吳安玥，邱麗華

·論著·

Fn14活化凋亡增強(qiáng)人上皮性卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感度的研究

吳安玥，邱麗華

目的：探討成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)誘導(dǎo)因子14（Fn14）對(duì)人上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）細(xì)胞的順鉑（DDP）敏感度的影響及其可能機(jī)制。方法：蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法檢測(cè)EOC細(xì)胞株SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP中Fn14蛋白的表達(dá)情況，選擇低表達(dá)Fn14蛋白的細(xì)胞株轉(zhuǎn)染Fn14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株的Fn14蛋白、凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、cleaved caspase-3和Bcl-2的表達(dá)情況。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力及DDP半數(shù)抑制濃度（IC50）。流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果：人EOC細(xì)胞株SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP中，A2780/DDP細(xì)胞株Fn14蛋白表達(dá)水平最低。Fn14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A2780/DDP細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Fn14表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05）；細(xì)胞的增殖能力無(wú)變化，但細(xì)胞DDP的IC50顯著降低（P＜0.05）。流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步顯示Fn14可以增加DDP誘導(dǎo)的A2780/DDP凋亡細(xì)胞數(shù)目。同時(shí)，Western blotting結(jié)果顯示促凋亡蛋白caspase-3表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯下降（P＜0.05）。結(jié)論：Fn14可能活化凋亡通路進(jìn)而提高A2780/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感度。

卵巢腫瘤；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)誘導(dǎo)因子14；順鉑；抗藥性，腫瘤；細(xì)胞凋亡

（J Int Obstet Gynecol，2016，43:335-339）

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）死亡率占婦科惡性腫瘤的首位［1］，雖然腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類為主的化療對(duì)80%的患者有明顯臨床療效，但是大部分患者在初始治療18～24個(gè)月左右復(fù)發(fā)，僅有10%～15%能獲得長(zhǎng)期緩解［2］。目前認(rèn)為EOC患者因化療耐藥而引起腫瘤復(fù)發(fā)，是導(dǎo)致其5年生存率低下的主要原因之一［3-4］。故研究卵巢癌耐藥機(jī)制，從而找到靶點(diǎn)來(lái)減少或者逆轉(zhuǎn)卵巢癌鉑類耐藥，是改善卵巢癌預(yù)后的關(guān)鍵因素。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)誘導(dǎo)因子14（Fn14）是Ⅰ型跨膜蛋白，是腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族中的最小成員，其配體是腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導(dǎo)劑（TWEAK）。Fn14在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、化療耐藥中發(fā)揮重要作用［5-6］。目前研究顯示，F(xiàn)n14通過(guò)激活核因子κB（NF-κB）通路介導(dǎo)胃癌、小細(xì)胞肺癌的化療耐藥［7-8］，但其在EOC鉑類耐藥中的作用不明。本實(shí)驗(yàn)擬研究Fn14在EOC順鉑（DDP）耐藥中的作用及其相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步尋找遏制EOC細(xì)胞化療耐藥提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要儀器及試劑改良型RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液（Hyclone公司）；FBS（Hyclone公司）；雙抗（青霉素、鏈霉素，Hyclone公司）；兔抗人Fn14抗體、兔抗人caspase-3抗體、兔抗人Bcl-2抗體（Cell Signaling Technology公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；pcDNA3.1-Fn14質(zhì)粒（廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心惠贈(zèng)）；DH5α感受態(tài)菌（大連寶生物公司）；DDP（山東齊魯制藥有限公司）；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取盒（北京天根科技有限公司）；細(xì)胞凋亡試劑盒（BD公司）；細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板（Corning公司）；遠(yuǎn)紅外熒光掃描儀（LICOR公司）；異丙醇、無(wú)水乙醇、氯化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graphpad Prism 5軟件處理數(shù)據(jù)，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人EOC細(xì)胞株中Fn14蛋白表達(dá)水平的比較

Western blotting結(jié)果顯示在人EOC的SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP細(xì)胞株中，A2780/DDP細(xì)胞株內(nèi)Fn14蛋白表達(dá)水平最低，故采用低表達(dá)Fn14蛋白的A2780/DDP細(xì)胞株為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1 各EOC細(xì)胞株中Fn14蛋白表達(dá)水平

2.2轉(zhuǎn)染Fn14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)A2780/DDP細(xì)胞株中Fn14蛋白表達(dá)水平的影響Western blotting結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Fn14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后的A2780/DDP細(xì)胞中Fn14表達(dá)水平較vector組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.147，P=0.002）。見圖2。

圖2 Fn14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A2780/DDP細(xì)胞后，F(xiàn)n14蛋白表達(dá)水平的變化

2.3 轉(zhuǎn)染Fn14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)A2780/DDP細(xì)胞DDP敏感度（IC50）的影響CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示Fn14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，A2780/DDP細(xì)胞IC50由（46.450±0.922）μg/mL降至（24.368±0.352）μg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.875，P=0.019），見圖3A。這提示Fn14增加了細(xì)胞對(duì)DDP的敏感度。未加入DDP時(shí)，與vector組相比，F(xiàn)n14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞OD450 nm值的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；加入DDP（終濃度10 μg/mL）處理后，DDP對(duì)Fn14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖抑制作用更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3B。這提示Fn14不影響細(xì)胞增殖，故Fn14促進(jìn)DDP對(duì)A2780/DDP細(xì)胞增殖能力的抑制，非細(xì)胞增殖能力減弱所致。

2.4 Fn14對(duì)A2780/DDP細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)顯示，未加入DDP時(shí)，vector組和Fn14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組總凋亡率均＜1%。當(dāng)加入DDP（終濃度為25 μg/mL）處理24 h后，vector組和Fn14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的總凋亡率分別為（12.1±1.5）%和（27.3±2.5）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.864，P=0.001）。提示Fn14促進(jìn)DDP所誘導(dǎo)的A2780/DDP細(xì)胞凋亡。見圖4。

2.5 轉(zhuǎn)染Fn14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì)A2780/DDP細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Western blotting結(jié)果顯示，未加入DDP時(shí)，與vector組細(xì)胞相比，F(xiàn)n14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的caspase-3蛋白前體、caspase-3蛋白活化體、Bcl-2無(wú)明顯變化。當(dāng)DDP處理（終濃度為25 μg/mL）24 h后，轉(zhuǎn)染Fn14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的A2780/DDP細(xì)胞中的caspase-3蛋白活化體表達(dá)上調(diào)（t=3.411，P=0.027），Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)（t=6.645，P=0.003），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。

圖3 Fn14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A2780/DDP細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力及DDP敏感度的變化

3 討論

圖4 A2780/DDP細(xì)胞株過(guò)表達(dá)Fn14后細(xì)胞凋亡的變化

Fn14是由129個(gè)氨基酸構(gòu)成的Ⅰ型跨膜蛋白，胞漿區(qū)中包含有腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF）的結(jié)合序列，當(dāng)配體與Fn14結(jié)合后，通過(guò)TRAF活化激活核因子κB（NF-κB）、胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶（ERK）、P38絲裂原活化蛋白激酶（p38MARK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號(hào)通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞的遷徙和侵襲能力、促進(jìn)腫瘤血管生成、參與炎癥反應(yīng)等一系列生物學(xué)行為［9］。研究顯示，F(xiàn)n14在不同的腫瘤中發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)不盡相同，其可通過(guò)激活ERK信號(hào)通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移［10］；可促進(jìn)HER2和heregulin β1依賴的乳腺癌細(xì)胞的遷徙和侵襲［11］；而在子宮內(nèi)膜癌中，F(xiàn)n14則通過(guò)活化caspase通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［12］；Fn14·TRAIL融合蛋白可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)［13］。Fn14在腫瘤耐藥中也發(fā)揮重要作用，Kwon等［7］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n14通過(guò)激活NF-κB通路介導(dǎo)胃癌對(duì)5-氟尿嘧啶耐藥的發(fā)生；Li等［8］同樣發(fā)現(xiàn)Fn14通過(guò)激活NF-κB通路導(dǎo)致小細(xì)胞肺癌對(duì)化療藥物的耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)在人EOC細(xì)胞株SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP中A2780/DDP細(xì)胞Fn14蛋白表達(dá)水平最低，繼而在A2780/DDP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Fn14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞IC50明顯降低，增加細(xì)胞DDP敏感度，這與在胃癌、非小細(xì)胞肺癌中Fn14促進(jìn)腫瘤耐藥不同。因Fn14不影響細(xì)胞增殖能力，所以Fn14增強(qiáng)DDP對(duì) EOC細(xì)胞株增殖的抑制作用不是細(xì)胞增殖能力減弱所致，進(jìn)一步證明Fn14可以提高A2780/DDP細(xì)胞的DDP敏感度，在卵巢癌細(xì)胞鉑類耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

圖5 A2780/DDP細(xì)胞株過(guò)表達(dá)Fn14后，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化

細(xì)胞凋亡是凋亡蛋白和凋亡抑制蛋白（IAP）共同調(diào)控下發(fā)生的一種主動(dòng)的細(xì)胞自殺行為。DDP等經(jīng)典的抗腫瘤藥物通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，然而細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)如抗凋亡基因過(guò)表達(dá)或促凋亡基因丟失，可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，故細(xì)胞凋亡異常與EOC的DDP化療耐藥密切相關(guān)［14-15］。caspase是凋亡蛋白酶家族，通過(guò)選擇性地剪切其底物蛋白完成自我活化和相互激活過(guò)程，最終通過(guò)下游效應(yīng)分子caspase-3活化觸發(fā)細(xì)胞凋亡。當(dāng)caspase功能受到抑制時(shí)，機(jī)體細(xì)胞凋亡障礙，進(jìn)而誘使EOC的發(fā)生和進(jìn)一步進(jìn)展［16］。Bcl-2是凋亡抑制因子，主要通過(guò)抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C來(lái)抑制細(xì)胞通過(guò)線粒體途徑發(fā)生凋亡。研究表明，當(dāng)EOC細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)增多，細(xì)胞凋亡減少，DDP耐藥性增加［17］。本研究發(fā)現(xiàn)A2780/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染Fn14過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，可以促進(jìn)DDP誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞數(shù)目增多，同時(shí)促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3蛋白的活化和抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)一步提示Fn14可能通過(guò)活化凋亡通路促進(jìn)A2780/DDP細(xì)胞凋亡，進(jìn)而提高A2780/DDP對(duì)DDP的敏感度。

綜上所述，本研究探索了Fn14與EOC細(xì)胞耐藥的關(guān)系，首次發(fā)現(xiàn)了Fn14可能通過(guò)活化凋亡增強(qiáng)人EOC細(xì)胞株對(duì)DDP的敏感度，為臨床開創(chuàng)有效逆轉(zhuǎn)EOC鉑類耐藥的治療新途徑提供了理論基礎(chǔ)。

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Fn14 Enhances Cisplatin Sensitivity in Human Epithelial Ovarian Cancer Cells by Regulating Apoptosis

WU An-yue，QIU Li-hua.Department of Obstetrics and Gynecology，Shanghai Key Laboratory of Gynecology Oncology，Renji Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200127，China

QIU Li-hua，E-mail:lilyqiulh@126.com

Objective:To investigate the effects of Fn14 on regulating cisplatin（DDP）sensitivity in human ovarian cancer cells.Methods:Fn14 protein expression levels in SKOV3，CAOV3，OVCAR3，ES2，3AO，A2780 and A2780/DDP were detected through Western blotting.The expression of Fn14，caspase-3，cleaved caspase-3 and Bcl-2 were accessed by Western blotting in lowest expression of Fn14 cell line when transfected with Fn14 plasmid.The half cell lethal dose（IC50）of DDP and the ability of proliferation in A2780/DDP cells were assayed by CCK-8 kit.The ratio of apoptosis in A2780/DDP cells were determined by flow cytometry.Results:A2780/DDP cells exhibited the lowest expression of Fn14 in these cell lines.Fn14 transfer had no effect on the proliferation of A2780/DDP cells，whereas it could reduce the IC50 of DDP in A2780/DDP cells（P＜0.05）.When Fn14 was transferred，the apoptosis induced by DDP was increased in A2780/DDP cells，meanwhile，the expression of apoptosiscorrelated protein caspase-3 was up-regulated and anti-apoptotic protein Bcl-2 was down-regulated（P＜0.05）.Conclusions: Fn14 may increase chemosensitivity to DDP by apoptosis pathway in human epithelial ovarian cancer cells.

Ovarian neoplasms；Fn14；Cisplatin；Drug resistance，neoplasm；Apoptosis

2015-12-10）

［本文編輯 王昕］

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81272884）

200127上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海市婦科腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

邱麗華，E-mail：lilyqiulh@126.com