閆　攀,左亞峰, 張　偉,2,3,吳德玲,2,3,許鳳清,3,金傳山,2,劉勁松,3,方成武

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥　230012 ；2.安徽省中藥飲片產(chǎn)地加工與炮制一體化關(guān)鍵技術(shù)研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，安徽 合肥　230012；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物化學(xué)研究所，安徽 合肥　230012)

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酶水解對(duì)亳菊總黃酮中黃酮苷元的影響

閆攀1,左亞峰1, 張偉1,2,3,吳德玲1,2,3,許鳳清1,3,金傳山1,2,劉勁松1,3,方成武1

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230012 ；2.安徽省中藥飲片產(chǎn)地加工與炮制一體化關(guān)鍵技術(shù)研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，安徽 合肥230012；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物化學(xué)研究所，安徽 合肥230012)

目的體外研究烘干過(guò)程中酶對(duì)亳菊總黃酮成分的影響，為亳菊產(chǎn)地加工和炮制工藝提供前期研究基礎(chǔ)。方法模擬亳菊烘干過(guò)程，采用β-D-葡萄糖苷酶酶解亳菊總黃酮，以金合歡素、芹菜素、木犀草素3種黃酮苷元含量為指標(biāo)，分析酶解反應(yīng)對(duì)3種黃酮苷元含量變化的影響。結(jié)果酶解反應(yīng)后，亳菊總黃酮中木犀草素、芹菜素、金合歡素3種黃酮苷元的含量升高。結(jié)論β-D葡萄糖苷酶可酶解亳菊中黃酮類(lèi)成分，使其中黃酮苷元含量升高，β-葡萄糖苷酶水解亳菊總黃酮是烘干過(guò)程中黃酮苷元含量升高的原因之一。

β-D葡萄糖苷酶；亳菊；黃酮

亳菊具有明目平肝、疏風(fēng)清熱的功效[1]，一直被認(rèn)為是藥用菊花中的佳品?，F(xiàn)代研究表明，亳菊中含有黃酮類(lèi)化合物、苯丙素類(lèi)化合物以及揮發(fā)油等主要成分，其中黃酮類(lèi)成分是其降血壓主要有效成分[2]。亳菊傳統(tǒng)的加工方法是懸掛陰干的干燥方式[3-4]，已經(jīng)難以適應(yīng)目前大規(guī)模加工新鮮菊花的要求。前期研究結(jié)果[5]顯示，在經(jīng)過(guò)烘干加工后的亳菊中的木犀草素苷等黃酮苷類(lèi)成分較陰干的樣品含量降低，而對(duì)應(yīng)苷元含量則相對(duì)升高，同時(shí)亳菊中提取得到的粗酶液基本具備β-D-葡萄糖苷的基本特性[6]，推測(cè)其原因可能是加熱過(guò)程激活亳菊中分解黃酮苷的酶活性，引起黃酮苷類(lèi)化合物分解。植物來(lái)源的β-葡萄糖苷酶最早發(fā)現(xiàn)于苦杏仁中，該酶廣泛存在于自然界中，具有許多重要的生物學(xué)功能，有學(xué)者對(duì)來(lái)源于茶葉、梔子花、茉莉花的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，β-D-葡萄糖苷酶在醇系香氣的形成中起到重要作用[7-9]，說(shuō)明植物來(lái)源的β-D-葡萄糖苷酶對(duì)于植物中相關(guān)成分具有一定的影響。為驗(yàn)證亳菊在加工過(guò)程中黃酮苷含量降低，黃酮類(lèi)苷元升高是由于亳菊中酶水解黃酮苷產(chǎn)生苷元的猜想，本實(shí)驗(yàn)?zāi)M亳菊加工過(guò)程，采用β-D葡萄糖苷酶與亳菊總黃酮進(jìn)行體外反應(yīng)，研究酶在亳菊烘干過(guò)程中酶對(duì)亳菊中黃酮類(lèi)成分的影響，為亳菊合理的產(chǎn)地加工炮制工藝提供前期研究基礎(chǔ)。

1　儀器與試藥

Waters 1525型高效液相色譜儀(包括Waters 1525 Binary HPLC Pump，Waters 2498 UV/Visible Detecor，Waters 2707 Autosampler)；十萬(wàn)分之一分析天平(AB135-S，瑞士梅特勒-托利多)；PALL-Life Scienses一體式超純水系統(tǒng)(美國(guó)頗爾公司)；Agilent HC-C18(2) 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

β-D葡萄糖苷酶(sigma公司，7.4 U/mg)，亳菊總黃酮(實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào) 20151208)，金合歡素(實(shí)驗(yàn)室自制，純度≥98%)，木犀草素、芹菜素(武漢天植生物技術(shù)有限公司，批號(hào)CFN 98843，純度≥98%)；乙腈(瑞典OCEANPAK歐普森公司，色譜純)；水為純凈水。

2　樣品的測(cè)定

2.1對(duì)照品溶液的配制分別精密稱(chēng)取對(duì)照品木犀草素5.26 mg、金合歡素5.31 mg、芹菜素5.16 mg至10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容，制成每毫升含有木犀草素0.526 mg、金合歡素0.531 mg、芹菜素0.516 mg的對(duì)照品溶液；精密稱(chēng)取適量的β-D-葡萄糖苷酶配制成酶活力分別為1、2、3、5、7、10、13、15、18、20、30 U/mL酶活力的水溶液，低溫密封避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2樣品溶液的制備

2.2.1亳菊總黃酮樣品的制備精密移取0.2 mL水和甲醇1 mL注入2.5 mL EP管中，然后注入2 mg/mL的亳菊總黃酮水溶液0.2 mL于50 ℃水浴中加熱溶解，將溶液以0.22 μm有機(jī)濾膜濾過(guò)，得亳菊總黃酮樣品。

2.2.2酶失活組樣品制備精密移取20 U/mL的β-D葡萄糖苷酶水溶液0.2 mL與甲醇1 mL先后注入2.5 mL EP管中使酶失活，然后注入2 mg/mL的亳菊總黃酮水溶液0.2 mL于50 ℃水浴中反應(yīng)1 h，將反應(yīng)液以0.22 μm有機(jī)濾膜濾過(guò)，得到酶失活反應(yīng)組樣品。

2.2.3酶解反應(yīng)組樣品制備精密移取20 U/mL的β-D葡萄糖苷酶水溶液0.2 mL與2 mg/mL的亳菊總黃酮水溶液各0.2 mL先后注入2.5 mL EP管中,在50 ℃水浴環(huán)境下反應(yīng)60 min，隨后立即注入1 mL甲醇終止反應(yīng)，將反應(yīng)液以0.22 μm有機(jī)濾膜濾過(guò)，得到酶解反應(yīng)組樣品。

2.3樣品的測(cè)定方法采用高效液相色譜法，Agilent HC-C18(2) 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，柱溫為30 ℃，以流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，線(xiàn)性梯度洗脫(見(jiàn)表1)，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

以木犀草素峰面積(Y1)，芹菜素面積(Y2)和金合歡素面積(Y3)為縱坐標(biāo)對(duì)進(jìn)樣濃度X(μg/mL)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程，Y1=65 062X，r=0.999；Y2=89 644X，r=0.999 5；Y3=100 625X，r=0.999 5，結(jié)果表明木犀草素進(jìn)樣濃度在0.17～13.6 μg/mL，芹菜素進(jìn)樣濃度在0.645～21.6 μg/mL，金合歡素進(jìn)樣濃度在0.66～53.1μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

表1　梯度洗脫系統(tǒng)

注：S1為木犀草素；S2為芹菜素；S3為金合歡素。

圖1對(duì)照品色譜圖

3　不同因素對(duì)亳菊總黃酮酶解反應(yīng)的影響

3.1不同溫度對(duì)亳菊黃酮酶解反應(yīng)的影響精密移取20 U/mL的β-D葡萄糖苷酶溶液與2 mg/mL的亳菊黃酮水溶液各0.2 mL先后注入2.5 mL EP管中，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的水浴環(huán)境下反應(yīng)2 h，然后立即向EP管中注入1 mL甲醇終止反應(yīng)，將反應(yīng)溶液以0.22 μm有機(jī)濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液為樣品，進(jìn)行高效液相色譜分析，并以木犀草素、芹菜素和金合歡素對(duì)應(yīng)的濃度為指標(biāo)，找出最適反應(yīng)溫度。

注：Y1為酶水解亳菊總黃酮樣品；Y2為酶失活水解總黃酮樣品；Y3為亳菊總黃酮；1為木犀草素；2為芹菜素；3為金合歡素。

圖2樣品色譜圖

3.2不同酶活力對(duì)亳菊黃酮苷轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響精密移取酶活力為1、2、3、5、7、10、13、15、18、20、30 U/mL的β-D葡萄糖苷酶溶液與底物濃度為2 mg/mL的亳菊總黃酮水溶液各0.2 mL，在50 ℃的水浴環(huán)境下反應(yīng)2 h，然后立即向EP管中注入1 mL甲醇終止反應(yīng)，將反應(yīng)溶液以0.22 μm有機(jī)濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液為樣品，進(jìn)行高效液相色譜分析，并以木犀草素、芹菜素和金合歡素對(duì)應(yīng)的濃度為指標(biāo)，找出最適反應(yīng)酶活力。

3.3不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)亳菊黃酮苷轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響精密移取酶活力為20 U/mL的β-D葡萄糖苷酶溶液與2 mg/mL的亳菊總黃酮水溶液各0.2 mL先后注入2.5 mL EP管中，在50 ℃水浴環(huán)境下分別反應(yīng)5、15、30、45、60、75、90、120 min，隨后立即注入1 mL甲醇終止反應(yīng)，進(jìn)行液相分析，找出最適反應(yīng)時(shí)間。

4　結(jié)果

4.1酶解反應(yīng)前后黃酮苷元變化量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與酶失活組比較，酶解反應(yīng)組黃酮苷元含量升高，表明β-D葡萄糖苷酶酶解反應(yīng)可促使亳菊中黃酮類(lèi)成分發(fā)生轉(zhuǎn)化，從而使其內(nèi)部黃酮苷元的含量增加，見(jiàn)表2、圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中黃酮類(lèi)成分變化與加熱烘干亳菊過(guò)程中黃酮類(lèi)成分的變化一致。

表2　樣品黃酮苷元濃度(n=3)

注：“-”表示低于樣品測(cè)量下限，無(wú)法測(cè)定。

4.2不同溫度對(duì)亳菊總黃酮酶解反應(yīng)的影響不同溫度下亳菊總黃酮與β-D葡萄糖苷酶溶液反應(yīng)后最終黃酮苷元的峰面積變化見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，在30～50 ℃水浴環(huán)境下，黃酮苷元含量隨著溫度升高而逐漸升高，當(dāng)水浴溫度高于50 ℃時(shí)，隨著溫度升高黃酮苷元含量總體呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明在水浴溫度為50 ℃時(shí)β-D葡萄糖苷酶活力最高，反應(yīng)最完全，因此選擇50 ℃水浴溫度進(jìn)行酶解反應(yīng)。

圖3　不同溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響

4.3不同酶活力β-D葡萄糖苷酶溶液對(duì)亳菊總黃酮的影響不同酶活力β-D葡萄糖苷酶溶液與亳菊總黃酮反應(yīng)后黃酮苷元的峰面積結(jié)果見(jiàn)圖4。β-D葡萄糖苷酶酶解黃酮苷時(shí)，在0～20 U/mL階段隨著酶活力升高，黃酮苷元含量逐漸增多，在20～30 U/mL酶活力持續(xù)升高，黃酮苷元含量基本保持不變，因此選擇酶活力為20 U/mL的β-D葡萄糖苷酶溶液作為最適酶活力溶液參與反應(yīng)。

圖4　 不同酶活力對(duì)酶解反應(yīng)的影響

4.4不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)亳菊總黃酮酶解反應(yīng)的影響β-D葡萄糖苷酶溶液與亳菊總黃酮分別進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的反應(yīng)后，黃酮苷元的色譜峰面積結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，在0～60 min，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮苷元含量不斷增加，在60 min時(shí)達(dá)到最大值，此后隨著反應(yīng)時(shí)間逐漸增加，黃酮苷元含量先保持不變，繼而開(kāi)始降低。因此，β-D葡萄糖苷酶與亳菊總黃酮反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為60 min。

圖5　不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的影響

5　討論

通過(guò)對(duì)各樣品中3種黃酮苷元含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與酶失活組比較，酶解反應(yīng)組和亳菊總黃酮組黃酮苷元含量升高，表明亳菊總黃酮在酶解條件下會(huì)導(dǎo)致黃酮苷元含量升高，這種現(xiàn)象與亳菊加熱加工中亳菊樣品中黃酮類(lèi)化合物的變化一致，進(jìn)一步驗(yàn)證亳菊在烘制條件下黃酮苷元含量升高可能是由加熱過(guò)程中酶解反應(yīng)所致的推測(cè)。

本研究以亳菊總黃酮為底物，考察酶解溫度、酶活力、反應(yīng)時(shí)間3個(gè)單一因素，對(duì)β-D葡萄糖苷酶水解亳菊總黃酮反應(yīng)的條件進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，酶解溫度對(duì)亳菊總黃酮酶解反應(yīng)的影響最為顯著，后期將結(jié)合文獻(xiàn)[10-11]對(duì)β-D葡萄糖苷酶水解亳菊總黃酮反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，研究不同酶水解因素在水解亳菊總黃酮過(guò)程中的影響。亳菊體內(nèi)反應(yīng)環(huán)境復(fù)雜，成分變化原因多樣，因此，亳菊內(nèi)生酶對(duì)于亳菊加工過(guò)程中黃酮類(lèi)成分變化的影響有待于進(jìn)一步研究。

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Influence of Enzyme Hydrolysis on Flavonoid Aglycones in Total Flavonoids in Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou

YANPan1,ZUOYa-feng1,ZHANGWei1,2,3,WUDe-ling1,2,3,XUFeng-qing1,3,JINChuan-shan1,2,LIUJin-song1,3,FANGCheng-wu1

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.ResearchandInnovationTeamforKeyTechnologyofIntegratedProcessingandPreparationofChineseMedicinalDecoctionPiecesinProducingArea,AnhuiHefei230012,China; 3.InstituteofPharmaceuticalChemistry,AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

ObjectiveTo investigate the influence of enzyme on total flavonoids in Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou during the drying process, and to provide a basis for preliminary studies on the processing and preparation technology for Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou in its producing area. MethodsThe drying process for Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou was simulated. The β-D-glucosidase was used for enzymolysis of total flavonoids in Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou. The content of three flavonoid aglycones, i.e., acacetin, apigenin, and luteolin, was used as indices to analyze the influence of enzymolysis on the content of these three flavonoid aglycones. ResultsAfter enzymolysis, there were increases in the content of acacetin, apigenin, and luteolin in total flavonoids in Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou. ConclusionThe β-D-glucosidase is involved in the enzymolysis of flavonoids in Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou and can increase the content of flavonoid aglycones. Hydrolysis of total flavonoids in Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou by β-D-glucosidase is one of the reasons for the increased content of flavonoid aglycones during the drying process.

β-D-glucosidase; Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou; Flavone

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81303229)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1408085MH20);安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目(1301042100)

閆攀(1989-)，男，碩士研究生

張偉，zhangwei05515125@163.com

R284[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.05.024

2016-03-16；編輯：張倩)