楊明坤　林小煌，　馬炎炎，　王　炎，　葛　峰

（1. 中國科學(xué)院水生生物研究所，藻類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072； 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

藍(lán)藻的蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究進(jìn)展

楊明坤1林小煌1，2馬炎炎1，2王炎1，2葛峰1

（1. 中國科學(xué)院水生生物研究所，藻類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072； 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統(tǒng)幾乎參與了細(xì)胞所有的正常生命活動過程，并發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。目前，基于生物質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后修飾的規(guī)?；治鲨b定，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心內(nèi)容之一。近年來的研究表明，藍(lán)藻細(xì)胞中存在著復(fù)雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統(tǒng)，如磷酸化，乙?；谆?，糖基化，氧化等，這些翻譯后修飾在藍(lán)藻細(xì)胞的代謝過程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本文主要針對藍(lán)藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯后修飾的發(fā)現(xiàn)與鑒定，以及翻譯后修飾潛在的生物學(xué)功能展開簡要綜述。

藍(lán)藻；蛋白質(zhì)組學(xué)；翻譯后修飾

藍(lán)藻（Cyanobacteria），具有革蘭氏陰性細(xì)菌相似的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞內(nèi)含有大量葉綠素a和藻藍(lán)素使得細(xì)胞呈藍(lán)綠色，因此，藍(lán)藻又被稱為藍(lán)細(xì)菌或藍(lán)綠藻。藍(lán)藻在地球上分布廣泛，是最早出現(xiàn)的光合放氧生物，對地球表面從無氧環(huán)境變?yōu)橛醒醯拇髿猸h(huán)境發(fā)揮了關(guān)鍵性作用［1］。藍(lán)藻結(jié)構(gòu)簡單，沒有分化真正意義上的細(xì)胞核、線粒體、葉綠體等細(xì)胞器，卻具有類似于真核藻類和高等植物的光合作用系統(tǒng)，能夠進(jìn)行光解水放氧。藍(lán)藻還具有固氮，氫代謝以及基于光合作用生［2］產(chǎn)生物燃料的能力，同時(shí)，在遺傳學(xué)上又具有操作性強(qiáng)，構(gòu)建突變體簡單且周期短等優(yōu)點(diǎn)，藍(lán)藻已經(jīng)成為研究光合作用和生物能源的重要模式生物之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)藻細(xì)胞中存在多種不同類型的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，且這些修飾在藍(lán)藻細(xì)胞的代謝過程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。本文針對藍(lán)藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯后修飾的分析鑒定及其潛在的生物學(xué)功能展開簡要綜述，將有助于深入了解藍(lán)藻的生長以及對環(huán)境變化的適應(yīng)等，可為研究光合作用與開發(fā)藻類生物能源提供重要的理論依據(jù)。

1　蛋白質(zhì)翻譯后修飾

蛋白質(zhì)是執(zhí)行細(xì)胞功能的基本單元，其表達(dá)受基因組，表觀遺傳學(xué)和翻譯后修飾等多個(gè)層次的調(diào)控。其中蛋白質(zhì)翻譯后修飾作為蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)的一種重要方式，在調(diào)控不同生物體的眾多生物學(xué)過程中都發(fā)揮著重要的作用［2，3］。它通過在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基加上修飾基團(tuán)，可以改變蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、活性狀態(tài)、亞細(xì)胞定位以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等。翻譯后修飾使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，功能更為完善，調(diào)節(jié)更為精細(xì)，作用更為專一。據(jù)估計(jì)，人體內(nèi)50%—90%的蛋白質(zhì)發(fā)生了不同類型的翻譯后修飾，包括肽鏈骨架的剪接，特定氨基酸側(cè)鏈上添加新的基團(tuán)以及對已有基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾等［4］。目前，記錄在冊的翻譯后修飾達(dá)到幾千種（http：//www. unimod.org/modifications_list.php？）（http：//www. abrf.org/index.cfm/dm.home），仍有新的翻譯后修飾不斷被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的專業(yè)數(shù)據(jù)庫PhosphoSitePlus（http：//www.phosphosite.org）統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，研究較多的蛋白質(zhì)翻譯后修飾包括磷酸化、乙?；⒓谆?、糖基化和泛素化等［5］。由于蛋白質(zhì)翻譯后修飾發(fā)生在轉(zhuǎn)錄之后，因此基因組學(xué)方法無法實(shí)現(xiàn)翻譯后修飾類型以及結(jié)構(gòu)的檢測。

近年來，隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步和高效分離方法的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為蛋白質(zhì)翻譯后修飾的系統(tǒng)分析提供了前所未有的發(fā)展契機(jī)，由此也派生出一門新的學(xué)科：修飾蛋白質(zhì)組學(xué)［2，6］，它主要利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)對修飾蛋白質(zhì)及其位點(diǎn)進(jìn)行規(guī)模化分析鑒定，對修飾結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)以及對不同生理狀態(tài)下翻譯后修飾的變化情況進(jìn)行定量分析。然而，大多數(shù)發(fā)生翻譯后修飾的蛋白質(zhì)通常具有豐度低、動態(tài)范圍寬以及結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn)； 同時(shí)，翻譯后修飾存在“時(shí)空特異性”，即蛋白質(zhì)的修飾類型與修飾程度隨生物生存環(huán)境及內(nèi)在狀態(tài)的變化會表現(xiàn)出極大的差別，有的修飾甚至是轉(zhuǎn)瞬即逝的，所以，蛋白質(zhì)翻譯后修飾的程度以及其生物學(xué)功能的挖掘還存在著極大的空間，對蛋白質(zhì)翻譯后修飾進(jìn)行規(guī)模化分析也面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

2　藍(lán)藻的蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)翻譯后修飾，如磷酸化，乙?；谆?，糖基化，生物素化，氧化等，可能參與藍(lán)藻的脅迫響應(yīng)，能量代謝以及光合作用等一系列的細(xì)胞進(jìn)程； 甚至在藍(lán)藻的次級代謝產(chǎn)物中（如各種多肽），也發(fā)現(xiàn)存在糖基化，甲基化，酰基化等修飾，這些修飾可能具有調(diào)控次級代謝產(chǎn)物的功能，從而在抗菌、抗癌以及免疫活性抑制等方面發(fā)揮重要作用［7］。然而，目前對于藍(lán)藻蛋白質(zhì)翻譯后修飾的功能研究仍然較少，尤其是翻譯后修飾在藍(lán)藻細(xì)胞中的分子調(diào)控機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的深入研究，以下將對目前藍(lán)藻細(xì)胞中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究進(jìn)展進(jìn)行討論。

2.1磷酸化修飾

藍(lán)藻能夠耐受高低溫、紫外線輻射、干旱和鹽等脅迫，其細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)起了非常重要的調(diào)控作用。它能夠使藍(lán)藻非常迅速的感受外界環(huán)境的信號變化，通過調(diào)控基因的表達(dá)，使細(xì)胞對外界環(huán)境作出積極快速的響應(yīng)，從而使藍(lán)藻在各種極端環(huán)境中得以生存下來。目前，藍(lán)藻的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)主要有二元信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，類似于真核的絲氨酸/蘇氨酸激酶系統(tǒng)（Serine/threonine protein kinase，STK）以及近年來發(fā)現(xiàn)的酪氨酸激酶/磷酸酶（Tyrosine kinase/tyrosine phosphatase）系統(tǒng)［8］。隨著藍(lán)藻全基因組測序工作的完成，藍(lán)藻細(xì)胞中磷酸化修飾介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)也受到越來越多的關(guān)注。通過基因組分析發(fā)現(xiàn)，在集胞藻PCC 6803和聚球藻PCC 7002中均含有12個(gè)預(yù)測的STK序列，集胞藻PCC 6803含有7個(gè)相關(guān)的磷酸酶，聚球藻PCC 7002中含有6個(gè)相關(guān)的磷酸酶［9—11］，而在魚腥藻PCC 7120中則含有多達(dá)52個(gè)預(yù)測的STK序列和12個(gè)相關(guān)的磷酸酶［12］。此外，還在藍(lán)藻中發(fā)現(xiàn)有少量預(yù)測的酪氨酸激酶/磷酸酶序列［8］。這些激酶/磷酸酶介導(dǎo)的可逆磷酸化修飾系統(tǒng)，在細(xì)胞感受外界刺激以及作出適應(yīng)的應(yīng)答過程中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用［13］。發(fā)現(xiàn)并鑒定這些激酶/磷酸酶的作用底物以及驗(yàn)證其在信號網(wǎng)絡(luò)中的作用，將有助于更加深入全面的理解磷酸化修飾介導(dǎo)的藍(lán)藻信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。

早在1984年，Schuster等［14］就運(yùn)用32P標(biāo)記技術(shù)，首次在藻細(xì)胞Calothrix sp. PCC 7601中發(fā)現(xiàn)了磷酸化修飾蛋白質(zhì)。基于該方法，在Synechococcas sp. PCC 6301［15］，Anabaena sp. PCC 7120［16］，Synechocystis sp. PCC 6803［17，18］，Synecbococcus sp. PCC 7942［19］等藻株中均鑒定到磷酸化修飾蛋白質(zhì)的存在。進(jìn)一步研究表明，藻膽蛋白復(fù)合物磷酸化修飾有助于藻膽體的組裝，而在高光與缺氮條件下，藻膽蛋白復(fù)合物會發(fā)生去磷酸化修飾，從而導(dǎo)致藻膽體發(fā)生解聚，使細(xì)胞免受光損傷［20，21］。研究發(fā)現(xiàn)，KaiC蛋白則可以通過自磷酸化與去磷酸作用調(diào)控其自身活性，從而調(diào)節(jié)藍(lán)藻細(xì)胞的生物鐘［22］。此外，磷酸化修飾還可能參與了藍(lán)藻的碳源/氮源利用調(diào)控，高光適應(yīng)，狀態(tài)轉(zhuǎn)換以及鹽脅迫等一系列的過程［8，20］。雖然在藍(lán)藻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些磷酸化蛋白可能參與多種代謝調(diào)控途徑，但仍然只有較少的磷酸化蛋白被鑒定，且具體的磷酸化修飾位點(diǎn)也仍然未知，這嚴(yán)重阻礙了藍(lán)藻細(xì)胞中磷酸化修飾的分子調(diào)控作用機(jī)制的研究。

隨著修飾蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的日趨成熟，使利用高通量質(zhì)譜技術(shù)鑒定藍(lán)藻細(xì)胞中磷酸化修飾蛋白及其位點(diǎn)成為可能。作者首次利用目前比較成熟的磷酸化肽段富集技術(shù)-TiO2富集技術(shù)，對一株極端耐鹽、耐高光的模式藍(lán)藻-聚球藻PCC 7002進(jìn)行磷酸化肽段富集，并結(jié)合高通量質(zhì)譜技術(shù)，鑒定到245個(gè)磷酸化蛋白，其中較多磷酸化蛋白參與了二元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及光合作用通路，包括光合系統(tǒng)Ⅰ，光合系統(tǒng)Ⅱ，藻膽體以及細(xì)胞色素復(fù)合物等［23］。而在另一株模式藍(lán)藻中-集胞藻PCC 6803，同樣鑒定到較多的磷酸化蛋白。Mikkat等［24］首次結(jié)合雙向電泳技術(shù)與MALDI-TOF MS/MS質(zhì)譜技術(shù)，從高鹽和低鹽培養(yǎng)的集胞藻PCC 6803中鑒定到32個(gè)磷酸化蛋白。由于磷酸化蛋白及其修飾位點(diǎn)鑒定數(shù)目仍然較少，Sp?t等［25］則結(jié)合磷酸化肽段富集與高通量質(zhì)譜技術(shù)，系統(tǒng)地分析了集胞藻PCC 6803中的磷酸化蛋白，共鑒定到202個(gè)磷酸化蛋白，并通過二甲基化定量標(biāo)記方法，對藻細(xì)胞在缺氮條件下的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了分析，最終定量到了2111個(gè)蛋白，其中包含148個(gè)磷酸化蛋白； 研究結(jié)果顯示，藻細(xì)胞缺氮條件處理24h后，細(xì)胞內(nèi)磷酸化修飾水平顯著提高，包括PII信號蛋白，碳/氮代謝途徑以及光合作用途徑中的相關(guān)蛋白，表明磷酸化修飾在藻細(xì)胞應(yīng)對環(huán)境刺激方面具有重要的調(diào)控作用。同年，Lee等［26］也報(bào)道了集胞藻PCC 6803中的磷酸化蛋白，不同的是，該研究對膜蛋白的磷酸化修飾進(jìn)行了分析，共鑒定到33個(gè)磷酸化蛋白，其中11個(gè)為具有跨膜結(jié)構(gòu)的磷酸化膜蛋白。作者通過對集胞藻PCC 6803中磷酸化蛋白研究發(fā)現(xiàn)，較多蛋白參與了能量代謝與光合作用途徑，進(jìn)一步功能研究顯示，磷酸化修飾參與調(diào)控了藍(lán)藻的光能吸收與傳遞過程［27］。

磷酸化修飾作為一種快速的應(yīng)激調(diào)控方式，在調(diào)控藍(lán)藻細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境脅迫方面起著重要作用。越來越多磷酸化蛋白及其修飾位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，將為全面深入研究磷酸化修飾調(diào)控藍(lán)藻細(xì)胞脅迫響應(yīng)的分子作用機(jī)制提供新的理論依據(jù)與研究思路。

2.2乙?；揎?/p>

蛋白質(zhì)的賴氨酸乙酰化修飾與磷酸化修飾一樣，在生物體內(nèi)廣泛存在，是一種可逆、保守且高度調(diào)控的翻譯后修飾，參與調(diào)控代謝、轉(zhuǎn)錄活性、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、信號通路及病原微生物的感染等眾多重要的生理功能［28—30］。乙酰化修飾能夠中和蛋白分子帶正電荷的賴氨酸殘基，從而改變蛋白的物理、化學(xué)性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對蛋白功能的調(diào)節(jié)［31，32］。最初的研究主要集中在染色體組蛋白的乙?；揎椛希苤泻徒M蛋白賴氨酸殘基的正電荷，使其與DNA 的結(jié)合松散而利于基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控基因表達(dá)水平［33］。因此，乙酰化修飾對表觀遺傳學(xué)有著深遠(yuǎn)影響。近年來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)很多非組蛋白也可進(jìn)行乙?；揎椪{(diào)節(jié)，由此開拓出以非組蛋白為底物的蛋白質(zhì)乙酰化修飾研究領(lǐng)域。隨后的研究表明，細(xì)胞內(nèi)幾乎所有的代謝酶都可以被乙?；揎棧撔揎棌V泛參與到整個(gè)細(xì)胞最基礎(chǔ)的生命代謝活動中，對細(xì)胞內(nèi)的各類代謝通路進(jìn)行精確的調(diào)節(jié)與控制（圖1）［34，35］。

圖1　乙?；揎棌V泛調(diào)控細(xì)胞代謝過程［35］Fig. 1　Acetylation regulation of metabolic processes

在原核生物中，最早由Zhang等［36］利用乙?；亩胃患夹g(shù)，結(jié)合高通量的nano-HPLC/MS/MS技術(shù)，在大腸桿菌中首次大規(guī)模鑒定到91個(gè)乙酰化蛋白。高通量乙酰化蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)鍵就在于乙?；亩胃患夹g(shù)，通常只有親和性較高的泛乙?；揎椏贵w，才能有效的富集到細(xì)胞中含量較低的乙?；揎楇亩巍Ｓ捎诟哔|(zhì)量抗體的缺乏，嚴(yán)重阻礙了乙酰化蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展。2013年，Zhang等［37］改進(jìn)了乙?；揎椏贵w的制備策略，獲得了高效的乙?；揎椏贵w，最終在大腸桿菌中鑒定到了349個(gè)乙?；鞍椎?070個(gè)乙?；揎椢稽c(diǎn)。之后，在枯草芽孢桿菌［38］，鼠傷寒沙門氏菌［39］，熾熱芽孢桿菌［40］以及結(jié)核分枝桿菌［41］等一系列原核生物中，均鑒定到較多乙?；鞍准捌湫揎椢稽c(diǎn)。隨著更多乙?；鞍椎蔫b定，該修飾的調(diào)控作用也逐漸被揭示，其中最主要的作用就是參與代謝調(diào)控，如糖酵解，TCA循環(huán)，磷酸戊糖途徑、氨基酸代謝以及脂肪酸代謝等。研究發(fā)現(xiàn)，乙酰化修飾甚至可以調(diào)控致病相關(guān)蛋白的免疫原性，影響病原菌的致病性。這些研究揭示了乙?；揎椩谡{(diào)控能量代謝過程以及影響病原菌致病性等方面的重要作用。

在藍(lán)藻的光合系統(tǒng)復(fù)合物中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)鐵硫蛋白Pet，細(xì)胞色素蛋白PsbF以及光系統(tǒng)Ⅱ蛋白PsbJ都存在乙?；揎棧?2，43］。此外，在藍(lán)藻的次級代謝產(chǎn)物中，同樣發(fā)現(xiàn)部分肽段或是藻毒素被乙?；揎棧?4—46］。作者結(jié)合乙?；亩胃患c高通量nano-HPLC/MS/MS技術(shù)，首次系統(tǒng)地分析了藍(lán)藻細(xì)胞中的乙?；揎椝剑诩錚CC 6803中鑒定到513個(gè)乙酰化蛋白及其776個(gè)修飾位點(diǎn)，生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，大多數(shù)乙?；鞍讌⑴c了藻細(xì)胞的能量代謝過程，并首次發(fā)現(xiàn)了31個(gè)被乙?；揎椀墓夂献饔孟嚓P(guān)蛋白與16個(gè)碳固定途徑相關(guān)蛋白，該研究揭示了乙?；揎椏赡軈⑴c調(diào)控藍(lán)藻的光合作用途徑［47］。在另外一株藍(lán)藻-聚球藻PCC 7002中，作者同樣鑒定到較多乙?；鞍?，進(jìn)一步的功能研究結(jié)果顯示，可逆的乙酰化修飾不僅能夠調(diào)控光能吸收與傳遞效率，還能通過影響光合作用相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響光合作用復(fù)合物的組裝，顯著降低光合作用效率（未發(fā)表）。綜上結(jié)果，乙?；揎棽粌H能夠調(diào)控代謝酶活性，還能通過改變蛋白結(jié)構(gòu)，影響蛋白的功能，從而參與藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)的光合作用調(diào)控過程。

蛋白質(zhì)乙?；c去乙?；揎検且环N精細(xì)的調(diào)節(jié)過程，由乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙?；笇Φ鞍踪|(zhì)賴氨酸上的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行乙?；腿ヒ阴；揎?，從而改變蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，對細(xì)胞內(nèi)眾多代謝相關(guān)通路進(jìn)行精確的調(diào)節(jié)與控制。隨著蛋白質(zhì)乙?；揎椦芯康纳钊耄鋮⑴c調(diào)控的代謝途徑及其重要性也倍受關(guān)注。在真核生物中，乙酰轉(zhuǎn)移酶與去乙?；傅墓δ苎芯枯^多，兩種酶介導(dǎo)的乙酰化和去乙?；磻?yīng)，能夠影響細(xì)胞的多種代謝網(wǎng)絡(luò)［48—51］。在原核生物中，Starai等［52］在沙門氏菌中首次發(fā)現(xiàn)了乙酰轉(zhuǎn)移酶（Protein acetyltransferase，簡稱Pat），它能夠調(diào)節(jié)中心代謝酶-乙酰輔酶A合成酶活性，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)。而具有去乙?；富钚缘牡鞍證obB（NAD+-dependent deacetylase，簡稱CobB）最早被用于ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的功能研究［53］。2002年，Starai等［54］在鼠傷寒沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)乙酰輔酶A合成酶的609位賴氨酸殘基的乙?；籆obB去掉后，能夠激活其酶活性，從而首次報(bào)道了原核生物的去乙?；?。隨后以Pat、CobB作為乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙?；刚归_了一系列的研究，揭示了兩種酶催化底物的作用機(jī)制［55—57］。作者通過比對分析發(fā)現(xiàn)，在聚球藻PCC 7002中含有16個(gè)預(yù)測的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因以及4個(gè)去乙?；富?，在集胞藻PCC 6803中也含有10個(gè)預(yù)測的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因以及2個(gè)去乙酰化酶基因，這些乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙?；缚赡芡ㄟ^改變底物蛋白的乙?；揎椝?，從而對代謝以及光合作用途徑進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。然而，迄今為止，在藍(lán)藻中還未見到乙酰轉(zhuǎn)移酶和去乙?；傅南嚓P(guān)研究報(bào)道，其所催化的底物蛋白在光合代謝中的調(diào)控機(jī)理也還沒有被揭示，均有待于進(jìn)一步的深入研究。

2.3其他修飾類型

在藍(lán)藻細(xì)胞中，還存在許多其他不同種類的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，對藻細(xì)胞的生長，代謝等過程進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，如氧化修飾，糖基化修飾等。

光合生物能夠適應(yīng)光合放氧與呼吸作用所產(chǎn)生的活性氧，主要依賴于其胞內(nèi)復(fù)雜的抗氧化防御系統(tǒng)，而在大多數(shù)生物中，還原型谷胱甘肽介導(dǎo)的抗氧化起著具有非常重要的作用［58］。谷胱甘肽通過巰基與蛋白中半胱氨酸的自由巰基結(jié)合，形成蛋白的谷胱甘肽修飾［59，60］，當(dāng)細(xì)胞受到氧化脅迫或亞硝化脅迫時(shí)，可逆的谷胱甘肽修飾能夠起到保護(hù)蛋白以及調(diào)控蛋白活性的作用［59，61］。在聚球藻PCC 6803中，也發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽修飾能夠調(diào)控蛋白活性［62，63］。Chardonnet等［64］就利用高通量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，在集胞藻PCC 6803中發(fā)現(xiàn)了383個(gè)谷胱甘肽修飾的蛋白質(zhì)，這些蛋白廣泛參了到碳/氮代謝，細(xì)胞分裂，脅迫響應(yīng)以及H2代謝等過程。除了谷胱甘肽修飾，在蛋白的半胱氨酸上還存在其他重要的翻譯后修飾，如巰基氧化修飾，Guo等［65］通過化學(xué)方法標(biāo)記已發(fā)生氧化修飾的半胱氨酸，再針對標(biāo)記的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行特異性的富集，最終，鑒定并定量到1350個(gè)半胱氨酸的巰基氧化修飾。

糖基化修飾也是較早被發(fā)現(xiàn)的翻譯后修飾之一，一直認(rèn)為只有真核生物中才存在，直到在嗜鹽桿菌Halobacterium salinarium的膜組分中也發(fā)現(xiàn)糖基化修飾［66］，該修飾在原核生物（尤其是病原菌）中的作用也相繼被揭示，而糖基化修飾的蛋白大多數(shù)屬于纖毛蛋白，在調(diào)控細(xì)胞毒力以及細(xì)菌與宿主細(xì)胞黏著方面起著重要作用［67—71］。2004年，Kim等［72］首次在藍(lán)藻中發(fā)現(xiàn)了纖毛蛋白可能存在不同類型的翻譯后修飾，這些修飾可能影響到纖毛的組裝，其中就包括纖毛蛋白中的O連接的糖基化修飾，該修飾可能與藻細(xì)胞的趨向運(yùn)動有關(guān)［73］。此外，Kim等［74］還發(fā)現(xiàn)了另外一種重要纖毛蛋白修飾-三甲基化修飾，他們利用超高分辨率質(zhì)譜（FTICR）MS，成功鑒定到纖毛蛋白PiliA的三甲基化修飾以及二甲基化、單甲基化修飾。已知三甲基化修飾（ΔM=42.0106 Da）是一種分子量與乙酰化修飾（ΔM=42.0470 Da）非常接近的翻譯后修飾，對于分辨率較低的質(zhì)譜，往往無法區(qū)分0.03 Da的誤差。Kim等［74］不僅鑒定到纖毛蛋白三甲基化修飾，還通過修飾位點(diǎn)的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，三甲基化修飾能夠通過調(diào)控纖毛蛋白的功能，進(jìn)而影響細(xì)胞的趨向運(yùn)動。

此外，在藍(lán)藻細(xì)胞中，還發(fā)現(xiàn)存在甲基化［75，76］、過硫化［77，78］、ADP-核糖基化［79］、脂酰基化［80］、異戊二烯化［81］、棕櫚?；?2］等不同的翻譯后修飾，這些修飾可能在藍(lán)藻細(xì)胞的代謝與光合作用等過程中可能發(fā)揮著不同的調(diào)控作用。

3　藍(lán)藻蛋白質(zhì)翻譯后修飾的大規(guī)模發(fā)現(xiàn)

圖2　蛋白質(zhì)翻譯后修飾分析策略Fig. 2　Strategies of proteomic analysis of post-translational modifications

雖然利用高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些不同類型的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，但由于修飾蛋白質(zhì)的不均一性以及相對豐度低的特性，使得蛋白質(zhì)翻譯后修飾的大規(guī)模分析鑒定仍存在困難。目前，對復(fù)雜生物樣品中修飾蛋白質(zhì)和肽段主要采用選擇性富集的策略，來實(shí)現(xiàn)修飾蛋白質(zhì)組學(xué)的規(guī)?；b定（圖2），如技術(shù)路線最成熟的富集策略-基于TiO2等化學(xué)材料富集的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和基于乙?；揎椏贵w富集的乙?；鞍踪|(zhì)組學(xué)。然而，還存在許多不同類型的翻譯后修飾并沒有很好的富集策略，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模鑒定。作者研究團(tuán)隊(duì)利用近年來興起的一個(gè)新的技術(shù)手段-蛋白質(zhì)基因組學(xué)（蛋基組學(xué)，Proteogenomics）技術(shù)，不經(jīng)過樣品富集，在聚球藻PCC 7002中，首次大規(guī)模鑒定到23種不同的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。

蛋基組學(xué)，就是利用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，結(jié)合基因組與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對基因組進(jìn)行注釋。最先由Jaffe等［83］于2004年首次提出，作者采用高通量質(zhì)譜數(shù)據(jù)匹配基因組直接翻譯得到蛋白序列的方法，在僅有810 kb大小的細(xì)菌基因組上直接鑒定開放閱讀框（open reading frame，ORF），通過此方法，作者對原有基因組信息進(jìn)行了驗(yàn)證與補(bǔ)充，并修訂了約10%的ORF。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)手段日益成熟，高靈敏度、高精度的質(zhì)譜儀使得完全覆蓋蛋白質(zhì)組也成為可能，如人類蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中84%的蛋白已被鑒定到［84，85］，因此，蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)不僅可以實(shí)現(xiàn)對基因組序列的重新注釋、發(fā)現(xiàn)新基因，還能系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)特有的翻譯后事件（如翻譯后修飾和信號肽等）。

作者利用蛋基組學(xué)方法，對集胞藻PCC 7002進(jìn)行了基因組的重注釋以及翻譯后修飾的大規(guī)模鑒定。收集了不同生長時(shí)期與代謝狀態(tài)的藻細(xì)胞，提取總蛋白并分離出膜組分與胞漿組分，采用Trypsin/ Glu-C蛋白酶進(jìn)行酶切以獲得較高覆蓋度的肽段序列； 再利用C18填料的固相萃取柱或陽離子交換柱對獲得的肽段進(jìn)行分離，降低肽段的復(fù)雜程度； 最后使用超高分辨率的質(zhì)譜LTQ-Orbitrap Elite對肽段進(jìn)行分析。雖然樣品中翻譯后修飾蛋白豐度較低，但采用了多重方法對樣品進(jìn)行了處理，很大程度降低了樣品的復(fù)雜程度，即使在未經(jīng)過任何形式的翻譯后修飾富集的情況下，仍能鑒定到較多翻譯后修飾蛋白質(zhì)。利用非限制性檢索算法-即數(shù)據(jù)庫檢索時(shí)不設(shè)定任何修飾類型，對樣品中的翻譯后修飾進(jìn)行非限制性檢索，主要采用非限制性蛋白質(zhì)翻譯后修飾檢索引擎-MODa（MODaification via alignment）對樣品進(jìn)行分析，最終鑒定到690個(gè)蛋白含有不同的翻譯后修飾。為了更精確定位翻譯后修飾及其對應(yīng)的修飾位點(diǎn)，采用了MaxQuant算法，對感興趣的翻譯后修飾進(jìn)一步驗(yàn)證，最終大規(guī)模鑒定到了23種不同的翻譯后修飾，其中絕大多數(shù)修飾是首次在藍(lán)藻中發(fā)現(xiàn)。進(jìn)一步研究表明，參與藍(lán)藻光合作用的大多數(shù)蛋白具有復(fù)雜的翻譯后修飾，在不同的生長和處理?xiàng)l件下會發(fā)生動態(tài)變化，提示這些修飾在光合系統(tǒng)中起著重要的調(diào)控作用（圖3）［86］。

4　結(jié)論與展望

研究藍(lán)藻中蛋白質(zhì)翻譯后修飾的種類、結(jié)構(gòu)、機(jī)制以及生物學(xué)功能，將使我們對藍(lán)藻蛋白質(zhì)各種特性有進(jìn)一步的了解，并為我們?nèi)嫔钊肜斫馑{(lán)藻細(xì)胞生命活動的調(diào)控機(jī)制提供必要的信息。然而，蛋白質(zhì)翻譯后修飾的大規(guī)模發(fā)現(xiàn)及其功能研究仍存在較多挑戰(zhàn)，如新發(fā)現(xiàn)的蛋白翻譯后修飾的富集鑒定方法，翻譯后修飾的定量分析以及翻譯后修飾的生物學(xué)功能等問題都是該領(lǐng)域目前遇到的且亟待解決的難題。

為了解新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾在全細(xì)胞水平的修飾狀態(tài)，往往需要借助高通量蛋白質(zhì)組學(xué)手段實(shí)現(xiàn)其大規(guī)模鑒定，而這其中最重要的關(guān)鍵技術(shù)就是富集策略，目前大多采用的富集策略是用相應(yīng)的泛抗體進(jìn)行富集。對于不同類型的翻譯后修飾，如何選擇合適的富集方法以及對應(yīng)的富集策略，將直接影響修飾蛋白及其位點(diǎn)的鑒定。

在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)的修飾種類不僅繁多，還具有可逆性以及時(shí)空特異性等特點(diǎn)，使蛋白質(zhì)的修飾成為一個(gè)動態(tài)變化的過程，因此，對不同生長、分化以及代謝狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)修飾水平的定量具有重要的意義。目前，已有的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)手段主要分為兩類，一類是穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法，另一類是非標(biāo)記定量方法。穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)相對定量的經(jīng)典方法，樣品在穩(wěn)定同位素標(biāo)記后、質(zhì)譜分析前混合，一次分析實(shí)現(xiàn)差異定量，有效消除了色譜和質(zhì)譜分析過程中的不穩(wěn)定性，最大程度減小了定量誤差。常見的標(biāo)記方法分為體內(nèi)標(biāo)記方法，如SILAC與15N標(biāo)記。Mann等［87］采用同位素標(biāo)記的甲硫氨酸標(biāo)記細(xì)胞中的甲基基團(tuán)，首次實(shí)現(xiàn)了甲基化翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)規(guī)模上的定量分析； SILAC技術(shù)同樣可以用于磷酸化與乙?；揎椀鞍捉M學(xué)的規(guī)模化定量分析［29，88，89］； 由于SILAC標(biāo)記方法只適用于不能自我合成氨基酸的哺乳動物細(xì)胞株，所以對于大多數(shù)原核生物并不適用，而15N標(biāo)記則不受此限制［90，91］，并在藍(lán)藻中得到了很好的應(yīng)用［92—94］，因此該標(biāo)記技術(shù)用于藍(lán)藻翻譯后修飾定量具有廣闊的前景。而體外標(biāo)記方法，如二甲基標(biāo)記［95］、TMT標(biāo)記［96］以及iTRAQ標(biāo)記［97］等，幾乎全部標(biāo)記賴氨酸的活性氨基，對于許多賴氨酸上的翻譯后修飾，體外標(biāo)記卻并不適用。另一類重要的定量技術(shù)——非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，則不需要任何昂貴的標(biāo)記試劑與復(fù)雜繁瑣的樣品處理過程，所以適合所有類型細(xì)胞的翻譯后修飾定量，如基于蛋白變性膠的非標(biāo)記定量磷酸化蛋白組與非標(biāo)記定量乙酰化蛋白組等［50，98］以及基于超高通量質(zhì)譜的SWATH非標(biāo)記定量方法［99］。但是，非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)仍然不夠成熟，一方面是對nano-LC-MS/MS有很大的依賴性，需要實(shí)驗(yàn)具有較高的重現(xiàn)性； 另一方面不論是常規(guī)的基于一級質(zhì)譜的定量方法，還是最新建立的基于二級質(zhì)譜的SWATH定量方法，對于后續(xù)數(shù)據(jù)處理過程中肽段定量的算法仍有待于進(jìn)一步提高，才能更準(zhǔn)確的定量肽段以及蛋白。從長遠(yuǎn)來看，相比于標(biāo)記定量技術(shù)，非標(biāo)記定量方法仍具有更大的優(yōu)勢和前景，而對于藍(lán)藻的翻譯后修飾定量組學(xué)，非標(biāo)記定量方法則更為適用。

圖3　藍(lán)藻Synechococcus sp. PCC 7002光合作用系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾［86］Fig. 3　Post-translational modification events involved in the photosynthesis in Synechococcus sp. PCC 7002

蛋白質(zhì)翻譯后修飾往往不是孤立存在的，同一生理或病理過程的發(fā)生，需要各種修飾的蛋白質(zhì)共同作用，同一個(gè)蛋白質(zhì)又可以同時(shí)擁有一種以上的蛋白質(zhì)修飾，彼此之間相互影響、相互協(xié)調(diào)。單純的單一蛋白質(zhì)、單一修飾的研究難以闡明代謝調(diào)控機(jī)制，只有運(yùn)用組學(xué)手段對不同狀態(tài)下的蛋白質(zhì)修飾動態(tài)網(wǎng)絡(luò)研究，才能更好的闡明不同翻譯后修飾的功能以及修飾之間的相互調(diào)控。在藍(lán)藻的光合作用途徑中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多蛋白具有不同類型的翻譯后修飾，如磷酸化、乙?；⒓谆鹊龋▓D3）；而不同翻譯后修飾之間相互影響，對蛋白功能進(jìn)行多重調(diào)控，在細(xì)胞的整個(gè)生命活動中具有非常重要的作用。不同翻譯后修飾對蛋白乃至整個(gè)細(xì)胞的功能而言，可以是協(xié)同或是相反的作用，而這種情況發(fā)生的一個(gè)重要基礎(chǔ)就是存在于各種蛋白質(zhì)翻譯后修飾之間的相互作用關(guān)系，因此，研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾之間相互調(diào)控作用關(guān)系，將有助于揭示藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后修飾介導(dǎo)的復(fù)雜的蛋白功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

基于高通量蛋白質(zhì)組學(xué)的翻譯后修飾鑒定數(shù)據(jù)正在快速增長，盡管這些數(shù)據(jù)證明了許多蛋白質(zhì)翻譯后修飾是普遍存在的現(xiàn)象，但并沒有揭示出修飾的功能。雖然，發(fā)現(xiàn)并鑒定新的翻譯后修飾對理解生物眾多生理功能具有十分重要的意義，但深入理解修飾在整個(gè)細(xì)胞中的調(diào)控作用機(jī)制則更能深入闡明翻譯后修飾的重要性。目前大多數(shù)基于高通量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定翻譯后修飾的研究，也都結(jié)合分子生物學(xué)或生物化學(xué)等技術(shù)手段，挑選若干重要的翻譯后修飾蛋白，試圖去解釋翻譯后修飾的調(diào)控作用。但相比于龐大的高通量數(shù)據(jù)，仍然只有很少翻譯后修飾位點(diǎn)的生物學(xué)功能被闡明，對于更多的修飾位點(diǎn)的功能，則只能通過推測討論或生物信息學(xué)分析獲得［100］。因此，細(xì)胞內(nèi)各種代謝通路中的翻譯后修飾作用具有怎么樣的調(diào)控功能，均有待于進(jìn)一步研究。

到目前為止，還沒有完整的實(shí)驗(yàn)證據(jù)揭示蛋白質(zhì)翻譯后修飾在藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)具有怎樣的調(diào)控功能。但可以預(yù)期的是，隨著藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)越來越多的蛋白質(zhì)翻譯后修飾被大規(guī)模發(fā)現(xiàn)，這些修飾在細(xì)胞的整個(gè)生命活動中的生物學(xué)功能也將被逐漸闡明，并將開辟出藍(lán)藻的蛋白質(zhì)翻譯后修飾組學(xué)這一新的研究領(lǐng)域。

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PROGRESS ON PROTEIN POST-TRANSLATIONAL MODIFICATION IN CYANOBACTERIA

YANG Ming-Kun1，LIN Xiao-Huang1，2，MA Yan-Yan1，2，WANG Yan1，2and GE Feng1
（1. Key Laboratory of Algal Biology，Institute of Hydrobiology，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430072，China； 2. University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

Post-translational modifications（PTMs） are vital cellular control mechanisms modulating diverse protein properties. Proteomic analysis of post-translational modifications based on the mass spectrometry has been the key research area. Recently，it has been shown that protein post-translational modifications，such as phosphorylation，acetylation，methylation，glycosylation and oxidation，play crucial regulatory role in various pathways of cyanobacteria. In the present article，we reviewed the recent progress on the functional studies of PTMs in cyanobacteria.

Cyanobacteria； Proteomics； Post translational modifications（PTMs）

Q344+.3

A

1000-3207（2016）05-1056-12

10.7541/2016.137

2015-08-28；

2016-01-11

國家自然科學(xué)基金（31570829）資助 ［Supported by the National Natural Science Foundation of China（31570829）］

楊明坤（1985—），男，湖北襄陽人； 碩士； 主要從事蛋白質(zhì)翻譯后修飾組學(xué)及其功能研究。E-mail：yangmingkun@ihb.ac.cn

葛峰（1971—），男，研究員； 研究方向?yàn)楣δ艿鞍踪|(zhì)組學(xué)。E-mail：gefeng@ihb.ac.cn