楊國平，刁有祥，趙丹丹，陳　浩，提金鳳，張　璐，張　英，李川川

(山東農業(yè)大學 動物科技學院，山東 泰安 271017)

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抗鴨坦布蘇病毒NS5蛋白單克隆抗體的制備及鑒定

楊國平，刁有祥，趙丹丹，陳浩，提金鳳，張璐，張英，李川川

(山東農業(yè)大學 動物科技學院，山東 泰安 271017)

【目的】 制備抗鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)NS5蛋白的單克隆抗體?！痉椒ā?將實驗室保存的PET28a-NS5載體轉化入Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞中進行誘導表達，利用純化的鴨坦布蘇病毒NS5蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠，應用淋巴瘤細胞雜交技術結合有限稀釋法制備單抗，并對單抗的特異性、反應性及其抗原表位和亞類進行鑒定?！窘Y果】 篩選獲得2株穩(wěn)定分泌針對DTMUV 的NS5蛋白單抗的雜交瘤細胞，分別命名為A4D1和B4B8。此2株雜交瘤細胞誘導BALB/c小鼠的抗體效價均可達到1∶64 000。間接ELISA、Western blot和間接免疫熒光(IFA)檢測結果表明，所獲細胞分泌的抗體能與DTMUV及純化的NS5蛋白發(fā)生特異性反應。經鑒定2株單抗的亞類均為IgG1型，通過疊加ELISA方法，初步判定2株單抗識別不同的抗原表位?！窘Y論】 成功獲得了抗鴨坦布蘇病毒NS5蛋白的單克隆抗體,為研究NS5蛋白的功能奠定了基礎。

鴨坦布蘇病毒；NS5蛋白；單克隆抗體

2010年春夏之交，在我國江浙和山東等地區(qū)的鴨群中爆發(fā)了一種以產蛋率大幅下降、生長發(fā)育遲緩、卵巢出血為主要特征的急性傳染病，之后其迅速傳播到福建、江西、安徽、河南和河北等地區(qū)，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴重的經濟損失[1-4]。經病毒分離鑒定證明，該病是由黃病毒科、黃病毒屬、恩塔亞病毒群的坦布蘇病毒(Tembusu virus,TMUV)引起的[5-7]。坦布蘇病毒對蛋鴨及肉鴨均有致病力，感染鴨中以麻鴨最易感，其次是櫻桃谷種鴨，番鴨也可感染[8-9]。感染坦布蘇病毒后，肉鴨主要表現(xiàn)為精神沉郁、體溫升高、生長緩慢、癱瘓等，蛋鴨最明顯的癥狀為產蛋量急劇下降甚至停止；剖檢發(fā)現(xiàn)脾臟腫大明顯，肝臟出血嚴重時伴有針尖狀白色點狀壞死[10]，蛋鴨還見卵泡出血，嚴重時變性壞死。

鴨TMUV是一種不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，其基因組長約10.5 kb，編碼核衣殼蛋白(C)、外膜蛋白(PrM和M)和囊膜蛋白(E)等3個結構蛋白及NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5[11]等7個非結構蛋白。其中NS5蛋白是坦布蘇病毒編碼最大的蛋白質，是黃病毒依賴RNA的RNA聚合酶，具有甲基轉移酶和RNA依賴的RNA聚合酶活性，對病毒基因組的復制起關鍵作用[12-13]。

單克隆抗體是由單一B細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，具有高特異性、均一性等優(yōu)點，是研究病毒蛋白抗原表位及結構功能的重要基礎工具。因而制備病毒相關蛋白的單克隆抗體，有利于進一步研究病毒蛋白的組織結構和功能，為疾病預防提供實驗基礎。本研究對DTMUV NS5基因進行了原核表達，并以NS5蛋白為免疫抗原免疫BALB/c小鼠，應用淋巴細胞雜交技術，成功篩選獲得了2株穩(wěn)定分泌抗DTMUV-NS5的單克隆抗體(Monoclonal Antibodies,McAbs)，為研究坦布蘇病毒NS5蛋白結構功能提供了基礎工具。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒、細胞株、血清及載體鴨坦布蘇病毒、H9N2亞型禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鴨瘟病毒(DPV)、呼腸孤病毒(RV)、小鼠骨髓瘤細胞株(SP2/0)、293T細胞、小鼠抗DTMUV陽性血清和陰性血清、大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞及表達坦布蘇病毒NS5蛋白的原核表達載體PET28a-NS5，均由山東農業(yè)大學禽病學研究室保存。

1.1.2試驗動物5～6周齡的雌性BALB/c小鼠及10周齡經產的雌性BALB/c小鼠，購自山東省新藥評價中心。

1.1.3主要試劑BCA蛋白質定量試劑盒，購自北京康為世紀生物科技有限公司；蛋白預染Marker、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗鼠IgG抗體和胎牛血清(FBS)，購自北京全式金生物技術有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、細胞融合劑PEG(50 g/L)、HAT、HT試劑、小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒，均購自Sigma公司；DMEM完全培養(yǎng)基，購自Gibcol公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG抗體，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；PVDF膜，購自Bio-RAD公司；正辛酸，購自Aladdin公司；超敏性辣根過氧化物酶DAB顯色試劑盒，購自上海生工生物工程股份有限公司；2×YT培養(yǎng)基自制保存。

1.2DTMUV NS5蛋白抗原的制備

將PET28a-NS5原核表達載體轉化入大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞，經PCR和基因測序鑒定后于2×YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3 h，待菌液OD600達到0.4～0.6時，加入IPTG使其終濃度為1 mmol/L，于37 ℃誘導培養(yǎng)6 h，超聲(超聲3 s、間歇2 s，共循環(huán)200次)裂解菌體，對蛋白存在形式做SDS-PAGE鑒定后，確定目的蛋白為包涵體蛋白，并利用尿素梯度純化法對產生的包涵體蛋白進行純化，使用SDS-PAGE技術檢測蛋白的表達情況。純化后的蛋白利用BCA蛋白質定量試劑盒對產生的NS5蛋白進行定量。將定量后的DTMUV的NS5蛋白與弗氏完全佐劑按照1∶1的體積比乳化作為抗原備用。

1.3小鼠免疫及細胞融合

參照劉玉斌等[14]的方法，選擇5～6周齡健康的雌性BALB/c小鼠5只，用制備的抗原采取背部皮下多點注射法對小鼠首次免疫，免疫劑量為100 μg/只；第2、3次免疫時，將抗原與弗氏不完全佐劑按1∶1等體積乳化后，采用腹腔注射法接種小鼠，免疫劑量與首免劑量相同，相鄰2次免疫間隔時間為14 d。三免后采集小鼠血清，檢測抗體效價。選擇抗體效價達到1∶6 400以上且效價最高的小鼠進行加強免疫，免疫劑量為不加佐劑的DTMUV NS5蛋白 100 μg/只，免疫方式為腹腔注射。3 d后取其脾臟，分離脾細胞，采用常規(guī)的PEG融合法[15]將其與對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)進行細胞融合。利用HAT篩選培養(yǎng)基對融合細胞進行篩選培養(yǎng)。

1.4單抗篩選間接ELISA方法的建立

采用方陣滴定法確定單抗篩選間接ELISA方法的抗原最佳包被量和抗體最佳工作濃度。將純化的DTMUV的NS5抗原按照400 ng/孔加入細胞培養(yǎng)板，橫排對其進行2倍倍比稀釋，直到NS5抗原量為12.5 ng/孔，鼠抗DTMUV的陽性血清和陰性血清分別按照1∶10的體積比加入細胞培養(yǎng)板；豎排分別進行10倍倍比稀釋操作，直到稀釋度達 1∶10 000，同時設立SP2/0細胞培養(yǎng)上清(防止試驗過程中的假陽性，排除試驗干擾)及空白對照孔(加生理鹽水)。用空白對照孔試液調零，紫外分光光度計測定陽性血清和陰性血清孔的OD450，分別記作P和N。選擇陽性血清OD450的值接近于1.0，P/N≥2.1孔中P/N最大的孔的抗原包被和抗體稀釋度為最佳的抗原包被量及抗體最佳稀釋濃度。

1.5融合細胞的亞克隆化

待融合細胞長滿96孔培養(yǎng)板孔底部面積的 1/2～3/4時，采用上述建立的間接ELISA方法檢測細胞液上清抗體效價，反復檢測2次后，挑選穩(wěn)定分泌抗體的細胞，采用有限稀釋法進行細胞亞克隆篩選，用上述方法反復篩選2～3次，直至篩選的細胞上清均為陽性，即可得到純化的單克隆抗體細胞。

1.6DTMUV NS5單抗腹水的制備及效價測定

參照文獻[16]，選擇10周齡經產的雌性BALB/c小鼠6只，每只腹腔注射滅菌的液體石蠟0.5 mL，7 d后腹腔注射篩選的雜交瘤細胞5×105個/只，注射7～10 d后小鼠的腹部明顯膨大，此時抽取腹水，12 000 r/min離心10 min，除去大分子雜質，收集離心后的上清，采用建立的間接ELISA方法檢測抗體效價。利用正辛酸-飽和硫酸銨法對腹水進行純化，采用SDS-PAGE檢測純化效果，對純化腹水進行1∶500倍比稀釋后，用建立的間接ELISA方法對其抗體效價進行測定。并利用紫外分光光度計檢測蛋白在260和280 nm的吸光值A260和A280，按照蛋白質濃度=1.45×A280-0.74×A260計算抗體濃度。純化后的腹水于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7DTMUV NS5單抗特異性和反應性的鑒定

1.7.1特異性分別用H9N2亞型AIV、NDV、DPV、RV及DTMUV作為抗原包被酶標板，以雜交瘤細胞上清為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG抗體為二抗，用間接ELISA方法對單克隆抗體細胞上清進行檢測。

1.7.2反應性采用Western blot法驗證單抗對DTMUV的反應原性以及與體外大腸桿菌原核表達純化的NS5蛋白的反應原性。將DTMUV病毒以及NS5蛋白進行SDS-PAGE電泳，設置電泳條件為：180 V，90 min。采用Bio-Rad半干法轉膜，設置條件為:20 V，40 min。將膜置于50 g/L脫脂奶粉中4 ℃放置12 h。加入1∶500稀釋的腹水作為一抗,37 ℃孵育1 h，并設置SP2/0細胞上清作為對照;而后加入1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG抗體，37 ℃孵育1 h，用PBST清洗5次后，再用PBS清洗反應膜以除去Tween-20。用超敏性辣根過氧化物酶DAB顯色試劑盒，37 ℃顯色5 min后，室溫晾干，觀察結果。

1.8DTMUV NS5單抗的間接免疫熒光(IFA)鑒定

選擇生長狀態(tài)良好的293T細胞，將其接種到6孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)。待細胞長成單層且細胞面積為培養(yǎng)孔底部面積的3/4時，感染DTMUV，同時設立不感染DTMUV的293T細胞為空白對照。待其出現(xiàn)細胞病變后，用40 g/L的多聚甲醛進行固定，用PBST清洗5次，加入過度培養(yǎng)的雜交瘤細胞上清，37 ℃孵育1 h；PBST清洗5次，加入1∶2 000稀釋的FITC標記的羊抗鼠IgG抗體，繼續(xù)37 ℃孵育1 h；PBST清洗5次，室溫晾干，置于熒光顯微鏡下觀察。若出現(xiàn)綠色熒光則為陽性；反之為陰性。

1.9單抗抗原表位分析和亞類鑒定

采用疊加ELISA方法的OD450的值及公式AI=(2×A1+2/(A1+A2)-1) ×100%(A1、A2為相應單抗的OD450值)，對單抗抗原表位進行初步分析，根據(jù)2株單抗兩兩配對，通過對單抗疊加OD450的計算，反映2株McAbs病毒抗原表位之間的關系。

單抗亞類采用Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents試劑盒鑒定，具體按照說明書要求進行操作。

2　結果與分析

2.1DTMUV NS5蛋白的表達與純化

核酸檢測結果顯示，將PET28a-NS5轉化入Rosetta(DE3)細胞中，表達出含有NS5蛋白的包涵體蛋白，利用尿素梯度純化法對NS5蛋白進行純化，SDS-PAGE分析結果(圖1)顯示，所獲得的目的條帶為50 ku，與預期結果一致。利用BCA蛋白質濃度定量試劑盒測得表達的NS5蛋白的質量濃度為5.23 mg/mL。

圖 1　DTMUV NS5蛋白的SDS-PAGE分析M.蛋白質分子質量標準；1.初純的包涵體；2.純化的NS5蛋白Fig.1　SDS-PAGE analysis of purified NS5 protein of DTMUVM.Protein marker;1.Inclusion body protein;2.Purified NS5 protein

2.2DTMUV NS5篩選間接ELISA方法的建立

采用方陣滴定法確定篩選檢測的間接ELISA方法中的NS5蛋白最佳包被量及陰陽性血清的抗體稀釋度，計算的P/N值見表1。

根據(jù)P/N值≥2.1且最大、陽性血清OD450值為1.0左右的判定標準，由表1可知，抗原最佳包被量為100 ng/孔，血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶10。

2.3雜交瘤細胞的建立

應用淋巴細胞雜交瘤技術構建融合細胞，利用建立的間接ELISA方法對融合細胞進行篩選、擴大培養(yǎng)和亞克隆化。融合后5～7 d可見融合細胞呈集落式生長，細胞融合率達85%；間接ELISA篩選結果顯示，細胞上清陽性率達到25%左右，對陽性細胞孔進行2～3次有限稀釋法亞克隆，獲得了2株穩(wěn)定分泌抗DTMUV NS5蛋白的雜交瘤細胞，分別命名為A4D1和B4B8。

表 1　最佳抗原包被量及抗體稀釋度的確定Table 1　Determination of the optimal concentration for coating antigen and the dilution of positive and negative control

注：表中數(shù)據(jù)為P/N值，其中P為陽性血清OD450值，N為陰性血清OD450值。

Note:The data in this table is P/N,P is positive serum of OD450,N is negative serum of OD450.

2.4雜交瘤細胞上清和腹水抗體效價的測定

由表2可知，2株單抗的細胞上清抗體效價可達到1∶100，腹水抗體效價可達到1∶64 000以上，說明抗體效價較高，純化效果較好。

表 2　雜交瘤細胞上清和純化腹水中抗 DTMUV NS5單抗的效價Table 2　Titers of culture supernatants and ascitic fluids of monoclonal antibodies against DTMUV NS5 by indirect ELISA

2.5DTMUV NS5單抗腹水的純化

取純化后的腹水進行SDS-PAGE，結果(圖2)顯示，純化后的單抗純度較高，重鏈、輕鏈明顯。采用紫外分光光度法測得的2株單抗的蛋白含量分別為1.510和0.376 mg/mL。

2.6DTMUV NS5單抗的特異性鑒定

間接ELISA結果表明，A4D1和B4B8的單抗只與DTMUV反應，不與AIV、NDV、DPV、RV等發(fā)生反應。

圖 2　DTMUV NS5單抗的SDS-PAGE分析M．蛋白質分子質量標準；1.未純化的B4B8單抗； 2.純化的B4B8單抗；3.未純化的A4D1單抗；4.純化的A4D1單抗Fig.2　SDS-PAGE analysis of monoclonal antibodies against DTMUV NS5M.Protein marker;1.Unpurified B4B8 McAb；2.Purified B4B8 McAb;3.Unpurified A4D1 McAb;4.Purified A4D1 McAb

2.7DTMUV NS5單抗的反應性鑒定

Western blot鑒定結果(圖3)顯示，2株單抗均可以與純化的DTMUV的NS5蛋白以及DTMUV在50 ku左右發(fā)生抗原抗體的特異性反應，而SP2/0細胞上清與兩者均不反應，表明2株單抗均有良好的反應原性。

圖 3　DTMUV NS5單抗的Western blot鑒定M.蛋白質分子質量標準；1,6.分別為SP2/0細胞上清與 NS5蛋白和DTMUV的反應結果；2，4.分別為單抗A4D1與 NS5蛋白和DTMUV的反應結果；3，5.分別為單抗 B4B8與NS5蛋白和DTMUV的反應結果Fig.3　Western blot identification of monoclonal antibodies against DTMUV NS5M.Protein marker;1 and 6.SP2/0 supernatants reacted with purified NS5 protein and DTMUV,respectively;2 and 4.A4D1 McAb reacted with purified NS5 protein and DTMUV,respectively; 3 and 5.B4B8 McAb reacted with purified NS5 protein and DTMUV,respectively

2.8DTMUV NS5單抗的IFA鑒定

圖4結果顯示，2株單抗均可顯現(xiàn)特異性的綠色熒光，未感染的細胞未顯現(xiàn)綠色熒光，表明這2株單抗均可以與DTMUV發(fā)生反應。

圖 4　DTMUV NS5單抗與感染DTMUV的 293T細胞的IFA結果 A.A4D1；B.B4B8；C.陰性對照Fig.4　Indirect immunofluorescence assay of DTMUV in 293T cells with the two monoclonal antibodies against DTMUV NS5 A.A4D1 McAb;B.B4B8 McAb;C.Negative control

2.9單抗的亞類鑒定和抗原表位初步分析

疊加ELISA試驗結果顯示，A4D1和B4B8這2株單抗的疊加值AI=53%>10%，可初步判定2株單抗識別不同的抗原表位。

小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒檢測結果顯示，單抗A4D1和B4B8亞類重鏈均為IgG1型，輕鏈為κ鏈。

3　討　論

NS5是坦布蘇病毒依賴RNA的RNA聚合酶，具有RNA依賴的RNA聚合酶的活性，是坦布蘇病毒屬中較為保守的蛋白，在病毒復制過程中發(fā)揮著極其重要的作用。因此，研究NS5蛋白的結構和功能，對于坦布蘇病毒感染的臨床鑒別診斷和了解坦布蘇病毒的致病機理具有重要意義。單克隆抗體以其特異性高、敏感性強而被廣泛用于各類疾病病原的血清學檢測和相關基礎研究[17]。本研究應用純化的坦布蘇病毒的NS5蛋白作為免疫原，經過動物免疫、細胞融合和亞克隆，篩選出了2株能夠穩(wěn)定針對坦布蘇病毒的NS5蛋白的單克隆抗體。該單抗的制備為進一步研究病毒的致病機理、蛋白功能以及抗原表位的鑒定奠定了相關的物質基礎。

制備單克隆抗體時，在細胞融合之前，為了避免骨髓瘤細胞在后期HAT選擇培養(yǎng)時出現(xiàn)突變返祖現(xiàn)象，在融合前10 d左右需用8-氮雜鳥嘌呤(8-AG)處理，以消除對氨基蝶呤不敏感的骨髓瘤細胞，利于融合。在單抗制備過程中，融合后第1次篩選陽性率較高，可能是細胞上清中某些物質的影響，因而會造成假陽性的結果，所以需要反復篩選2～3次，選擇OD450值均較高且穩(wěn)定的陽性值孔進行亞克隆。因融合細胞早期細胞數(shù)量較少，細胞極容易脫落死亡，篩選出的陽性值孔需擴大培養(yǎng)到24孔板培養(yǎng)，待細胞長到培養(yǎng)板孔底部面積的1/2～3/4時，再次進行檢測，檢測陽性值穩(wěn)定的進行亞克隆，這樣能增大亞克隆的成功率。得到了亞克隆后的雜交瘤細胞為了維持其抗體產生的穩(wěn)定性，需要定期進行再克隆，以防止雜交瘤細胞突變或染色體丟失，以致喪失產生抗體的能力[18]。

[1]刁有祥.坦布蘇病毒感染研究進展 [C]//中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十六次學術研討會論文集.北京：中國畜牧獸醫(yī)學會,2012．

Diao Y X.Advance in duck Tembusu virus research [C]//The conference proceedings for 16th poultry neurology of CAAV.Beijing:Chinese Association of Animal Science and Verterinary Medicine,2012.

[2]李玉峰，馬秀麗，于可響，等.一種從鴨新分離的黃病毒研究初報 [J].畜牧獸醫(yī)學報，2011，42(6)：885-891.

Li Y F,Ma X L,Yu K X,et al.A brief report of Flavivirues newly isolated from duck [J].Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica,2011,42(6):885-891.

[3]陳仕龍，陳少鶯，王劭，等. 鴨黃病毒的分離鑒定 [J].動物醫(yī)學進展，2012，33(3)：123-125.

Chen S L,Chen S Y,Wang S,et al.Isolation and identification of a novel flavivirus strain from shelduck [J].Progress in Veterinary Medicine,2012,33(3):123-125.

[4]Yan P,Zhao Y,Zhang X,et al.An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in mainland China [J].Virology，2011，417(1)：1-8.

[5]Su J,Li S,Hu X,et al.Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus,a new Tembusu related Flavivirus [J].PLoS One，2011，6(3)：e18106.

[6]滕巧泱，顏丕熙，張旭，等.一種新的黃病毒導致蛋鴨產蛋下降及死亡 [J].中國動物傳染病學報，2010(6)：1-4.

Teng Q Y,Yan P X,Zhang X,et al.A novel Flavivirus causing duck egg drops and death [J].Chinese Journal of Veterinary Parasitology,2010(6):1-4.

[7]趙圓圓，李傳峰，朱良強，等.鴨產蛋下降-死亡綜合征的臨床診斷與病原的初步鑒定 [J].揚州大學學報(農業(yè)與生命科學版)，2011，32(3)：11-14.

Zhao Y Y,Li C F,Zhu L Q,et al.Clinical diagnosis and pathogenic identification of egg drop-death syndrome in duck [J].Journal of Yangzhou University (Agricultural and Life Science Edition),2011,32(3):11-14.

[8]萬春和，黃瑜.坦布蘇病毒致病特性及其流行病學 [J].動物醫(yī)學進展，2011，32(12)：116-118.

Wan C H,Huang Y.Pathogenicity and epidemiology of Tembusu virus [J].Progress in Veterinary Medicine,2011,32(12):116-118.

[9]劉友生，彭春香，黃瑜，等.2010-2011年中國部分地區(qū)禽坦布蘇病毒感染調查及分子變異分析 [J].中國動物傳染病學報，2012，20(1)：47-53.

Liu Y S,Peng C X,Huang Y,et al.Detection and molecular analysis of avian Tembusu virus partial areas of China from 2010 to 2011 [J].Chinese Journal of Animal Infectious Diseases,2012,20(1):47-53.

[10]李玉峰.鴨黃病毒感染研究進展 [J].中國家禽，2011，33(17)：30-31.

Li Y F.Advance in duck flavivirus research [J].China Poultry,2011,33(17):30-31.

[11]Tang Y,Diao Y,Gao X,et al.Analysis of the complete genome of Tembusu virus,a flavivirus isolated from ducks in China [J].Transbound Emerg Dis,2012,59(4):336.

[12]Bartholomeusz A,Tomlinson E,Wright P J,et al.Use of a flavivirus RNA-dependent RNA polymerase assay to investigate the antiviral activity of selected compounds [J].Antiviral Res,1994,24(4)：341-350.

[13]Koonin E V.Computer-assisted identification of a putative me-thyl-transferase domain in NS5 protein of flaviviruses and lambda 2 protein of reovirus [J].J Gen Virol,1993,74(4):733-740.

[14]劉玉斌.動物免疫學實驗技術 [M].長春：吉林科學技術出版社，1989：46-54.

Liu Y B.Animal immunology experiment technology [M].Changchun:Jilin Science and Technology Press,1989:46-54.

[15]曹雪濤.精編免疫學實驗指南 [M].北京：科學出版社，2009：120-123.

Cao X T.Immunology experiment guide [M].Beijing:Science Press,2009:120-123.

[16]周宗安.單克隆抗體技術手冊 [M].南京：南京大學出版社，1991．

Zhou Z A.Monoclonal antibody technology handbook [M].Nanjing:Nanjing University Press,1991.

[17]林源，柳金雄，陳普成，等.鴨坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體的制備及鑒定 [J].畜牧與獸醫(yī)，2013，45(10)：6-9.

Lin Y,Liu J X,Chen P C,et al.Preparation and identification of monoclonal antibody to E protein of duck Tembusu virus [J].Animal Husbandry & Veterinary Medicine,2013,45(10):6-9.

[18]鄭泓，韓雙艷，林影，等.質粒DNA單次脾內注射制備單克隆抗體 [J].生物工程學報，2007，23(4)：710-714.

Zheng H,Han S Y,Lin Y,et al.Preparation of monoclonal antibody based on single intrasplenic immunization of plasmid DNA [J].Chinese Journal of Biotechnology,2007,23(4):710-714.

Preparation and identification of monoclonal antibody against NS5 protein of duck Tembusu virus

YANG Guoping，DIAO Youxiang，ZHAO Dandan，CHEN Hao，TI Jinfeng，ZHANG Lu，ZHANG Ying，LI Chuanchuan

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShandongAgricultureUniversity,Tai’an,Shandong271017,China)

【Objective】 This study prepared a monoclonal antibody (McAb) against NS5 protein of duck Tembusu virus (DTMUV).【Method】 PET28a-NS5 vector was transformed intoEscherichiacoliRosetta (DE3),and BALB/c mice were immunized by the purified protein NS5 of DTMUV.Then,the specificity,reactivity,epitope and subclasses were identified.【Result】 Two monoclonal antibodies A4D1 and B4B8 were obtained by lymphocyte hybridoma technique.The ascites antibody titers of A4D1 and B4B8 were both 1∶64 000.Indirect ELISA,Western blot and indirect immunofluorescence assay (IFA) showed that the two McAbs reacted specifically with DTMUV and purified NS5 protein.The subtypes of both McAbs were IgG1 and they can recognize different antigen epitopes based on superposition ELISA method.【Conclusion】 Monoclonal antibodies against DTMUV NS5 were successfully prepared,which provides basis for further study of DTMUV NS5 functions.

duck Tembusu virus;NS5 protein;monoclonal antibody

時間:2016-09-0709:02DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.10.001

2015-03-11

國家自然科學基金項目(31272583)；山東自然科學基金項目(ZR2012CM002)；國家水禽產業(yè)技術體系項目(CARS-43-10)

楊國平(1989-)，男，山東招遠人，在讀碩士，主要從事禽病學研究。E-mail:ygp89@126.com

刁有祥(1962-)，男，山東膠州人，教授，博士，博士生導師，主要從事禽病學研究。E-mail：yxdiao@163.com

S852.65+7

A

1671-9387(2016)10-0001-06

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160907.0902.002.html