任鵬飛，邵科峰，張 潔，張紅琳，趙 波，*

（1.江蘇省生物醫(yī)藥功能材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省生物功能材料重點實驗室，南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211171）

基于寬譜特異性抗體的β2-激動劑多殘留電化學(xué)免疫傳感器的研制

任鵬飛1，邵科峰1，張 潔1，張紅琳2，趙 波1，*

（1.江蘇省生物醫(yī)藥功能材料協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省生物功能材料重點實驗室，南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211171）

制備了沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清蛋白偶聯(lián)物，并通過動物免疫獲得了抗沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清蛋白寬譜特異性抗體，同時制備了石墨烯-殼聚糖/沙丁胺醇修飾的電化學(xué)免疫傳感器，并采用循環(huán)伏安法和交流阻抗法對電極的電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。采用間接競爭法進(jìn)行了克倫特羅、沙丁胺醇和特布他林3 種β2-激動劑的同時檢測，檢出限依次為0.2、0.3 ng/mL和0.3 ng/mL，線性范圍依次為50～7 000、1～1 500 ng/mL和100～6 000 ng/mL。將傳感器應(yīng)用于豬瘦肉、豬脂肪和豬肝3 種實際量品中克倫特羅的加標(biāo)檢測，回收率為84.7%～106%。實現(xiàn)了β2-激動劑的高靈敏多殘留免疫檢測。

寬譜特異性抗體；β2-激動劑；多殘留；電化學(xué)免疫傳感器

任鵬飛， 邵科峰， 張潔， 等. 基于寬譜特異性抗體的β2-激動劑多殘留電化學(xué)免疫傳感器的研制［J］. 食品科學(xué)， 2016，37（8）: 236-241. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608043. http://www.spkx.net.cn

REN Pengfei， SHAO Kefeng， ZHANG Jie， et al. Development of a multi-residue electrochemical immunoassay based on broad-spectrum specific antibody for determination of β2-agonists［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 236-241. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201608043. http://www.spkx.net.cn

β2-激動劑類獸藥（俗稱“瘦肉精”）是目前動物源性食品中檢出率最高、危害最嚴(yán)重的化學(xué)性殘留危害物之一。β2-激動劑曾作為動物飼料的添加劑使用，旨在降低動物脂肪含量、提高蛋白質(zhì)含量。然而，當(dāng)人食用含有β2-激動劑的肉類后，會出現(xiàn)心悸、肌肉顫動、頭暈、乏力等異常情況。長期食用會增加染色體畸變的可能性并誘發(fā)惡性腫瘤［1-2］，因此我國和世界上大多數(shù)國家都規(guī)定在動物性食品中不得檢出，這就對分析方法的檢測靈敏度提出了非常高的要求。目前常用的檢測方法可分為色譜分析法［3-6］、電化學(xué)法［7-9］、免疫分析法［10-12］等?，F(xiàn)有檢測技術(shù)由于儀器具有局限性而不適合作為高通量快速篩選方法，因此能夠高通量、高靈敏檢測多種β2-激動劑的分析方法成為當(dāng)前該領(lǐng)域的急需。

電化學(xué)傳感器是一種快速、便捷且成本低廉的檢測技術(shù)；免疫分析法具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高和量品前處理簡單等優(yōu)點。電化學(xué)免疫傳感器［13-17］結(jié)合了電化學(xué)傳感器和免疫分析法的優(yōu)點，是目前較為先進(jìn)的一種檢測方法。石墨烯具有優(yōu)異的導(dǎo)電性能［18］，在電化學(xué)傳感器的研制中得到大量應(yīng)用［19-20］；殼聚糖含有大量羥基和氨基且具有良好的成膜性和生物相容性，常被用于固定生物大分子［21］；本實驗將石墨烯優(yōu)良的電化學(xué)性質(zhì)、殼聚糖良好的成膜性能以及寬譜特異性抗體相結(jié)合，研制出一種β2-激動劑多殘留電化學(xué)免疫傳感器，進(jìn)行了3 種激動劑（克倫特羅、沙丁胺醇和特布他林）的同時檢測，并對實際量品進(jìn)行了加標(biāo)檢測。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

豬肉實際量品購自南京市超市。

克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林（純度＞99%） 中國食品藥品檢定研究院；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所；抗沙丁胺醇-萊克多巴胺-牛血清蛋白偶聯(lián)物（salbutamol-ractopamine-bovine serum albumin conjugate，SAL-RAC-BSA）抗體 南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院；磷酸緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4）由0.1 mol/L的磷酸氫二鈉和0.1 mol/L的磷酸二氫鈉按一定比例配得；提取液由乙腈和丙酮（均為分析純）按1∶1的體積比配制；其他試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水。

FA-1004電子分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；KQ-50E超聲波清洗器 昆山超聲波儀器有限公司；PHS-3E pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；CHI 852C和660E電化學(xué)分析儀（配三電極體系：工作電極為玻碳電極，對電極為鉑電極，參比電極為Ag/AgCl電極） 上海辰華儀器有限公司；UV-1700PC紫外-可見分光光度計 上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司；H7650透射電子顯微鏡 日本日立公司；JSM-7600F高分辨熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社。

1.2方法

1.2.1石墨烯-殼聚糖分散液制備

采用改良的Hummers法［22-23］制備石墨烯；將石墨烯分散于殼聚糖溶液制得分散均勻的石墨烯-殼聚糖分散液［23］。

1.2.2石墨烯-殼聚糖/沙丁胺醇修飾的多殘留免疫傳感器的制備

電極拋光及處理：依次使用直徑為1.0、0.3 μm和0.05 μm的γ-氧化鋁粉將玻碳電極拋光至表面呈現(xiàn)鏡面光澤，用大量水沖洗，然后依次用無水乙醇：二次蒸餾水（1∶1，V/V）、二次蒸餾水清洗，室溫晾干。

取上述玻碳電極，在其表面滴涂4 μL制備好的石墨烯-殼聚糖分散液，再滴涂2 μL 0.2 g/L的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，在37 ℃烘箱中干燥30 min，使石墨烯-殼聚糖和沙丁胺醇完全固定于電極表面；然后將電極置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的BSA溶液中浸泡30 min，以封閉石墨烯-殼聚糖表面未被沙丁胺醇結(jié)合的活性位點，從而減少非特異性吸附；封閉完成后用pH 7.4的PBS沖洗電極，制得石墨烯-殼聚糖/沙丁胺醇修飾的電化學(xué)免疫傳感器。

1.2.3免疫傳感器的表征

采用紫外-可見吸收光譜法、循環(huán)伏安法和交流阻抗法對裸電極以及電極在修飾過程中的電化學(xué)性質(zhì)變化進(jìn)行了研究。紫外-可見吸收光譜的測定過程為：取干凈的石英玻片，模量在電極表面的修飾過程，在其表面滴涂600 μL的石墨烯-殼聚糖分散液，再滴涂300 μL 0.2 g/L的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（石墨烯-殼聚糖和標(biāo)準(zhǔn)溶液量的比例與電極修飾相同）。37 ℃烘箱中晾干，用干凈的刀片刮下置于蒸餾水中分散均勻后測得其吸收光譜。

所有電化學(xué)實驗均采用三電極系統(tǒng)（玻碳電極為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl電極為參比電極）在含有2 mmol/L K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］和0.1 mol/L KCl的PBS（pH 7.4）中進(jìn)行。循環(huán)伏安法掃描范圍為-0.2～0.8 V，掃描速率為100 mV/s；掃描頻率為0.01～106Hz，振幅為0.005 V，等待時間為2 s。

1.2.4反應(yīng)條件優(yōu)化

對免疫反應(yīng)的條件，包括免疫反應(yīng)時間和抗體用量進(jìn)行了優(yōu)化。孵育液中抗體量優(yōu)化：在50 μL孵育液中，分別加入不同體積的抗體，每次孵育30 min，完成后用PBS沖洗，測差分脈沖伏安法峰電流，至峰電流基本不變時停止。

孵育時間優(yōu)化：抗體量優(yōu)化完成后，在50 μL孵育液中，加入上述最佳體積的抗體，將傳感器置入其中進(jìn)行孵育，每5 min測一次DPV峰電流，至峰電流基本不變時停止。

1.2.5標(biāo)準(zhǔn)量品及實際量品檢測

將免疫傳感器浸于總體積為50 L的含有一系列質(zhì)量濃度的β2-激動劑標(biāo)準(zhǔn)量品和固定用量抗體的孵育液中，37 ℃烘箱中恒溫孵育。完成后，用PBS緩沖液沖洗電極表面，置于含有2 mmol/L K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］的PBS中，采用DPV測定電流變化與β2-激動劑質(zhì)量濃度的定量關(guān)系。

實際量品的加標(biāo)分析：分別稱?。?±0.005） g的豬瘦肉、豬脂肪和豬肝（均為經(jīng)過高效液相色譜法驗證過的陰性量品），每種實際量品各稱取3 份，加入定量的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液。完成后，每份加入3 mL提取液乙腈-丙酮（1∶1，V/V），超聲提取20 min，4 000 r/min離心5 min，取上層清液用氮氣吹干，濃縮物用PBS溶解并定容至1 mL，采用DPV測定克倫特羅質(zhì)量濃度。

2　結(jié)果與分析

2.1多殘留免疫傳感器原理

圖1　免疫傳感器的制備及檢測原理Fig.1 Schematic illustration forpreparation and application of the immunosensor

傳感器制備及免疫檢測原理如圖1所示，將制備完成的傳感器浸于孵育液中進(jìn)行孵育，電極上固定的沙丁胺醇與溶液中游離的β2-激動劑競爭結(jié)合溶液中的定量抗體（圖1B中1過程），測定DPV峰電流Ix；以不含有β2-激動劑只含有抗體的孵育液為空白（圖1B中2過程），測定DPV峰電流I0。隨著溶液中游離β2-激動劑質(zhì)量濃度的降低，與其結(jié)合的抗體相應(yīng)減少，則結(jié)合到電極表面的抗體相應(yīng)增加，對電子傳遞的阻礙隨之增強，因此DPV也隨之降低。將DPV峰電流之差值ΔI（ΔI=Ix-I0，Ix為量品檢測對應(yīng)峰電流；I0為空白檢測對應(yīng)峰電流）與β2-激動劑質(zhì)量濃度建立定量關(guān)系，線性量合后即可得到工作曲線。

2.2石墨烯的表征

圖2　石墨烯分別分散在水中（A1）和殼聚糖溶液（A2）中以及石墨烯-殼聚糖的透射電子顯微鏡（B）Fig.2 Dispersed graphene in water （A1） and chitosan （A2）， and transmission electron microscopic observation of graphenechitosan dispersion （B）

石墨烯在水和殼聚糖溶液中分散狀態(tài)如圖2A所示，分散于水中的石墨烯經(jīng)一段時間放置后即發(fā)生聚沉（圖2A1），分散于殼聚糖溶液中的石墨烯經(jīng)過較長時間后依然均勻分散（圖2A2），表明殼聚糖對石墨烯在水中的分散起著重要作用［24］。圖2B為分散于殼聚糖溶液中的石墨烯的透射電子顯微鏡照片，其中石墨烯片層狀結(jié)構(gòu)清晰可見，且片層以褶皺狀態(tài)存在并未完全鋪展開。褶皺可以降低單層石墨烯的表面能，增加其穩(wěn)定性，阻止形貌由二維向三維轉(zhuǎn)變，是二維石墨烯存在的必要條件［25］。圖2B顯示出分散在殼聚糖中的石墨烯并未發(fā)生較大程度的團(tuán)聚，表明殼聚糖對石墨烯具有很好的穩(wěn)定作用［26］，與圖1結(jié)論一致。

2.3免疫傳感器的表征

由圖3A可以看出，沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)溶液在223.6 nm和275.0 nm波長處有兩個特征吸收峰［27］，石墨烯-殼聚糖復(fù)合物在271.8 nm波長處有一個寬峰。石墨烯-殼聚糖/沙丁胺醇修飾層在223.6nm處出現(xiàn)一個“平臺狀”吸收峰，與沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收峰之一吻合完全，此外，該修飾層在273.4nm波長處出現(xiàn)的吸收峰應(yīng)為石墨烯-殼聚糖復(fù)合物（271.8 nm）與沙丁胺醇（275.0 nm）的疊加所形成，說明沙丁胺醇已經(jīng)成功修飾到電極上。

圖3B顯示處理干凈的裸電極有一對穩(wěn)定、明顯的［Fe（CN）6］3-/［Fe（CN）6］4-氧化還原可逆峰（曲線a）。電極經(jīng)過石墨烯-殼聚糖復(fù)合物修飾后，氧化還原電流響應(yīng)較裸電極有明顯的升高（曲線b），這是由于石墨烯具有優(yōu)異的導(dǎo)電性，大大加速了電極表面的電子傳遞。經(jīng)過沙丁胺醇修飾后，傳感器的電流響應(yīng)有微弱變化（曲線c），表明沙丁胺醇對電子傳遞速率的影響不大。傳感器經(jīng)過抗體孵育后，循環(huán)伏安法峰電流又有明顯下降（曲線d），這是由于抗體與電極表面的沙丁胺醇可以特異性結(jié)合而被吸附到電極上，對電子傳遞產(chǎn)生明顯阻礙作用。上述循環(huán)伏安法曲線也可以表明沙丁胺醇已被成功修飾到電極上。

圖3C為交流阻抗譜圖，圖中曲線半圓部分的直徑為電子從［Fe（CN）6］3-/［Fe（CN）6］4-轉(zhuǎn)移到電極表面的阻抗值（Ret），該數(shù)值由電極表面材料的導(dǎo)電性能決定。裸玻碳電極的阻抗值約126 Ω（曲線a）；經(jīng)石墨烯-殼聚糖修飾后，Ret幾乎為零（曲線b），表明電子在電極表面?zhèn)鬏敇O快，這得益于石墨烯材料極高的電子傳遞速率；沙丁胺醇修飾并經(jīng)過BSA封閉后電極阻抗值大約為600 Ω（曲線c）；抗體孵育后電極阻抗值大約為1600 Ω（曲線d）。由不同電極阻抗值可知，隨著沙丁胺醇、BSA的修飾以及抗體在電極表面的吸附，電極表面電子傳導(dǎo)的阻礙作用不斷增強，這也從另一個側(cè)面說明傳感器上材料修飾的成功。

圖3　電極修飾過程的紫外-可見吸收光譜（A）、循環(huán)伏安譜（B）和交流阻抗譜（C）圖Fig.3 Ultraviolet visible absorption spectra （A）， cyclic voltammetry spectrum （B） and electrochemical impedance spectrum （C） of the glassy carbon electrode during the modifying procedure

2.4反應(yīng)條件優(yōu)化

從圖4A可得，孵育液中抗體體積在1～5 μL范圍內(nèi)時，峰電流隨抗體量增加而下降；在抗體體積為7 μL時，峰電流略有升高。表明抗體量為5 μL時抗體結(jié)合基本達(dá)到飽和，傳感器檢測效果達(dá)到最佳。故抗體量選擇為5 μL。

圖4B顯示，孵育時間在5～30 min范圍內(nèi)時，峰電流隨孵育時間延長而下降；其后基本保持不變，表明當(dāng)孵育時間為30 min時抗體結(jié)合基本達(dá)到飽和，傳感器檢測效果達(dá)到最佳。故選擇30 min為最佳孵育時間。

圖4　免疫優(yōu)化反應(yīng)抗體量（A）和孵育時間（B）的優(yōu)化Fig.4 Optimization of immunoreaction conditions: antibody volume （A）and incubation time （B）

2.5β2-激動劑的多殘留檢測結(jié)果

在優(yōu)化的條件下，進(jìn)行β2-激動劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測，以峰電流差值ΔI與量品質(zhì)量濃度建立線性關(guān)系，然后進(jìn)行線性量合，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。

表1　石墨烯-殼聚糖/沙丁胺醇傳感器對沙丁胺醇、克倫特羅和特布他林的工作曲線Table 1 Standard curves for the detection of SAL， CL and TB

圖5　石墨烯-殼聚糖/沙丁胺醇修飾電極對沙丁胺醇（A）、克倫特羅（B）和特布他林（C）檢測的DPV檢測圖Fig.5 DPV spectra of reduced graphene oxide-chitosan composite/SAL modified electrode for the detection of SAL （A）， CL （B） and TB （C）

傳感器對3 種β2-激動劑檢測的DPV圖以及標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示，結(jié)果表明傳感器對克倫特羅、沙丁胺醇和特布他林的檢出限都較低，依次為0.2、0.3 ng/mL和0.3 ng/mL；線性相關(guān)系數(shù)除特布他林略低（R= 0.987）外，其余兩種都較高（R＞0.992），并且線性范圍都較寬。本實驗采用的寬譜特異性抗體為抗-SAL-RAC-BSA抗體，而沙丁胺醇與克倫特羅和特布他林都具有很大程度的相似結(jié)構(gòu)，所以抗-SAL-RAC-BSA抗體對克倫特羅和特布他林具有一定的交叉反應(yīng)性，因而能夠?qū)崿F(xiàn)上述3 種β2-激動劑的同時檢測。遺憾的是，該傳感器未能檢測萊克多巴胺，原因可能是在動物免疫時，SAL-RACBSA抗原中萊克多巴胺結(jié)構(gòu)部分未充分暴露于載體蛋白外部而喪失了其抗原決定簇的作用，導(dǎo)致獲得的抗-SALRAC-BSA抗體不能識別萊克多巴胺，從而最終影響了傳感器檢測效果。

2.6傳感器重復(fù)性和穩(wěn)定性

傳感器制備完成后連續(xù)測定20 次電流響應(yīng)，20 次結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，表明所制備的石墨烯/殼聚糖/沙丁胺醇傳感器具有良好的重復(fù)性。將制備好的傳感器保存于4℃冰箱中，每天測定3 次電流響應(yīng)，連續(xù)測定7 d，7 d測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，表明該傳感器在相對較長時間內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.7實際量品檢測結(jié)果

表2　石墨烯-殼聚糖/沙丁胺醇傳感器對實際樣品中克倫特羅的檢測結(jié)果Table 2 Analytical results for the determination of clenbuterol in real samples using graphene-chitosan/salbutamol sensor

表2為豬瘦肉、豬脂肪和豬肝3 種實際量品中加標(biāo)克倫特羅的檢測結(jié)果，3 種量品的回收率都在84.7%～106%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.7%～17.4%之間，表明傳感器對實際量品具有良好的檢測性。此外，豬瘦肉和豬脂肪的回收率稍差于豬肝，這可能是因為其中含有更大量的蛋白質(zhì)和油脂等成分，因此對結(jié)果影響較大。

3　結(jié) 論

本實驗制備了石墨烯-殼聚糖/沙丁胺醇修飾的電化學(xué)免疫傳感器。在最優(yōu)化條件下實現(xiàn)了對克倫特羅、沙丁胺醇和特布他林3 種β2-激動劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測，具有較低的檢出限（0.2～0.3 ng/mL）和較寬的線性范圍（依次為50～7 000、1～1 500 ng/mL和100～6 000 ng/mL）。將傳感器應(yīng)用于豬瘦肉等實際量品中克倫特羅的檢測，擁有滿意的回收率（84.7%～106%）和較小的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（3.7%～17.4%），對實際量品檢測效果良好。

［1］ 張桂英. “瘦肉精”的危害及監(jiān)管探討［J］. 中國動物檢疫， 2011， 28（5）: 10-11. DOI:1005-944X（2011）05-0010-02.

［2］ 龐蘇納， 于芳. “瘦肉精”及其危害簡介［J］. 新疆畜牧業(yè)， 2009（3）: 17. DOI:1003-4889 （2009） 03-0017-01.

［3］ DOMINGUEZ R J C， GARCIA R J F， MARTINEZ R R， et al. Detection of main urinary metabolites of beta（2）-agonists clenbuterol，salbutamol and terbutaline by liquid chromatography high resolution mass spectrometry［J］. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences， 2013， 923/924: 128-135. DOI:10.1016/j.jchromb.2013.02.008.

［4］ LEPORATI M， BERGOGLIO M， CAPRA P， et al. Development，validation and application to real samples of a multiresidue LC-MS/ MS method for determination of β2-agonists and anabolic steroids in bovine hair［J］. Journal of Mass Spectrometry， 2014， 49（9）: 936-946. DOI:10.1002/jms.3467.

［5］ MURO D， CIARDUULLO S， CIVITAREALE C， et al. Development and validation of a multi-residue method for determination of 18 β-agonists in bovine urine by UPLC-MS/MS［J］. Microchemical Journal， 2014， 115: 70-77. DOI:10.1016/j.microc.2014.02.012.

［6］ WANG X J， ZHANG F G， DING F， et al. Simultaneous determination of 12 β-agonists in feeds by ultra-high-performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry［J］. Journal of Chromatography A， 2013， 1278: 82-88. DOI:10.1016/ j.chroma.2012.12.060.

［7］ LIN X Y， NI Y N， LI S Z， et al. A novel method for simultaneous analysis of three β2-agonists in foods with the use of a goldnanoparticle modified glassy carbon electrode and chemometrics［J］. Analyst， 2012， 137（9）: 2086-2094. DOI:10.1039/c2an16062e.

［8］ BO B， ZHU X J， MIAO P， et al. An electrochemical biosensor for clenbuterol detection and pharmacokinetics investigation［J］. Talanta，2013， 113: 36-40. DOI:10.1016/j.talanta.2013.03.056.

［9］ WANG H， ZHANG Y， LI H， et al. A silver-palladium alloy nanoparticle-based electrochemical biosensor for simultaneous detection of ractopamine， clenbuterol and salbutamol［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2013， 49: 14-19. DOI:10.1016/j.bios.2013.04.041.

［10］ 袁利鵬， 楊金易， 徐振林， 等. 熒光偏振免疫分析法檢測沙丁胺醇［J］.食品科學(xué)， 2013， 34（16）: 139-142. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201316028.

［11］ 陳小鋒， 李瑞芳， 劉曙照. 對克倫特羅具有高特異性的酶聯(lián)免疫吸附分析法研究［J］. 分析化學(xué)， 2013， 41（6）: 940-943. DOI:10.3724/ SP.J.1096.2013.20387.

［12］ ZHANG L L， GONG Y F， ZHANG M Z， et al. Development of a monoclonal antibody-based direct competitive enzymelinked immunosorbent assay for a new β-adrenergic agonist phenylethanolamine A［J］. Analytical Methods， 2014， 6（15）: 5942-5950. DOI:10.1039/c4ay00682h.

［13］ SHEN W J， ZHUO Y， CHAI Y Q， et al. Enzyme-free electrochemical immunosensor based on host-guest nanonets catalyzing amplification for procalcitonin detection［J］. Acs Applied Materials and Interfaces，2015， 7（7）: 4127-4134. DOI:10.1021/am508137t.

［14］ CHEN X J， WANG Y Y， ZHOU J J， et al. Electrochemical impedance immunosensor based on three-dimensionally ordered macroporous gold film［J］. Analytical Chemistry， 2008， 80（6）: 2133-2140. DOI:10.1021/ac7021376.

［15］ FANG Y S， WANG H Y， WANG L S， et al. Electrochemical immunoassay for procalcitonin antigen detection based on signal amplification strategy of multiple nanocomposites［J］. Biosensors and Bioelectronics， 2014， 51: 310-316. DOI:10.1016/j.bios.2013.07.035.

［16］ FENG R， ZHANG Y， MA H M， et al. Ultrasensitive non-enzymatic and non-mediator electrochemical biosensor using nitrogen-doped graphene sheets for signal amplification and nanoporous alloy as carrier［J］. Electrochimica Acta， 2013， 97: 105-111. DOI:10.1016/ j.electacta.2013.02.093.

［17］ BAI J， LAI Y J， JIANG D W， et al. Ultrasensitive electrochemical immunoassay based on graphene oxide-Ag composites for rapid determination of clenbuterol［J］. Analyst， 2012， 137（18）: 4349-4355. DOI:10.1039/C2AN35473J.

［18］ AMBROSI A， PUMERA M. Nanographite impurities dominate electrochemistry of carbon nanotubes［J］. Chemistry-A European Journal， 2010， 16（36）: 10946-10949. DOI:10.1002/chem.201001584.

［19］ FU L， ZHENG Y H， WANG A W， et al. Sensitive determination of quinoline yellow using poly （diallyldimethylammonium chloride）functionalized reduced graphene oxide modified grassy carbon electrode［J］. Food Chemistry， 2015， 181: 127-132. DOI:10.1016/ j.foodchem.2015.02.032.

［20］ ZHANG H S， BO X J， GUO L P. Electrochemical preparation of porous graphene and itselectrochemical application in the simultaneous determination ofhydroquinone， catechol， and resorcinol［J］. Sensors and Actuators B: Chemical， 2015， 220: 919-926. DOI:10.1016/ j.snb.2015.06.035.

［21］ WARNER J， ANDREESCU S. An acetylcholinesterase （AChE）biosensor with enhanced solvent resistance based on chitosan for the detection of pesticides［J］. Talanta， 2016， 146: 279-284. DOI:10.1016/ j.talanta.2015.08.030.

［22］ HUMMERS W S， OFFEMAN R E. Preparation of graphitic oxide［J］. Journal of the American Chemical Society， 1958， 80（6）: 1339-1339. DOI:10.1021/ja01539a017.

［23］ 邵科峰， 陳昌云， 顏妍， 等. 基于石墨烯-殼聚糖修飾電極的免疫傳感器檢測三聚氰胺［J］. 食品科學(xué)， 2013， 34（16）: 221-225. DOI:1002-6630（2013）16-0221-05.

［24］ FANG M， LONG J， ZHAO W， et al. pH-responsive chitosan-mediated graphene dispersions［J］. Langmuir， 2010， 26（22）: 16771-16774. DOI:10.1021/la102703b.

［25］ MEYER J C， GEIM A K， KATSNELSON M I， et al. The structure of suspended graphene sheets［J］. Nature， 2007， 446: 60-63. DOI:10.1038/ nature05545.

［26］ YIN H H， MA Q， ZHOU Y L， et al. Electrochemical behavior and voltammetric determination of 4-aminophenol based on graphene-chitosan composite film modified glassy carbon electrode［J］. Electrochim Acta， 2010， 55: 7102-7108. DOI:10.1016/ j.electacta.2010.06.072.

［27］ LIN K C， HONG C P， CHEN S M. Simultaneous determination for toxic ractopamine and salbutamol in pork sample using hybrid carbon nanotubes［J］. Sensors and Actuators B-Chemical， 2013， 177: 428-436. DOI:10.1016/j.snb.2012.11.052.

Development of A Multi-Residue Electrochemical Immunoassay Based on Broad-Spectrum Specific Antibody for Determination of β2-Agonists

REN Pengfei1， SHAO Kefeng1， ZHANG Jie1， ZHANG Honglin2， ZHAO Bo1，*
（1. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Biomedical Functional Material， Jiangsu Key Laboratory of Biofunctional Materials，College of Chemistry and Materials Science， Nanjing Normal University， Nanjing 210023， China；2. College of Food Science， Nanjing Xiaozhuang University， Nanjing 211171， China）

Salbutamol-ractopamine-bovine serum albumin conjugate （SAL-RAC-BSA） was prepared and served as immunogen to obtain a broad-spectrum specific antibody （anti-SAL-RAC-BSA Abs） through immunization of rabbits. Electrochemical immunosensor modified with reduced graphene oxide-chitosan composite and SAL was constructed and its electrochemical behavior was studied by cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy. Indirect competitive electrochemical immunoassay was carried out for the simultaneous determination of three β2-agonis， including clenbuterol （CL）， salbutamol （SAL） and terbutaline （TB）. The proposed method indicated a linearity in the range from 50 to 7 000 ng/mL， 1 to 1 500 ng/mL and 100 to 6 000 ng/mL for CL， SAL and TB， respectively， and the limits of detection were 0.2， 0.3 and 0.3 ng/mL， respectively. The recovery rates of clenbuterol in spiked pork， fat and liver samples ranged from 84.7% to 106%. In summary， a sensitive， rapid and simple electrochemical immunoassay was successfully developed for the determination of three β2-agonists.

broad-spectrum specific antibodies； β2-agonists； multi-residue； electrochemical immunosensor

10.7506/spkx1002-6630-201608043

TS202.3

A

1002-6630（2016）08-0236-06

2015-10-12

任鵬飛（1987—），男，碩士，研究方向為食品安全分析與檢測。E-mail：905587856@qq.com

趙波（1969—），男，教授，博士，研究方向為食品安全檢測與預(yù)警。E-mail：zbchem@126.com

引文格式：