席曉敏，張和平*（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

微生物代謝組學(xué)研究及應(yīng)用進(jìn)展

席曉敏，張和平*
（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，微生物代謝組學(xué)這一新興領(lǐng)域已受到廣泛的關(guān)注，它不僅提供了代謝途徑的廣闊圖譜，而且還闡明了微生物與宿主之間的相互作用機(jī)制。本文主要闡述了微生物代謝組學(xué)研究過(guò)程中樣品制備、代謝物分析鑒定以及數(shù)據(jù)分析等主要研究方法，介紹了微生物代謝組學(xué)在乳酸菌、腸道菌群、病原菌以及食品和營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究領(lǐng)域中的研究進(jìn)展及其應(yīng)用，并討論了微生物代謝組學(xué)中的主要問(wèn)題和發(fā)展趨勢(shì)。

微生物；代謝組學(xué)；研究方法；應(yīng)用

代謝組學(xué)是對(duì)某一生物或生物系統(tǒng)內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定性和定量分析的一門科學(xué)，能夠?yàn)槿藗冞M(jìn)一步了解相關(guān)代謝途徑及其變化提供關(guān)鍵的信息。代謝組學(xué)源自代謝組一詞，代謝組（metabolome）是指一個(gè)生物或細(xì)胞在一特定生理時(shí)期內(nèi)所有低分子質(zhì)量代謝物的集合（包括代謝中間產(chǎn)物、激素、信號(hào)分子和次生代謝產(chǎn)物），它是細(xì)胞變化和表型之間相互聯(lián)系的核心，直接反映了細(xì)胞的生理狀態(tài)[1-2]。

由于微生物在生物體系中的重要性，代謝組學(xué)技術(shù)在微生物研究領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注。1992年 Elmroth等[3]首次進(jìn)行了微生物代謝組學(xué)研究，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)檢測(cè)了脂肪酸、氨基酸和糖類物質(zhì)以評(píng)估腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）在培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌污染情況。目前，微生物代謝組學(xué)已被廣泛應(yīng)用于不同的研究領(lǐng)域，如微生物的鑒定及誘變育種、功能基因研究、代謝工程和發(fā)酵工程等。本文就微生物代謝組學(xué)的研究方法及其研究進(jìn)展進(jìn)行概述，以期進(jìn)一步推動(dòng)微生物代謝組學(xué)的應(yīng)用。

1 微生物代謝組學(xué)的研究過(guò)程

精確、靈敏、高通量的研究方法是微生物代謝組學(xué)研究的基礎(chǔ)。微生物代謝組學(xué)的研究過(guò)程通常包括樣品制備、信號(hào)獲取、數(shù)據(jù)處理分析和生物學(xué)解釋。

1.1 樣品制備

為了獲得有意義的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，微生物代謝組學(xué)研究需要采用合適的樣品制備步驟，包括快速取樣，淬滅以及代謝物的提取。

快速取樣不僅能夠防止底物濃度發(fā)生巨大變化而且有助于維持微生物代謝物的穩(wěn)定性，因此許多簡(jiǎn)單的樣品采集裝置應(yīng)運(yùn)而生，如BioScope裝置[4]和fast swinnex fi ltration（FSF）裝置[5]等，均可實(shí)現(xiàn)樣品的快速采集。

為了保證特定時(shí)間內(nèi)樣品的真實(shí)信息，通常需要迅速對(duì)樣品進(jìn)行淬滅以終止代謝反應(yīng)，理想的淬滅技術(shù)應(yīng)快速淬滅酶活力并且保持細(xì)胞或生物的完整性。然而很多猝滅方法，如有機(jī)溶劑猝滅等方法會(huì)破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜導(dǎo)致胞內(nèi)代謝物大量的滲漏。目前，Wang Xiyue等[6]采用流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)了不同猝滅方法引起的細(xì)胞膜破壞程度，研究發(fā)現(xiàn)－80 ℃的生理鹽水猝滅大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）僅導(dǎo)致6%的細(xì)胞膜受損，僅僅是常規(guī)甲醇猝滅引起細(xì)胞膜破壞的1/10，減少了代謝物的滲漏?？焖龠^(guò)濾也是目前減少代謝物滲漏的有效方法之一，Kim等[7]通過(guò)分析釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的110 種胞內(nèi)代謝物比較了體積分?jǐn)?shù)60%的甲醇、－40 ℃純甲醇、體積分?jǐn)?shù)75%沸騰的乙醇和快速過(guò)濾4 種淬滅方法，表明快速過(guò)濾法能夠很大程度上減少代謝物的損失。

代謝物的提取是微生物代謝組學(xué)研究的重要步驟，目前，常用的代謝物提取方法有冷甲醇、熱甲醇、高氯酸或堿、氯仿-甲醇混合液以及乙腈等。Kim[8]通過(guò)GC-MS分析比較了7 種E. coli代謝物提取方法，結(jié)果表明丁醇中添加銨和乙醇是最有效的提取方法，共檢測(cè)到289 種物質(zhì)。然而，由于代謝物的多樣性，通常很難通過(guò)單一的一種提取方法提取全部胞內(nèi)代謝物，因此結(jié)合不同的方法有利于提高代謝物提取效果。

1.2 代謝物的檢測(cè)、分析及鑒定

代謝物的檢測(cè)、分析及鑒定是代謝組學(xué)研究的核心部分。質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術(shù)是兩種應(yīng)用于微生物代謝組學(xué)研究的主要平臺(tái)。

1.2.1 質(zhì)譜

質(zhì)譜技術(shù)具有高特異性和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，廣泛的應(yīng)用于微生物代謝組學(xué)分析。其中，GC-MS是發(fā)展較為成熟的分析平臺(tái)，也是最早用于微生物代謝組學(xué)研究的分析方法。GC-MS能夠同時(shí)對(duì)幾百種化合物（包括有機(jī)酸、氨基酸、糖類、糖醇、芳香胺和脂肪酸等）進(jìn)行分析，且配有標(biāo)準(zhǔn)的代謝物譜庫(kù)，可以快速準(zhǔn)確對(duì)代謝物進(jìn)行定性分析，但需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理。Villas-B?as[9]和Khoomrung[10]等進(jìn)行了很多基于GC-MS的微生物代謝組學(xué)的研究，他們采用氯甲酸酯衍生處理獲得了不同絲狀真菌產(chǎn)生的氨基酸圖譜，采用微波衍生化法分析了酵母樣品中的脂肪酸。二維GC-MS技術(shù)顯著提高了復(fù)雜樣品的分離效果和檢測(cè)的靈敏度，有效的應(yīng)用于微生物代謝組學(xué)。Bean等[11]應(yīng)用全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC×GC-time-of-fight-MS，GC×GC-TOFMS）分析了銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）培養(yǎng)基頂空的揮發(fā)性代謝物圖譜，共鑒定了28 種新的揮發(fā)性物質(zhì)，包括醇類、醛類、酮類、功能性苯類以及芳香分子，檢測(cè)數(shù)量提高了1 倍。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatograph-mass spectrometry，LC-MS）技術(shù)是另一個(gè)重要的分析平臺(tái)，適用于不穩(wěn)定、難揮發(fā)和非極性化合物的分析，不需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理。親水作用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（hydrophilic interaction liquid chromatography-MS，HILIC-MS）技術(shù)是一種高通量的胞內(nèi)代謝組學(xué)分析技術(shù)，能同時(shí)對(duì)極性和非極性代謝物進(jìn)行分析，其數(shù)據(jù)采集和分析速度是常規(guī)方法的兩倍，F(xiàn)an Fei等[12]采用HILIC-MS技術(shù)獲得了苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）代謝提取物中92.2%的可檢測(cè)的極性和脂類代謝物。Coulier等[13]研發(fā)了一種離子色譜-電噴霧質(zhì)譜（ion-pair-LC coupled to electrospray-ionization MS，IP-LC-ESI-MS）技術(shù)，該技術(shù)能夠同時(shí)對(duì)幾類極性代謝物，如核酸、輔酶A酯、糖核苷酸和二磷酸糖等進(jìn)行定量分析，是一種有效的微生物代謝物定量分析平臺(tái)。雖然LC-MS已被應(yīng)用于許多研究中，但是基于LC-MS的微生物代謝組學(xué)研究仍存在一些問(wèn)題，如培養(yǎng)基中的高鹽濃度會(huì)抑制ESI的離子化效率、阻塞泵，最終影響定量分析的有效性和重復(fù)性。毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（capillary electrophoresis- mass spectrometry，CE-MS）技術(shù)具有分析迅速、樣品需要量少、試劑消耗少和相對(duì)便宜等優(yōu)點(diǎn)。Soga等[14]早在2003年利用CE-MS分析了1 692 種從枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中提取的代謝物，鑒定了其中的150 種，并且對(duì)核苷、乙酰輔酶A、陽(yáng)離子代謝物和陰離子代謝物分別采用了不同的CE-MS平臺(tái)進(jìn)行了分析，為了解B. subtilis孢子形成過(guò)程中代謝物的變化提供了圖譜。2007年Soga等[15]又采用壓力輔助毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（pressure-assisted capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry，PACE-MS）分析了E. coli的pfkA和pfkB缺陷菌株胞內(nèi)核苷和輔酶A等代謝物，推斷出pfkA是E. coli的主要酶蛋白。

1.2.2 核磁共振

核磁共振技術(shù)能快速準(zhǔn)確的對(duì)樣品進(jìn)行高通量分析，且無(wú)損傷性，是鑒定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的重要分析技術(shù)，能夠提供一定條件下生物組織或體液的完整代謝圖譜，在微生物代謝組學(xué)的研究中有著廣闊的應(yīng)用前景。Son等[16]運(yùn)用1H NMR技術(shù)監(jiān)測(cè)了不同釀酒酵母作用下白酒發(fā)酵過(guò)程中代謝物的變化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)酵母菌株發(fā)酵特性的評(píng)價(jià)。Boroujerdi等[17]使用NMR分別檢測(cè)了27 ℃（劇毒型）和24 ℃（無(wú)毒型）培養(yǎng)溫度下的溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）的胞內(nèi)代謝物，并結(jié)合主成分分析（principal components analysis，PCA）發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)溫度的Vibrio coralliilyticus在PC1、PC2以及PC3主成分下顯著分離，且隨溫度升高，甜菜堿減少，琥珀酸和谷氨酸增加。但是由于微生物胞內(nèi)代謝物的組成較復(fù)雜，包括有機(jī)酸、疏水物質(zhì)以及復(fù)雜的天然產(chǎn)物，分子濃度變化跨越了好幾個(gè)數(shù)量級(jí)（從pmol到mmol），而NMR靈敏度較低，很難同時(shí)檢測(cè)到生物體系中共存的濃度相差較大的代謝物，一定程度上限制了它在微生物代謝組學(xué)中的應(yīng)用。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)分析是代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需要對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，消除干擾因素。數(shù)據(jù)處理一般包括基線校正、特征檢測(cè)、濾噪、峰對(duì)齊、標(biāo)準(zhǔn)化和歸一化等步驟。目前，已經(jīng)有大量軟件能將MS獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理轉(zhuǎn)化為二維數(shù)據(jù)表格，如MZmine[18]、XCMS[19]和METIDEA[20]等軟件。許多儀器公司也開(kāi)發(fā)了他們自己的專有軟件，如MarkerLynx（Waters）、Progenesis QI（Waters）、MassProfiler（Agilent）、MarkerView（Applied Biosystems/MDS SCIEX）和SIEVE（Thermo Fisher Scientifi c）等。

預(yù)處理后的數(shù)據(jù)需要進(jìn)行PCA和偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）等多元統(tǒng)計(jì)分析和生物信息學(xué)分析，從中獲得潛在的有效信息，找出生物標(biāo)志物及代謝途徑等。表1列出了一些具有代表性的（微生物）代謝組學(xué)研究相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)[21-23]，能夠有效地進(jìn)行生物標(biāo)志物的鑒定。代謝途徑分析不僅有助于了解代謝物之間的相互作用，而且能夠探索基因表達(dá)數(shù)據(jù)以完成功能基因組學(xué)的研究。

表1 （微生物）代謝組學(xué)研究相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)Table 1 Relevant database for (microbial) metabolomics

2 微生物代謝組學(xué)的研究進(jìn)展及應(yīng)用

微生物代謝組學(xué)是結(jié)合了生物信息學(xué)和系統(tǒng)微生物學(xué)的一門學(xué)科，它不僅有助于探索各物種之間的相互關(guān)系而且是微生物演化和發(fā)展動(dòng)力學(xué)研究的可靠分析工具[24-25]。本文將從以下四個(gè)方面闡述微生物代謝組學(xué)的最新研究進(jìn)展及應(yīng)用。

2.1 微生物代謝組學(xué)在乳酸菌研究領(lǐng)域中的應(yīng)用

近幾年，微生物代謝組學(xué)在乳酸菌研究領(lǐng)域取得了很大進(jìn)展和突破，比如菌株的篩選和鑒定、代謝途徑分析、發(fā)酵工程以及益生效果等方面。

傳統(tǒng)的乳酸菌分類主要通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察以及生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行表型分類。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因型分類方法如微生物全基因組測(cè)序、16S rDNA序列分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）指紋圖譜以及DNA雜交技術(shù)等得到了廣泛的應(yīng)用。然而，某些菌株的基因型和表型不一致，會(huì)得到不一樣的分類結(jié)果。代謝輪廓分析能夠通過(guò)比較胞外代謝物特征峰來(lái)區(qū)別和鑒定不同的菌種或菌株，逐漸成為了一種有效、快速、高通量的方法。熊萍等[26]基于1H-NMR代謝組學(xué)方法對(duì)變異鏈球菌、血鏈球菌和嗜酸乳桿菌的細(xì)胞外代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，證實(shí)了代謝組學(xué)方法能夠檢測(cè)不同菌株的差別，在微生物鑒定中有良好的應(yīng)用前景。Samelis等[27]采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transformed infra-red，F(xiàn)TIR）方法獲得了傳統(tǒng)希臘Graviera奶酪中乳酸菌胞外代謝物的紅外光譜圖，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)比較實(shí)現(xiàn)了乳酸菌的鑒定。Du?ková等[28]比較了PCR、16S-擴(kuò)增核糖體DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（16S-amplified rDNA restriction analysis，16S-ARDRA）以及基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption-ionization timeof-fl ight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術(shù)對(duì)乳酸菌的鑒定能力，結(jié)果表明在種的水平上MALDI-TOF-MS更具有優(yōu)勢(shì)，且準(zhǔn)確率達(dá)到93%。

微生物代謝組學(xué)也被廣泛地應(yīng)用于監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中組分和菌相變化以及評(píng)定發(fā)酵食品的感官和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。le Boucher等[29]以MS技術(shù)為基礎(chǔ)，利用代謝組學(xué)技術(shù)獲得了干酪生產(chǎn)過(guò)程中不同時(shí)間的代謝指紋圖譜，有效的確定了發(fā)酵過(guò)程中代謝組的變化，實(shí)現(xiàn)了干酪生產(chǎn)監(jiān)控。Jung等[30]采用高通量測(cè)序技術(shù)和1H NMR技術(shù)對(duì)韓國(guó)泡菜（kimchi）發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群和代謝物的變化進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）作為發(fā)酵劑不僅會(huì)增加發(fā)酵過(guò)程中明串珠菌屬的比例、降低乳桿菌屬的比例而且縮短了發(fā)酵時(shí)間，產(chǎn)生更多的有機(jī)酸和甘露醇，這為kimchi的發(fā)酵調(diào)控提供了方向。Meiju是韓國(guó)的傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬，通常是由芽孢桿菌、曲霉菌和毛霉菌等發(fā)酵形成。Kang等[31]利用UPLC-Q-TOF MS技術(shù)揭示了Meiju發(fā)酵過(guò)程中的22 種標(biāo)志物，包括氨基酸、小肽、核酸、鳥(niǎo)氨酸循環(huán)中間體以及有機(jī)酸等，并構(gòu)建了Meiju發(fā)酵代謝途徑，為提高M(jìn)eiju產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)和品質(zhì)提供了理論參考。由此可見(jiàn)，通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)可以直接檢測(cè)到乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品中各組分的變化，為工藝優(yōu)化和品質(zhì)調(diào)控提供了有效的工具。

近年，乳酸菌對(duì)健康的作用受到了國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注，運(yùn)用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)以及代謝組學(xué)等方法探索其對(duì)腸道的影響已成為了研究的熱點(diǎn)。其中，代謝組學(xué)方法不僅能夠檢測(cè)到乳酸菌作用下腸道中代謝物變化而且能夠闡明益生菌代謝物對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的影響。Hong等[32]利用基于1H NMR的代謝組學(xué)技術(shù)評(píng)估了益生菌對(duì)結(jié)腸炎小鼠的影響，結(jié)果顯示益生菌處理的結(jié)腸炎小鼠糞便中短鏈脂肪酸（醋酸和丁酸）和谷氨酰胺水平升高，而三甲胺水平下降，表明益生菌對(duì)結(jié)腸炎具有有效的保護(hù)作用。之后，Hong等[33]又利用高分辨魔角旋轉(zhuǎn)（high resolution magic-angle spinning，HRMAS）-NMR技術(shù)評(píng)估了益生菌對(duì)腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）患者的影響，研究發(fā)現(xiàn)飲用2 個(gè)月含有乳桿菌和雙歧桿菌發(fā)酵乳的IBS患者血漿中葡萄糖、酪氨酸和乳酸濃度逐漸趨于正常，為探索益生菌對(duì)IBS的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了基礎(chǔ)。Shi Xue等[34]結(jié)合GC×GC-TOF-MS技術(shù)和多元統(tǒng)計(jì)分析指出鼠李糖乳桿菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG，LGGs）能有效調(diào)節(jié)酒精性脂肪肝小鼠模型的腸道菌群結(jié)構(gòu)和代謝從而改善宿主健康，研究發(fā)現(xiàn)灌服LGGs不僅能夠增加腸道中的長(zhǎng)鏈脂肪酸而且降低了肝中的脂肪酸含量并提高了肝中的氨基酸含量。因此，代謝組學(xué)是研究益生菌對(duì)宿主健康影響的有效工具，能夠提供益生菌作用下宿主菌群代謝反應(yīng)，為探尋調(diào)節(jié)機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

2.2 微生物代謝組學(xué)在腸道菌群研究中的應(yīng)用

人體內(nèi)微生物的數(shù)量遠(yuǎn)多于人體內(nèi)細(xì)胞數(shù)，其中腸道菌群是目前系統(tǒng)生物學(xué)和代謝組學(xué)研究的重點(diǎn)之一[35]。定殖在宿主腸道中的微生物是胃腸道生態(tài)系統(tǒng)的重要部分，其功能和代謝與宿主的健康和疾病密切相關(guān)，不僅能夠預(yù)防病原體的感染，而且能夠通過(guò)自身代謝為宿主提供能量、增強(qiáng)機(jī)體免疫力以及與宿主相互作用調(diào)節(jié)代謝表型等[36]。Martin等[37]采用多種技術(shù)研究了小鼠模型中腸道微生物與宿主的代謝相互作用，包括使用1H NMR技術(shù)對(duì)肝臟、血漿、尿液以及回腸內(nèi)容物進(jìn)行代謝輪廓分析，使用LC-MS對(duì)膽汁酸進(jìn)行靶向分析及使用GC技術(shù)對(duì)盲腸中脂肪酸指紋圖譜進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與普通小鼠相比，植入嬰兒腸道菌群的無(wú)菌小鼠回腸膽汁酸濃度和肝臟甘油三酯含量較高，而血漿脂蛋白水平降低，這些數(shù)據(jù)充分表明腸道微生物能夠調(diào)節(jié)腸道吸收以及能量的存儲(chǔ)和獲得。Wikoff等[38]采用基于MS的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)無(wú)菌小鼠和普通小鼠的血漿進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)腸道菌群對(duì)哺乳動(dòng)物血漿代謝物具有顯著的影響，如抗氧化劑3-吲哚丙酸僅存在于普通小鼠血漿中，但在無(wú)菌小鼠中殖入產(chǎn)芽孢梭狀芽孢桿菌（Clostridium sporogenes）后，血漿中也檢測(cè)到了3-吲哚丙酸，表明宿主3-吲哚丙酸的產(chǎn)生受腸道微生物區(qū)系的影響。Saric等[39]采用1H NMR技術(shù)比較人體、小鼠和大鼠的水溶性糞便代謝物，研究發(fā)現(xiàn)三者具有獨(dú)特的糞便代謝物圖譜，如β-丙氨酸僅存在于大鼠糞便中，而甘油和丙二酸鹽為人類糞便所特有，證實(shí)了不同胃腸道微生物對(duì)糞便代謝組具有顯著的影響。由此可見(jiàn)，微生物代謝組學(xué)技術(shù)可以直接檢測(cè)到腸道菌群變化下宿主代謝表型變化，為進(jìn)一步闡明腸道微生物與人體相互作用機(jī)制提供了新的研究策略和研究方法。

正常情況下，腸道菌群結(jié)構(gòu)對(duì)疾病的預(yù)防與控制有著重要的作用，但是腸道菌群失調(diào)以及微生物生物多樣性改變都會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生一系列的不利影響，導(dǎo)致各類胃腸道疾病、代謝疾病和免疫類疾病的發(fā)生。很多研究人員已經(jīng)運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)腸道菌群與宿主代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究以探尋腸道菌群對(duì)宿主健康和疾病的作用，并取得很多重要成果。Raman等[40]采用GC-MS和焦磷酸測(cè)序技術(shù)分析了非酒精性脂肪肝肥胖患者糞便樣品中揮發(fā)性代謝物及腸道菌群結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明非酒精性脂肪肝肥胖患者糞便中酯類物質(zhì)的增加與其腸道菌群結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。Ahmed等[41]使用GC-MS技術(shù)IBS、克羅恩病（crohn’s disease，CD）、潰瘍性結(jié)腸炎患者以及健康人群的糞便揮發(fā)性有機(jī)物（volatile organic metabolites，VOMs）進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，結(jié)果顯示IBS發(fā)生于短鏈脂肪酸、環(huán)乙酸和乙酸有關(guān)。Wang Zeneng等[42]基于代謝組學(xué)技術(shù)和無(wú)菌小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腸道菌群的磷脂酰膽堿代謝能夠促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生，并且腸道菌群在氧化三甲胺的產(chǎn)生以及泡沫細(xì)胞形成等方面起著重要作用。因此，采用微生物代謝組學(xué)技術(shù)分析腸道微生物和宿主共代謝對(duì)揭示腸道微生物的代謝功能及其對(duì)宿主健康和疾病的作用至關(guān)重要。

2.3 微生物代謝組學(xué)在病原菌研究中的應(yīng)用

目前，代謝組學(xué)技術(shù)已廣泛的應(yīng)用于病原菌研究領(lǐng)域，能夠?qū)Σ≡鄠€(gè)方面進(jìn)行詳細(xì)分析，這將快速促進(jìn)其發(fā)展。MS是真菌植物病原菌研究中最常用的代謝組學(xué)分析技術(shù)，廣泛用于分析病原菌的突變和次級(jí)代謝產(chǎn)物的檢測(cè)及篩選[43]。Tan等[44]通過(guò)GC-MS發(fā)現(xiàn)缺少Sch1基因的穎枯殼針孢（Stagonospora nodorum）突變菌株的次生代謝產(chǎn)物濃度是野生菌株的200 倍，并通過(guò)ESI-MS/MS確定該次生代謝產(chǎn)物是交鏈孢酚，為闡明Sch1基因的功能和作用奠定了理論基礎(chǔ)。Lowe等[45]采用GC-MS對(duì)小麥病原菌Stagonospora nodorum孢子形成過(guò)程中相關(guān)代謝物進(jìn)行了非靶向分析，研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖在孢子形成過(guò)程中起著重要的作用。

此外，微生物代謝組學(xué)也被應(yīng)用于病原菌感染引起的疾病診斷。目前，糞便中揮發(fā)性有機(jī)化合物的GC-MS分析揭示了代謝組學(xué)技術(shù)可用于區(qū)分不同病原菌引起的腹瀉，Probert等[46]研究發(fā)現(xiàn)艱難梭菌（Clostridium difficile）感染的腹瀉糞便中會(huì)檢測(cè)到呋喃，而糞便中十二烷酸鹽化合物的出現(xiàn)表明腹瀉是輪狀病毒（Rotavirus）感染所引起的，彎曲桿菌（Campylobacter）感染則會(huì)導(dǎo)致糞便中萜類物質(zhì)的增加，十二烷酸鹽化合物的減少和氨基化合物的增加是其他腸病毒感染的生物標(biāo)志物，該研究不僅為腹瀉病因的快速診斷提供了理論依據(jù)而且為不同腹瀉病原菌的鑒定提供了參考。還有一些研究表明一些揮發(fā)性物質(zhì)與真菌感染 宿主引起的病害密切相關(guān)。Cao Mingshu等[47]以感染內(nèi)生真菌（Neotyphodium lolii，N. lolii）的黑麥草和未感染N.lolii的黑麥草的3 塊不同組織（不成熟的葉片、葉片和葉鞘）為研究對(duì)象，使用LC-MS研究了其代謝物，揭示了感染N. lolii的黑麥草中存在甘露醇和波胺。這些研究結(jié)果充分說(shuō)明微生物代謝組學(xué)不僅能夠通過(guò)病原菌分泌的代謝物實(shí)現(xiàn)菌種的鑒定，而且是病原菌感染診斷的有效工具。

2.4 微生物代謝組學(xué)在食品和營(yíng)養(yǎng)學(xué)中的應(yīng)用

多年來(lái)，食品安全一直都受到各國(guó)政府和人民的重視。微生物降解食品產(chǎn)生的病原體、毒素以及副產(chǎn)品都與食品安全問(wèn)題有著密切的關(guān)系。因此，監(jiān)測(cè)這些相關(guān)代謝物對(duì)于食品安全非常重要。微生物代謝組學(xué)為食品安全評(píng)價(jià)提供了新策略，已成功地應(yīng)用于食品中的有毒物質(zhì)的檢測(cè)，如采用GC-MS技術(shù)研究與特定微生物污染有關(guān)的揮發(fā)性代謝物的指紋圖譜，使用LC-MS 和NMR技術(shù)檢測(cè)食品中微生物毒素等。Qian Mingrong等[48]形成一套可靠的三重串聯(lián)四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，GCQqQ MS）分析方法，用于檢測(cè)食用植物油中鐮刀菌產(chǎn)生的玉米烯酮等毒素。Ediage等[49]采用LC-MS/MS實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同高粱品種中23 種真菌毒素的檢測(cè)和定量分析。

另外，微生物代謝組學(xué)也被應(yīng)用于評(píng)估營(yíng)養(yǎng)素缺乏與過(guò)量對(duì)機(jī)體代謝平衡的影響，更精確地監(jiān)測(cè)飲食對(duì)機(jī)體的影響，減少混雜因素如年齡、性別、生理狀態(tài)和生活方式等的干擾[50]。Ibá?ez等[51]采用CE、反相/超高效液相色譜（reverse phase /ultra-performance liquid chromatography，RP/UPLC）和HILIC/UPLC-TOF-MS聯(lián)用技術(shù)揭示了飲食中多酚類物質(zhì)對(duì)人體結(jié)腸癌HT29細(xì)胞抗增生具有顯著的影響，通過(guò)使用非靶向代謝分析方法發(fā)現(xiàn)多酚物質(zhì)處理后抗氧化劑谷胱甘肽比率上升，且維持細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)基因表達(dá)的多胺類物質(zhì)出現(xiàn)了表達(dá)差異，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，這為預(yù)防和治療結(jié)腸癌提供了理論依據(jù)。Wang Yulan等[52]使用基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)監(jiān)測(cè)了正常小狗和飲食限制小狗的尿液代謝圖譜，結(jié)果表明飲食限制能夠改變小狗腸道微生物活性，主要表現(xiàn)在飲食限制小狗的尿液中芳香族代謝物和肌酸/肌酐以及醋酸化合物濃度增加，而研究表明這些化合物都與腸道菌群密切相關(guān)。Merrifield等[53]通過(guò)對(duì)小豬尿液1H NMR代謝圖譜分析證實(shí)了不同的斷奶飲食會(huì)產(chǎn)生不同的代謝表型，進(jìn)而導(dǎo)致腸道菌群與宿主代謝物發(fā)生變化。另外，他們還發(fā)現(xiàn)與lgA和lgM相關(guān)的腸道黏膜產(chǎn)物是由斷奶飲食過(guò)程中雙歧桿菌NCC2818的攝入產(chǎn)生的，為評(píng)估黏膜免疫狀態(tài)提供的新的研究策略。這些研究結(jié)果充分說(shuō)明微生物代謝組學(xué)能快速有效地對(duì)動(dòng)物機(jī)體健康、疾病預(yù)測(cè)和診斷做出全面的評(píng)估，更深入地了解營(yíng)養(yǎng)與機(jī)體代謝的相互作用。

3 結(jié) 語(yǔ)

綜上所述，代謝組學(xué)已廣泛地用于微生物學(xué)研究，為微生物學(xué)研究提供了全面系統(tǒng)的分析手段。而且，隨著樣品制備方法的不斷完善以及分析技術(shù)的快速發(fā)展，微生物代謝組學(xué)在過(guò)去的20 a里取得了重大進(jìn)展，不僅能用于微生物代謝過(guò)程中生物標(biāo)志物的研究，為發(fā)酵工藝監(jiān)測(cè)、安全性檢測(cè)以及病原菌感染診斷提供全面有效的評(píng)估方法，還能用于腸道菌群與宿主代謝機(jī)制研究，為預(yù)防和治療代謝疾病提供理論依據(jù)。但是，微生物代謝組學(xué)仍然存在一些問(wèn)題亟待解決：缺乏標(biāo)準(zhǔn)的代謝物淬滅和提取方法；目前微生物代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)主要局限于特定微生物，主要是酵母和大腸桿菌，缺乏囊括不同微生物代謝數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，尤其是針對(duì)細(xì)菌和真菌的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)；目前微生物代謝組學(xué)研究很大程度上僅僅關(guān)注代謝物本身而忽略了它們的來(lái)源。例如，來(lái)自宿主和微生物代謝的葡萄糖雖然化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)上是完全相同的，但它們的生物學(xué)意義及參與的代謝通路卻使得它們的調(diào)控不徑相同。

與代謝組學(xué)在藥物研發(fā)、疾病診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用以及植物代謝組學(xué)相比，微生物代謝組學(xué)研究仍處于發(fā)展初期。然而，微生物代謝組學(xué)研究存在很多優(yōu)勢(shì)，比如微生物系統(tǒng)簡(jiǎn)單，基因數(shù)據(jù)豐富以及微生物生理特征了解全面等。同時(shí)，將微生物代謝組學(xué)與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及蛋白組學(xué)等相整合，能夠深入的研究代謝途徑、調(diào)控反應(yīng)以及體內(nèi)平衡機(jī)制，幫助人們更系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)生物體。綜上所述，微生物代謝組學(xué)作為快速發(fā)展的新型研究領(lǐng)域，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分和技術(shù)平臺(tái)，促進(jìn)了系統(tǒng)微生物學(xué)的發(fā)展。

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Progress in Microbial Metabolomics and Its Application

XI Xiaomin，ZHANG Heping*
(Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering, Ministry of Education, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China)

Metabolomics is a significant research field of system biology with unique advantages. Recently, microbial metabolomics has gained much attention. It not only offers a broad picture of metabolic pathways, but also elaborates the mechanisms of the interaction between microbes and their hosts. This article summarizes the major methods involved in the research process of microbial metabolomics, including sampling preparation, analysis, metabolite identification and data analysis. Besides, this review also introduces the development and application of microbial metabolomics in research on lactic acid bacteria, the gut microbiota, pathogens, food science and nutrition. Moreover, we discuss the major issues and future trends in microbial metabolomics.

microbe; metabolomics; analytical methods; application

10.7506/spkx1002-6630-201611049

TS201.3

A

1002-6630（2016）11-0283-07

席曉敏, 張和平. 微生物代謝組學(xué)研究及應(yīng)用進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 283-289. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611049. http://www.spkx.net.cn

XI Xiaomin, ZHANG Heping. Progress in microbial metabolomics and its application[J]. Food Science, 2016, 37(11): 283-289. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611049. http://www.spkx.net.cn

2015-09-10

席曉敏（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠飞锛夹g(shù)與加工工程。E-mail：xxmhzau@126.com

*通信作者：張和平（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槿槠飞锛夹g(shù)與工藝學(xué)。E-mail：hepingdd@vip.sina.com