王　芹，申國明，王　浩，何　瑩，尤良震，葉　樹，王　柳，姚永傳

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽 合肥　230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥　230038)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

益氣活血通絡(luò)方對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響

王芹1，申國明2，王浩1，何瑩1，尤良震1，葉樹1，王柳1，姚永傳1

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院，安徽 合肥230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥230038)

目的研究益氣活血通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)炎性因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)及金屬基質(zhì)蛋白酶-1(metal matrix proteinase-1, MMP-1)表達(dá)的影響，探討益氣活血通絡(luò)方對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。方法選擇SD大鼠30只，中藥灌胃，制備含藥血清。體外培養(yǎng)HUVECs，MTT法檢測不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度葡萄糖對(duì)細(xì)胞存活率的影響；將HUVECs隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組，模型組，益氣活血通絡(luò)方低、中、高濃度組，高糖刺激后，分別加入不同濃度益氣活血通絡(luò)方含藥血清干預(yù)，收集上清及細(xì)胞，ELISA法檢測IL-6的表達(dá)，Western Blot法測定IL-1β、TNF-α、MCP-1及MMP-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，33.3 mmol/L高糖組(模型組)細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)；高糖刺激可引起IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1及MMP-1蛋白的高表達(dá)(P<0.05)，益氣活血通絡(luò)方含藥血清顯著抑制IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1及MMP-1蛋白的高表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論益氣活血通絡(luò)方可抑制炎性因子的高表達(dá)，對(duì)高糖損傷的HUVECs有一定的保護(hù)作用。

糖尿病周圍神經(jīng)病變；益氣活血通絡(luò)方；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；高糖；炎性因子

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病所致神經(jīng)病變中最常見的一種，患病率達(dá)到50%以上[1]。DPN的存在不但影響患者的生活質(zhì)量，而且增加糖尿病患者足潰瘍、壞疽、截肢的危險(xiǎn)性，已成為導(dǎo)致糖尿病患者喪失勞動(dòng)能力的主要原因之一。眾多研究表明，DPN的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，與多種因素有關(guān)[2]。而炎癥機(jī)制與DPN的聯(lián)系緊密，在DPN的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起著重要作用[3]。已有研究[4]表明，DPN患者血清炎性因子(如白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子)水平有所增加。近年來，中醫(yī)藥治療DPN得到了越來越廣泛的認(rèn)可，同時(shí)取得了較大的突破[5]。本課題組的前期研究結(jié)果[6-7]表明，益氣活血通絡(luò)方(原名芪歸糖痛寧顆粒)可明顯降低糖尿病大鼠炎性因子的水平，對(duì)DPN大鼠具有保護(hù)作用。DPN發(fā)病中神經(jīng)供血障礙是造成周圍神經(jīng)損傷的一個(gè)重要因素[8]，長期高血糖等因素刺激毛細(xì)血管管壁，使給予周圍神經(jīng)供血的毛細(xì)血管基底膜增厚，血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，血管逐漸透明變性，從而使糖化蛋白沉積，血管管腔狹窄，使其運(yùn)輸血氧能力下降，逐漸導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞缺血低氧，造成嚴(yán)重的周圍神經(jīng)慢性損害。一項(xiàng)近期的臨床研究顯示，DPN與血管病變密切相關(guān)[9]，也提示它們存在共同的供血障礙機(jī)制。本研究觀察益氣活血通絡(luò)方含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)炎性因子表達(dá)的影響，從蛋白表達(dá)水平探討益氣活血通絡(luò)方對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。

1　材料

1.1動(dòng)物與細(xì)胞株SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(275±25)g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(皖)2011-002。HUVECs購自復(fù)旦IBS細(xì)胞資源中心。

1.2藥物與試劑益氣活血通絡(luò)方(黃芪30 g，雞血藤15 g，當(dāng)歸、生地黃、葛根各12 g，威靈仙、延胡索各9 g，等)：由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，批號(hào) 20151111。低糖DMEM培養(yǎng)基：美國HyClone公司；胎牛血清：德國Serana公司；胰蛋白酶：美國Sigma公司；白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)ELISA試劑盒：上海谷研實(shí)業(yè)有限公司；兔抗人白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、金屬基質(zhì)蛋白酶-1(metal matrix proteinase-1, MMP-1)、單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)抗體：英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；D-葡萄糖、蛋白裂解液：北京Solarbio公司；BCA蛋白定量試劑盒：上海BestBio公司；MTT：Biosharp公司；DMSO：美國Sigma公司。

1.3儀器3111型-恒溫CO2培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；3K15-高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司；SW-CJ系列潔凈工作臺(tái)(AIRTECH)：江蘇省蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Multiskan MK2 型酶標(biāo)儀：芬蘭Labsystem公司；CX21FS1型光學(xué)顯微鏡：日本奧林巴斯公司；垂直板電泳裝置：美國BIO-RAD公司；Protein simple FCM凝膠成像系統(tǒng)。

2　方法

2.1含藥血清的制備取雄性SD大鼠30只，將其隨機(jī)分為兩組，分別為對(duì)照血清組和益氣活血通絡(luò)方含藥血清組，每組15只。對(duì)照組灌胃生理鹽水10 mL/kg，益氣活血通絡(luò)方含藥血清組灌胃中藥復(fù)方，以成人等效劑量的10倍給藥，每次給藥量為11.14 g/kg(以成人臨床用藥量×動(dòng)物等效劑量比值×血清稀釋度為參考給藥量)。連續(xù)7 d，每天灌胃2次，間隔8 h，第7天上午灌胃2次，間隔2 h。于末次給藥1 h后，腹腔注射3.5%水合氯醛進(jìn)行麻醉，無菌條件下腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置1 h，3 000 r/min、15 min離心分離血清，56 ℃，30 min滅活，0.22 μm微孔濾膜過濾，1 mL無菌EP管分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2HUVECs的培養(yǎng)HUVECs用DMEM培養(yǎng)基(加有10%胎牛血清和終濃度皆為100 U/mL的青霉素及鏈霉素)置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合狀態(tài)，再用0.25%胰蛋白酶消化傳代。采用培養(yǎng)的第2～4代內(nèi)皮細(xì)胞，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞左右接種于96孔或6孔微量反應(yīng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，待貼壁后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3MTT法檢測不同濃度葡萄糖對(duì)細(xì)胞的影響細(xì)胞接種于96孔板后，置于恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后換用無血清的低糖DMEM培養(yǎng)液，使細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，24 h后棄去DMEM培養(yǎng)液，然后隨機(jī)分組加入不同濃度葡萄糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分5組：①葡萄糖濃度5.55 mmol/L；②葡萄糖濃度11.1 mmol/L；③葡萄糖濃度22.2 mmol/L；④葡萄糖濃度33.3 mmol/L；⑤葡萄糖濃度44.4 mmol/L。每組內(nèi)分為3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(12、24、48 h)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞用不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基分別培養(yǎng)12、24、48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸取上清，棄之，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀上于490 nm波長處檢測各組吸光度(optical density, OD)值。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

2.4分組及干預(yù)將HUVECs細(xì)胞懸液以2×105/mL濃度接種于6孔板中，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去上清液，換用無血清的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。將細(xì)胞分為5組，即空白對(duì)照組，高糖模型組，益氣活血通絡(luò)方低、中、高濃度組，每組樣本5個(gè)復(fù)孔。各組分別接受相應(yīng)的干預(yù)方法。①空白對(duì)照組：培養(yǎng)液葡萄糖濃度為5.55 mmol/L，含空白對(duì)照組大鼠血清濃度15%，加入一定量的甘露醇平衡滲透壓；②高糖模型組：培養(yǎng)液葡萄糖濃度為33.3 mmol/L，含空白對(duì)照組大鼠血清濃度為15%；③益氣活血通絡(luò)方低濃度組：培養(yǎng)液葡萄糖濃度為33.3 mmol/L，含藥血清濃度為5%，空白對(duì)照組大鼠血清濃度為10%；④益氣活血通絡(luò)方中濃度組：培養(yǎng)液葡萄糖濃度為33.3 mmol/L，含藥血清濃度為10%，空白對(duì)照組大鼠血清濃度5%；⑤益氣活血通絡(luò)方高濃度組：培養(yǎng)液葡萄糖濃度為33.3 mmol/L，含藥血清濃度15%。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

2.5檢測指標(biāo)和方法收集細(xì)胞上清液，3 000 r/min離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測IL-6的含量。收集細(xì)胞，加入含PMSF的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞蛋白樣品，蛋白濃度由BCA法檢測，制備好的蛋白樣品置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ坑镜郎蠘? μL，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，室溫封閉2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，分別加入1∶500兔抗人IL-1β、TNF-α、MCP-1一抗及1∶1 000兔抗人MMP-1一抗，4 ℃搖床過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶20 000)，置室溫作用2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，滴入SuperSignal West Femto高靈敏度化學(xué)發(fā)光底物顯影1 min，放入凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶。

3　結(jié)果

3.1不同濃度葡萄糖作用不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞活力的影響高糖會(huì)造成HUVECs的損傷，影響內(nèi)皮細(xì)胞的生長活性，結(jié)果顯示，11.1、22.2 mmol/L葡萄糖組細(xì)胞存活率在12～48 h內(nèi)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸增高；33.3、44.4 mmol/L葡萄糖組細(xì)胞存活率在12～48 h內(nèi)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸降低，且均呈時(shí)間-濃度依賴趨勢。與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組(5.55 mmol/L)相比，高糖組的細(xì)胞活力均明顯下降(P<0.05)；細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，33.3 mmol/L葡萄糖組細(xì)胞存活率趨于50%，活力顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1　不同濃度葡萄糖作用不同時(shí)間對(duì)HUVECs細(xì)胞存活率的影響

注：與5.55 mmol/L葡萄糖組比較，*P<0.05；與33.3 mmol/L葡萄糖組比較，#P<0.05。

3.2ELISA法檢測的各組HUVECs中IL-6表達(dá)水平比較用高糖刺激HUVECs后，可引起IL-6蛋白的高表達(dá)，與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與高糖模型組比較，益氣活血通絡(luò)方含藥血清高濃度組可抑制IL-6蛋白的高表達(dá)(P<0.05)。見表2。

表2　益氣活血通絡(luò)方對(duì)高糖培養(yǎng)HUVECs中IL-6表達(dá)的影響

注：與高糖模型組比較，*P<0.05。

3.3Western Blot法檢測的各組HUVECs中IL-1β、TNF-α、MCP-1及MMP-1表達(dá)水平比較用高糖刺激HUVECs后，引起IL-1β、TNF-α、MCP-1及MMP-1蛋白的高表達(dá)，與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與高糖模型組比較，含藥血清顯著抑制IL-1β、TNF-α、MCP-1及MMP-1蛋白的高表達(dá)，其中益氣活血通絡(luò)方低濃度對(duì)TNF-α、MCP-1表達(dá)，中濃度對(duì)IL-1β、TNF-α、MCP-1表達(dá)，高濃度對(duì)IL-1β、TNF-α、MCP-1、MMP-1表達(dá)的抑制作用均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖1。

表3　益氣活血通絡(luò)方對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β、TNF-α、MCP-1及MMP-1蛋白表達(dá)的影響

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與高糖模型組比較，#P<0.05。

注：A.空白對(duì)照組；B.高糖模型組；C.益氣活血通絡(luò)方低濃度組；D.益氣活血通絡(luò)方中濃度組；E.益氣活血通絡(luò)方高濃度組。

圖1益氣活血通絡(luò)方對(duì)高糖培養(yǎng)的HUVECs中IL-1β、

TNF-α、MCP-1及MMP-1表達(dá)的影響(Western blot法)

4　討論

內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥機(jī)制在DPN的發(fā)生和發(fā)展中起著極為重要的作用。在DPN的發(fā)生、發(fā)展過程中，慢性炎性反應(yīng)持續(xù)存在，一系列細(xì)胞因子，包括IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1等，和蛋白酶(如基質(zhì)金屬蛋白酶類)通過直接或間接的方式在周圍神經(jīng)損傷與修復(fù)中發(fā)揮著極其復(fù)雜的作用，最終炎性信號(hào)通路激活，引發(fā)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響炎癥的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后，與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[10-12]。由于DPN發(fā)生發(fā)展過程中免疫和炎性反應(yīng)貫穿始終，周圍神經(jīng)受損后，軸突出現(xiàn)變性，炎性反應(yīng)和急性期反應(yīng)過程中出現(xiàn)各種血漿蛋白和炎性細(xì)胞因子水平的變化[13]，IL-1β、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，一方面啟動(dòng)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活核轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡[14]；而另一方面炎性因子又可以刺激神經(jīng)細(xì)胞啟動(dòng)自我保護(hù)機(jī)制，刺激膠質(zhì)細(xì)胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等，促進(jìn)軸突修復(fù)[15]。MCP-1在絕大多數(shù)細(xì)胞包括系膜細(xì)胞和單核細(xì)胞中均有表達(dá)，對(duì)單核及巨噬細(xì)胞具有很強(qiáng)的趨化活性。既往研究[16-17]表明，在糖尿病周圍神經(jīng)病變患者的尿液及血液中，MCP-1的表達(dá)水平均明顯增高，高水平的MCP-1能夠誘導(dǎo)炎性細(xì)胞在組織的浸潤，從而引起周圍神經(jīng)的損害。基質(zhì)金屬蛋白酶是參與細(xì)胞外基質(zhì)代謝的一類重要的蛋白分解酶之一，在基質(zhì)降解的過程起著重要的作用，而MMP-1可能參與相關(guān)組織細(xì)胞外基質(zhì)的改建，使一系列組織重塑，研究[18]表明，糖尿病患者體內(nèi)，MMP-1的表達(dá)顯著升高。本項(xiàng)目組以HUVECs為研究對(duì)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖刺激HUVECs，能誘導(dǎo)炎性因子和蛋白酶生成增多。

在病理、病機(jī)等方面，炎性反應(yīng)與血瘀證之間都存在著密切的關(guān)系，在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，炎性因子體現(xiàn)出與血瘀證的相關(guān)性。孫豐雷等[19]研究顯示，炎性反應(yīng)參與糖尿病患者血瘀證的形成，活血化瘀方藥可通過調(diào)節(jié)炎性因子水平起到防治糖尿病及其并發(fā)癥的作用。袁肇凱等[20]研究證明，血瘀證與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)密切相關(guān)。還有一些與血瘀證相關(guān)的內(nèi)皮因子，雖不直接參加炎性反應(yīng)，但也可以間接影響炎性因子的釋放，從而間接產(chǎn)生炎性反應(yīng)。有研究[21]表明，益氣活血通絡(luò)中藥能夠有效抑制炎性因子的分泌。項(xiàng)目組選擇一種治療DPN的中藥益氣活血通絡(luò)方，本方由黃芪、當(dāng)歸、生地黃、延胡索、葛根、雞血藤、威靈仙組成?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪可降低血糖，改善血液流變性和微循環(huán)，抗感染，增加免疫功能；當(dāng)歸、生地黃水煎液對(duì)多種致炎劑引起的急慢性炎癥均有顯著的抑制作用，其中生地黃水提取物能使外周血T淋巴細(xì)胞顯著增加；雞血藤具有改善血流動(dòng)力學(xué)、調(diào)節(jié)免疫、升高白細(xì)胞等作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的HUVECs在高糖條件下48 h，細(xì)胞活力明顯下降，炎性因子的表達(dá)明顯增多，而益氣活血通絡(luò)方各濃度組均能明顯下調(diào)HUVECs炎性因子(IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1)和蛋白酶MMP-1的高表達(dá)，且高濃度組效果更顯著。結(jié)果表明益氣活血通絡(luò)方可以通過抑制炎性因子和蛋白酶的表達(dá)，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞的損傷以及各種炎性反應(yīng)的發(fā)生，這可能是其保護(hù)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制之一。

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Effect of Yiqihuoxuetongluo Prescription on Expression of High Glucose-induced Inflammatory Factors in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

WANGQin1,SHENGuo-ming2,WANGHao1,HEYing1,YOULiang-zhen1,YEShu1,WANGLiu1,YAOYong-chuan1

(1.ClinicalSchoolofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China; 2.GraduateSchoolofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

ObjectiveTo observe the effect of serum containing Yiqihuoxuetongluo Prescription on the expression of high glucose-induced inflammatory factors, interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and metal matrix proteinase-1 (MMP-1), in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), as well as the protective effect of Yiqihuoxuetongluo Prescription on HUVECs. MethodsA total of 30 Sprague-Dawley rats were treated with Yiqihuoxuetongluo Prescription by gavage to prepare the serum containing Yiqihuoxuetongluo Prescription. HUVECs were culturedinvitro, and the MTT method was used to investigate the influence of various concentrations of glucose on the survival rate of cells at different time points. HUVECs were randomly divided into blank control group, model group, and low-, medium-, and high-dose Yiqihuoxuetongluo Prescription groups. After high glucose stimulation, serum containing Yiqihuoxuetongluo Prescription of various concentrations was added, and the supernatant and cells were collected. ELISA was used to measure the expression of interleukin-6 (IL-6), and Western blot was used to measure the expression of IL-1β, TNF-α, MCP-1, and MMP-1. ResultsAfter 48 hours of cell culture, the 33.3 mmol/L high glucose group (model group) showed a significant reduction in cell viability (P<0.05). High glucose stimulation caused high expression of IL-6, IL-1β, TNF-α, MCP-1, and MMP-1 (P<0.05), and serum containing Yiqihuoxuetongluo Prescription significantly inhibited the high expression of IL-6, IL-1β, TNF-α, MCP-1, and MMP-1 (P<0.05). ConclusionYiqihuoxuetongluo Prescription can inhibit the high expression of inflammatory factors and has a certain protective effect against high glucose damage in HUVECs.

Diabetic peripheral neuropathy; Yiqihuoxuetongluo Prescription; Human umbilical vein endothelial cell; High glucose; Inflammatory factor

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81273646)

王芹(1990-)，女，碩士研究生

申國明，shengm_66@163.com

R587.2；R285.5[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.05.020

2016-05-31；編輯：姚實(shí)林)