立農(nóng)++鄭健 馬雙成

【摘要】目的：比較高效液相色譜法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，對(duì)照品稀釋法和不同進(jìn)樣量法的異同。方法：采用高效液相色譜法，以綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷對(duì)照品作為研究對(duì)象，采用對(duì)照品稀釋法和進(jìn)樣不同體積法，測(cè)定峰面積，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果：木犀草苷兩種方法結(jié)果線性關(guān)系良好，而綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷僅稀釋法線性關(guān)系良好。結(jié)論：建議采用稀釋法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同進(jìn)樣量法需慎重。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法；線性；對(duì)照品稀釋法；不同進(jìn)樣量法

【中圖分類號(hào)】R9141【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2016）18-0013-04

[JP2]在建立藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，分析方法需經(jīng)驗(yàn)證；在藥品生產(chǎn)工藝變更、制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時(shí)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法也需進(jìn)行驗(yàn)證。線性是藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證的必需項(xiàng)目之一[1]。在建立中藥含量測(cè)定方法時(shí)，高效液相色譜法是最常采用的方法。常用的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法有兩種，一是配置一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以峰面積對(duì)被測(cè)物質(zhì)濃度進(jìn)行線性擬合[2-8]；另外一種方法是同一對(duì)照品溶液，進(jìn)樣不同體積，以峰面積對(duì)被測(cè)物質(zhì)進(jìn)樣量（μg）進(jìn)行線性回歸計(jì)算[9-15]。本研究采用綠原酸（1）、連翹酯苷B（2）、毛蕊花糖苷（3）、木犀草苷（4）四個(gè)對(duì)照品（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）按上述兩種線性制作方法進(jìn)行試驗(yàn)，比較二者的異同。結(jié)果顯示，4個(gè)對(duì)照品溶液按照對(duì)照品稀釋法試驗(yàn)，線性關(guān)系均良好；采用不同進(jìn)樣量法試驗(yàn)，僅木犀草苷線性關(guān)系良好，綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷三個(gè)化合物隨進(jìn)樣量增大，峰面積響應(yīng)值偏低，線性關(guān)系呈類拋物線型。[JP]

1儀器與材料

11儀器安捷倫1260型高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器，二元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，脫氣機(jī)）；MSA125P型電子天平（賽多利斯）。

[JP2]12材料綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：[KG-*3/5]110753-201314）、連翹酯苷B（批號(hào)：[KG-*3/5]111811-201102）、木犀草苷（批號(hào)：[KG-*3/5]111720-201408）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；毛蕊花糖苷（批號(hào)：[KG-*3/5]M-011-150318北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司）。磷酸（批號(hào)20140305，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），甲醇和乙腈為色譜純（Fisher公司），水為Milli-Q超純水。[JP]

2方法和結(jié)果

21色譜條件色譜柱：Waters XSelect HSS T3（46mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-05%磷酸溶液 （18∶[KG-*3/5]82）；流速：10mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：332nm。

22對(duì)照品溶液的配制分別取綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷對(duì)照品約10mg，精密稱定，分別置于10mL棕色量瓶中，以乙腈溶解并定容至10mL，即得各對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取上述儲(chǔ)備液01、02、03、05、08mL分別置于25mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至25mL，用045μm濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得對(duì)照品溶液濃度分別約為4、8、12、20、32μg/mL。

23不同進(jìn)樣量法試驗(yàn)精密吸取22項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液（20μg/mL），分別進(jìn)樣1、 2、 5、 10 、15μL，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1，線性圖見(jiàn)圖2。

結(jié)果表明，不同進(jìn)樣量法測(cè)定的木犀草苷線性關(guān)系良好，而綠原酸、連翹酯苷B和毛蕊花糖苷三個(gè)成分隨進(jìn)樣量增大，響應(yīng)值沒(méi)有線性增加，呈類拋物線型。

23對(duì)照品稀釋法測(cè)定線性分別精密吸取上述22項(xiàng)下一系列濃度的對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按21項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以各對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為X軸，以峰面積積分值為Y軸，進(jìn)行線性回歸，各對(duì)照品回歸方程和線性范圍見(jiàn)表2，線性圖見(jiàn)圖3。

結(jié)果表明，采用對(duì)照品稀釋法，所測(cè)四個(gè)成分線性關(guān)系均良好。

3結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，以綠原酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷以及木犀草苷四個(gè)對(duì)照品為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)照品稀釋法和進(jìn)樣不同體積法對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證中的線性進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，采用對(duì)照品稀釋法，四個(gè)化合物的線性關(guān)系均良好，采用進(jìn)樣不同體積法僅木犀草苷的線性關(guān)系良好，而綠原酸、連翹酯苷B和毛蕊花糖苷三個(gè)成分隨進(jìn)樣量增大，峰面積響應(yīng)值沒(méi)有線性增加，呈類拋物線型。其原因可能是流動(dòng)相中加入了磷酸溶液，對(duì)照品溶液為甲醇配制，隨著進(jìn)樣量增大，注入的不同體積的對(duì)照品溶液對(duì)流動(dòng)相的pH值造成了波動(dòng)。

綠原酸、連翹酯苷B和毛蕊花糖苷結(jié)構(gòu)中均含有咖啡酸酯類，在含水量較高的流動(dòng)相中容易產(chǎn)生電離，使色譜峰拖尾變寬，加入磷酸等酸性抑制劑抑制了此類化合物的電離，改善色譜峰的峰形。流動(dòng)相不同pH值對(duì)化合物的峰形具有顯著影響，導(dǎo)致峰面積不完全成線性關(guān)系[16]。而進(jìn)樣相同體積不同濃度的對(duì)照品溶液對(duì)流動(dòng)相pH值的影響是一致的，峰面積和濃度呈線性關(guān)系。

由于本實(shí)驗(yàn)儀器是采用自動(dòng)進(jìn)樣，木犀草苷的線性均良好，表明進(jìn)樣器準(zhǔn)確性和性能良好。實(shí)驗(yàn)選用的進(jìn)樣量范圍1～15μL為常用進(jìn)樣量范圍，進(jìn)樣體積并不過(guò)大。由于不同進(jìn)樣量法較為簡(jiǎn)便，課題組先采用不同進(jìn)樣量法進(jìn)行線性試驗(yàn)，重復(fù)3次，結(jié)果均與本文報(bào)道一致，綠原酸、連翹酯苷B和毛蕊花糖苷3個(gè)化合物線性不佳，后改用稀釋法進(jìn)行試驗(yàn)，線性良好。

因此，進(jìn)行中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備一般應(yīng)采用稀釋法進(jìn)行，慎重使用不同進(jìn)樣體積法。

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（編輯：梁志慶）