成玉霞 赫淑倩 董賀 孫青

·論著·

非特殊型浸潤性乳腺癌HER-2檢測方法的對比研究

成玉霞 赫淑倩 董賀 孫青★

目的應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（quantitive real-time PCR，qPCR）檢測石蠟包埋非特殊型浸潤性乳腺癌標(biāo)本的HER-2表達(dá)狀況，與免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry，IHC）和熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）相應(yīng)檢測結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證qPCR技術(shù)檢測HER-2方法的可靠性和實(shí)用性。方法采用FISH和qPCR技術(shù)對IHC檢測結(jié)果分別為HER-2（0、1+、2+、3+）的乳腺癌標(biāo)本各100例進(jìn)行檢測，用kappa檢驗(yàn)分析三者的一致性。結(jié)果100例HER-2（0）和HER-2（1+）的標(biāo)本FISH和qPCR的檢測結(jié)果均無擴(kuò)增，符合率100％；IHC檢測HER-2（2+）的標(biāo)本，F(xiàn)ISH和qPCR檢測結(jié)果之間k=0.731（P＜0.001），二者一致性強(qiáng)；IHC檢測HER-2（3+）的標(biāo)本，F(xiàn)ISH與qPCR檢測結(jié)果k=0.634（P＜0.001），二者具有較好的一致性，與IHC檢測結(jié)果也具有較強(qiáng)的一致性。三者對乳腺癌患者的臨床病理指標(biāo)反應(yīng)具有較好的一致性。結(jié)論qPCR方法簡便、實(shí)用、有效，檢測乳腺癌HER-2基因狀況可與FISH法互為補(bǔ)充。

非特殊型浸潤性乳腺癌；HER-2；IHC；FISH；qPCR

近年來，我國乳腺癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升，且日趨年輕化，成為威脅女性健康的幾大惡性腫瘤之一。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，約20％～25％的乳腺癌患者呈人類表皮生長因子受體-2（human epidermal grow th factor receptor 2，HER-2）過表達(dá)或基因擴(kuò)增［1］，而HER-2高表達(dá)的浸潤性乳腺癌分化低，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且復(fù)發(fā)早，預(yù)后差［2-3］。2002年，美國食品和藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)赫賽汀用于HER-2過表達(dá)的乳腺癌［4］。大量臨床研究也表明，HER-2高表達(dá)的乳腺癌患者使用赫賽汀治療后，其無病生存率和總生存期大大延長；相反，HER-2低表達(dá)患者使用赫賽汀治療不能獲益。因此標(biāo)準(zhǔn)化檢測HER-2受體已成為赫賽汀靶向治療的重要部分［5］。

目前，美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于評估HER-2狀態(tài)的技術(shù)為免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）2種。然隨著實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（quantitive real-time PCR，qPCR）的發(fā)展和日趨成熟，RNA水平的HER-2檢測變得更加簡便、快捷，其能否替代FISH技術(shù)作為IHC檢測的補(bǔ)充，有待進(jìn)一步的研究確證［6-7］。本研究分別用IHC、FISH和qPCR 3種技術(shù)檢測400例非特殊性浸潤性乳腺癌石蠟組織的HER-2狀態(tài)，將三者結(jié)果進(jìn)行比較，并對比三者結(jié)果與患者臨床病理特征之間的聯(lián)系，以驗(yàn)證qPCR技術(shù)的可靠性和實(shí)用性及其替代FISH技術(shù)的可行性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選取2010年1月至2014年6月我院手術(shù)切除病理明確診斷的非特殊性浸潤性乳腺癌患者的石蠟?zāi)[瘤組織，重新切片進(jìn)行IHC檢測，由病理診斷醫(yī)師重新評估，從中選取HER-2免疫組化結(jié)果0、1+、2+和3+各100例分別行FISH基因擴(kuò)增和qPCR檢測。患者均為女性，年齡最小為26歲，最大為83歲，中位年齡53.1歲?；仡櫲虢M患者ER、PR及Ki-67的免疫組化結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)分析HER-2結(jié)果與各指標(biāo)表達(dá)之間的關(guān)系。

1.2 IHC法

腫瘤蠟塊切片3～4μm，粘附載玻片貼片，常規(guī)65℃烘烤過夜，平行加陰陽性對照。使用美國羅氏VENTANA Bench Mark全自動免疫組化染色機(jī)和VENTANA抗HER-2蛋白的單克隆抗體，克隆號4b5。IHC標(biāo)記的操作關(guān)鍵步驟依次為VENTANA脫蠟液EZ 75℃脫蠟4 m in；95℃PH8.0抗原修復(fù)30min；緩沖液中漂洗，過氧化物酶阻滯液中孵育4 min；隨后加入HER-2一抗，37℃孵育16m in；二抗UV HRP孵育8m in；DAB顯色8m in，蘇木素復(fù)染，返藍(lán)液返藍(lán)，最后漂洗封片。

1.3 FISH法

切片準(zhǔn)備同IHC，平行加做陰陽性對照。Path-Vysion HER-2 DNA探針試劑盒購自美國Vysis公司，熒光顯微鏡型號為德國萊佧LeiCa DM 4000B。操作步驟：充分脫蠟至水，蒸餾水煮沸20 min，晾干后37℃胃酶消化15 m in，漂洗后梯度酒精脫水晾干，加10μL雜交液蓋片并用蠟?zāi)z封邊，85℃變性5 m in，37℃雜交過夜。第2天將切片置于雜交后洗液（2×SSC，0.3％NP-40）中漂浮蓋玻片，組織片入雜交后洗液72℃2 m in，再將其放置在暗處室溫干燥，滴加10μL DAPI顯色液在組織片靶區(qū)域，蓋玻片封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。使用德國萊佧Leica CW 4000 FISH分析軟件進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)。

1.4 qPCR法

1.4.1 組織準(zhǔn)備

組織進(jìn)行切片，厚度8～10μm，對照相應(yīng)組織的HE切片選取腫瘤區(qū)域進(jìn)行顯微切割，根據(jù)癌細(xì)胞量多少使用2～3片進(jìn)行檢測，切片后盡快進(jìn)行RNA的提取，如不能及時(shí)提取要存放于-20℃，以減少RNA的降解。

1.4.2 RNA的提取

提取組織總RNA使用的是微量組織總RNA快速提取試劑盒（江蘇默樂生物科技有限公司），采用胍鹽裂解的柱式離心法從石蠟組織切片中提取。每例吸取2μL作為模板進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)，剩余可以放入冰箱-20℃保存。

1.4.3 擴(kuò)增檢測

HER-2核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）購自江蘇默樂生物科技有限公司，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription ploymerase chain reaction，RT-PCR）結(jié)合Taqman熒光探針技術(shù)對乳腺癌患者腫瘤組織樣本中HER-2基因表達(dá)進(jìn)行鑒別，每個(gè)樣本同時(shí)進(jìn)行管家基因的檢測，實(shí)現(xiàn)基因的相對定量，熒光信號的收集定為FAM（HER-2）、HEX（VIC）。同一批次加入陰陽性質(zhì)控品，儀器為美國ABI公司PCR儀7500。擴(kuò)增體系為25μL，其中包括RT-PCR buffer 18.1μL，酶m ix 0.4μL，引物探針m ix 4.5μL，RNA（cDNA）模板2.0μL。擴(kuò)增條件為45℃15 m in；95℃1 m in；然后95℃15 s，58℃1 m in擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。

1.5 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

HER-2 IHC和FISH檢測結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)均為2013年美國臨床腫瘤學(xué)會/美國病理學(xué)家學(xué)會2007版乳腺癌HER-2檢測指南基礎(chǔ)上的更新版本［8］以及我國《乳腺癌HER-2檢測指南（2014版）》［9］。

qPCR HER-2檢測結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)按照試劑盒說明推薦：陽性質(zhì)控品ΔCt≥23，且陰性質(zhì)控品其突變管與參照管均無Ct值，或未出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，檢測樣本的CtHER-2和Ct管家基因都有典型S型擴(kuò)增曲線，提示本次檢測有效，否則無效。ΔCt= 20-（CtHER-2-Ct管家基因），ΔCt≥23，HER-2表達(dá)陽性；ΔCt≤21，HER-2表達(dá)陰性；21＜ΔCt＜23，應(yīng)重新檢測，若ΔCt＞21，則為HER-2表達(dá)陽性，否則為陰性。

對于3種方法差異顯著的病例，重復(fù)進(jìn)行檢測，確保結(jié)果真實(shí)可靠。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，3種方法檢測結(jié)果的一致性采用Kappa檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；用χ2和Fisher's Exact test來分析HER-2結(jié)果與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者HER-2、ER、PR、Ki-67免疫組織化學(xué)染色

乳腺癌腫瘤細(xì)胞中ER、PR和Ki-67免疫組織化學(xué)染色陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞核，HER-2的表達(dá)位于細(xì)胞膜（圖1）?；颊逧R表達(dá)結(jié)果為：陰性80例，15例1+，45例2+，260例3+；PR表達(dá)結(jié)果為：陰性145例，50例1+，60例2+，145例3+；Ki-67表達(dá)結(jié)果為：≤5％45例，＞5％且≤30％220例，＞30％且≤50％ 70例，＞50％65例；HER-2結(jié)果如表1所示。

表1 浸潤性乳腺癌中FISH、qPCR和IHC檢測HER-2的結(jié)果比較Table 1 Comparison of HER-2 results by FISH，qPCR and IHC

2.2 乳腺癌患者HER-2基因擴(kuò)增的FISH檢測結(jié)果

400例標(biāo)本中，F(xiàn)ISH檢測結(jié)果為：HER-2基因擴(kuò)增112例，擴(kuò)增率28％（112/400）；無HER-2基因擴(kuò)增者285例，占檢測總例數(shù)的71.3％（291/400）；不能確定者3例，占0.075％（3/400），該3例后經(jīng)qPCR檢測，證實(shí)其中2例存在HER-2的擴(kuò)增，另1例未擴(kuò)增。腫瘤組織中FISH 3種表達(dá)的情況如圖2所示。

2.3 乳腺癌患者HER-2基因qPCR檢測結(jié)果

400例標(biāo)本中，檢測有擴(kuò)增的115例，擴(kuò)增率28.8％（115/400），另外285例標(biāo)本沒有擴(kuò)增，占到檢測總例數(shù)的71.25％（285/400），見表1。

2.4 乳腺癌患者HER-2基因不同檢測方法間的區(qū)別與聯(lián)系

200例IHC檢測分別為0/1+的標(biāo)本中，F(xiàn)ISH和qPCR檢測無一例擴(kuò)增，符合率100％；在IHC檢測HER-2結(jié)果為2+的標(biāo)本中，F(xiàn)ISH的陽性檢出率為20％，qPCR的陽性檢出率為25％，其中FISH和qPCR結(jié)果共同陰性者71例（73％，71/97），F(xiàn)ISH和qPCR結(jié)果共同陽性者17例（18％，17/97），qPCR陽性而FISH結(jié)果陰性的病例6例（6％，6/97），F(xiàn)ISH結(jié)果陽性而qPCR檢測為陰性的有3例（3％，3/97），經(jīng)Kappa檢驗(yàn)，在IHC 2+的乳腺癌中FISH和qPCR的檢測結(jié)果k=0.731（P＜0.000 1）（表2，圖3）。例2例（2％，62/100），F(xiàn)ISH結(jié)果陽性而qPCR檢測為陰性的有4例（4％，4/100），經(jīng)Kappa檢驗(yàn)，在IHC 3+的乳腺癌中FISH和qPCR的檢測結(jié)果k= 0.634（P＜0.000 1）（表3，圖4）。

表2 乳腺癌中HER-2表達(dá)2+標(biāo)本qPCR和FISH表達(dá)結(jié)果的比較Table 2 Comparison of HER-2 results by qPCR and FISH in IHC（2+）

表3 乳腺癌中HER-2表達(dá)3+標(biāo)本qPCR和FISH表達(dá)結(jié)果的比較Table 3 Comparison of HER-2 resultsby qPCR and FISH in IHC（3+）

在IHC檢測表達(dá)為3+的腫瘤組織中，F(xiàn)ISH檢測的整體陽性率為92％，qPCR的陽性檢出率為90％，其中FISH和qPCR結(jié)果共同陽性者88例（88％，88/100），F(xiàn)ISH和qPCR結(jié)果共同陰性者6例（6％，6/100），qPCR陽性而FISH結(jié)果陰性的病

2.5 乳腺癌中IHC、qPCR和FISH檢測HER-2結(jié)果與臨床病理特征的聯(lián)系

病理學(xué)分級I級的有40例，Ⅱ級的有295例，Ⅲ級的有65例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有175例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有225例；臨床分期T1有180例，T2有175例，T3有20例，T4有25例。

IHC和qPCR檢測的HER-2結(jié)果陽性率均與組織的病理學(xué)分級、ER、PR以及Ki67的表達(dá)這幾個(gè)因素密切相關(guān)（P＜0.05），而與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期關(guān)系不密切，分別見表4、表6；而FISH檢測的HER-2結(jié)果陽性率與患者的組織的病理學(xué)分級、臨床分期、ER、PR以及Ki67的表達(dá)這幾個(gè)因素亦密切相關(guān)（P＜0.05），而與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況關(guān)系不密切（表5）。

表4 用免疫組織化學(xué)（IHC）方法檢測的HER-2表達(dá)的結(jié)果與臨床病理特征Table 4 Expression of HER-2 by IHC and clinicopathological parameters

3 討論

HER-2/neu或HER-2基因定位于人第17號染色體的長臂（17q21.1），其編碼的產(chǎn)物HER-2在乳腺癌組織中有25％～30％存在異常高表達(dá)［10］。HER-2高表達(dá)或其基因的擴(kuò)增與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及治療等有著重要的聯(lián)系［11］。HER-2基因擴(kuò)增的乳腺癌患者對內(nèi)分泌治療及常規(guī)化療藥物不敏感、預(yù)后差，而對HER-2的靶向藥物赫賽汀的敏感性較好。2002年，赫賽汀已通過美國FDA認(rèn)證，但必須在IHC檢測HER-2（3+）和/或FISH法檢測結(jié)果為陽性時(shí)才能使用［12］，自此，HER-2檢測有了巨大的臨床價(jià)值［5］。

表5 用熒光原位雜交（FISH）方法檢測的HER-2表達(dá)的結(jié)果與臨床病理特征Table 5 Expression of HER-2 by FISH and clinicopathological parameters

表6 用實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）方法檢測的HER-2表達(dá)的結(jié)果與臨床病理特征Table 6 Expression of HER-2 by qPCR and clinicopathological parameters

目前，國內(nèi)外常用的HER-2檢測方法有IHC、FISH、顯色原位雜交［13］（chromosome in situ hybridization，CISH）、銀染原位雜交（silver in situ hybridization，SISH）和qPCR［14］等，但qPCR尚未作為常規(guī)應(yīng)用。IHC是目前臨床上常用的檢測乳腺癌HER-2蛋白表達(dá)的方法，該方法操作簡便、費(fèi)用低廉、可重復(fù)性好。然而由于標(biāo)記蛋白在組織固定后其抗原活性會下降或消失，從而導(dǎo)致假陰性；抗原修復(fù)可提高其敏感性，但修復(fù)過度會產(chǎn)生假陽性；另一方面，抗體的差異、結(jié)果主觀判斷差異等原因，均使得IHC結(jié)果假陽性或假陰性問題無法避免。全自動免疫組化機(jī)的應(yīng)用，最大程度去除了染色過程中人為因素的影響；但是標(biāo)本離體時(shí)間的長短，之后能否及時(shí)有效固定及其標(biāo)準(zhǔn)化的組織處理對于IHC檢測結(jié)果的準(zhǔn)確與否至關(guān)重要。FISH是用于檢查17號染色體著絲粒和HER-2/neu基因擴(kuò)增情況的技術(shù)，染色體的穩(wěn)定性比蛋白質(zhì)好得多，故此技術(shù)的敏感性和特異性較高，并可以避免17號染色體的非整倍體現(xiàn)象導(dǎo)致的IHC結(jié)果的假陽性，已被公認(rèn)為檢測HER-2基因過表達(dá)的金標(biāo)準(zhǔn)。但在進(jìn)行FISH檢測時(shí)也會受到一些因素的影響，比如蛋白消化不當(dāng)、烤片溫度過高等，可使熒光信號減弱或無信號；熒光容易淬滅，需要暗視野觀察并計(jì)數(shù)等，使得結(jié)果判定容易受人為因素影響；FISH方法試劑成本高，操作繁瑣，需要配置特殊的熒光顯微鏡及專門的軟件觀察等，無疑給檢測帶來困難。

qPCR［15］方法是檢測RNA的最好選擇，更接近于RNA定量，qPCR方法敏感可靠。Chariyalertsak等［16］的研究顯示，qPCR方法能簡單又精確地檢測出石蠟組織中的HER-2表達(dá)狀況。Barberis等［17］認(rèn)為qPCR能有效檢測HER-2且成本較低，Bossard等［18］也有類似的發(fā)現(xiàn)，與IHC相比，qPCR的敏感性和特異性能達(dá)到87.5％和100％，與FISH相比，qPCR的敏感性和特異性能達(dá)到89.5％和92％。本次實(shí)驗(yàn)中我們用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測HER-2mRNA的表達(dá)，研究結(jié)果表明無論在HER-2（0，1+）的乳腺癌患者中，還是HER-2（2+，3+）的患者中qPCR檢測結(jié)果和FISH基因檢測結(jié)果都出現(xiàn)較高的一致性，（k=0.731，k=0.634，P均＜0.001），由此我們認(rèn)為qPCR檢測結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)FISH的檢測結(jié)果一致性好，其他研究也得出過類似的結(jié)論［19-20］。qPCR方法具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)省時(shí)以及可以批量操作的優(yōu)點(diǎn)，其成本比IHC高，但僅為FISH成本的1/4左右，將來若能應(yīng)用于臨床檢測，可為IHC（2+）的患者提供更為經(jīng)濟(jì)的選擇。

本研究中，IHC、FISH和qPCR檢測的HER-2結(jié)果陽性率均與組織的病理學(xué)分級、ER、PR以及Ki67的表達(dá)等因素密切相關(guān)（P＜0.05），而與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期關(guān)系不密切，說明在反應(yīng)臨床病理特征方面三者具有一致性，從側(cè)面證實(shí)了3種檢測方法結(jié)果的一致性。Zhu等［21］在應(yīng)用qPCR技術(shù)在檢測胃癌HER-2也得到了同樣的結(jié)論。未來qPCR技術(shù)有望在乳腺癌HER-2檢測中應(yīng)用于臨床與FISH方法互為補(bǔ)充。

本研究中IHC（2+，3+）標(biāo)本中的陽性率與國內(nèi)外大多數(shù)研究結(jié)果一致，但在IHC（0，1+）的標(biāo)本中未曾檢測出陽性，這除了與標(biāo)本及時(shí)充分固定，處理恰當(dāng)和使用全自動免疫組化染色機(jī)染色等因素有關(guān)外，還可能與我們使用新的評判標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。在我們的研究中應(yīng)用舊的免疫組化HER-2判讀標(biāo)準(zhǔn)有1例判為1+、更新的判讀標(biāo)準(zhǔn)為2+的標(biāo)本，經(jīng)FISH和qPCR檢測示均有HER-2基因擴(kuò)增，說明更新的判讀標(biāo)準(zhǔn)較舊標(biāo)準(zhǔn)避免了漏檢，具有更好的參考價(jià)值。對于IHC（3+）而FISH（-）或qPCR（-）的患者選擇使用赫賽汀靶向藥物的療效尚需進(jìn)一步大樣本的研究和臨床隨診驗(yàn)證。

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Com parison of different methods for HER-2 status detection in non-special invasive breast carcinoma

CHENG Yuxia，HEShuqian，DONG He，SUN Qing★
（Department of Pathology，Qianfoshan Hospital，Jinan，Shandong，China，250014）

Objective To compare quantitative polymerase chain reaction（qPCR）with immunohistochemistry（IHC）and fluorescence in situ hybridization（FISH）for the detection of HER-2 in non-special invasive breast carcinoma.Methods HER-2 expression levels in carcinoma tissue were detected using IHC，and the HER-2 gene expression levels were determined by FISH and qPCR.According to IHC results，all patients were divided into 4 groups［（HER-2（0），HER-2（1+），HER-2（2+）and HER-2（3+）］with 100 cases in each. The kappa test was used to measure the consistency among the results of IHC，F(xiàn)ISH and qPCR.Results In HER-2（0）and HER-2（1+）groups，there were no differences between the results of qPCR and FISH.In HER-2（3+）group，a few discrepancies were found between qPCR and FISH［k=0.634（P＜0.001）］.In HER-2（2+）group，the diagnostic consistency was good between qPCR and FISH［k=0.731（P＜0.001）］.Using FISH test，there was consistency in correlation between HER-2 expression and clinicopathological parameters in the results of qPCR，F(xiàn)ISH and IHC.Conclusion qPCR is a convenient，objective and efficient method，which may be used as an alternative to FISH，for the detection of HER-2 gene state of non-special invasive breastcarcinoma.

Non-special invasive breast carcinoma；HER-2；IHC；FISH；qPCR

國家自然科學(xué)基金（81272420）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2012HM085）

山東省千佛山醫(yī)院病理科，山東，濟(jì)南250014

★通訊作者：孫青，E-mail：qingsw99@163.com