蘇國(guó)苗 楊哲 邊莉 潘國(guó)慶

·論著·

云南昆明地區(qū)非小細(xì)胞肺癌EGFR突變情況研究

蘇國(guó)苗 楊哲 邊莉 潘國(guó)慶★

目的研究昆明地區(qū)非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung canncers，NSCLCs）表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變特點(diǎn)及與臨床特征（性別、年齡、吸煙、組織學(xué)分型）的相關(guān)性。方法采用突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）檢測(cè)昆明地區(qū)173例非小細(xì)胞肺癌EGFR基因第18～21號(hào)外顯子基因突變情況，并分析其突變與臨床特征的關(guān)系。結(jié)果173例NSCLCs共檢測(cè)EGFR突變38.7％（67/173），其中外顯子19和21突變分別占突變總數(shù)的58.2％（39/67）和25.4％（17/67）；腺癌和腺鱗癌基因突變率分別為44.1％（64/145）和60％（3/ 5）；無(wú)吸煙史EGFR突變率51.1％（48/94）顯著高于有吸煙史患者24.1％（19/79），P＜0.05；女性EGFR突變率分別為49.4％（44/89）顯著高于男性27.4％（23/84），P＜0.05。結(jié)論云南昆明地區(qū)NSCLCs患者EGFR基因突變主要以19號(hào)外顯子缺失突變和21號(hào)外顯子點(diǎn)突變?yōu)橹?，多見于女性、無(wú)吸煙史、腺癌和腺鱗癌患者。

非小細(xì)胞肺癌；突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)；表皮生長(zhǎng)因子受體；基因突變

目前，肺癌已經(jīng)成為我國(guó)發(fā)病率、死亡率最高的腫瘤，其相關(guān)驅(qū)動(dòng)基因研究和個(gè)體化治療也越來(lái)越受到臨床的關(guān)注，而表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal grow th factor receptor，EGFR）是酪氨酸激酶家族成員之一，位于細(xì)胞膜，當(dāng)EGFR被配體激活后將引起細(xì)胞內(nèi)該信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)，將信號(hào)由胞外傳遞至胞內(nèi)，調(diào)節(jié)相關(guān)重要基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、遷移、分化以及凋亡［1］。多項(xiàng)基礎(chǔ)和臨床研究結(jié)果均證實(shí)，EGFR及其信號(hào)通路的關(guān)鍵組分發(fā)生異常表達(dá)或者體細(xì)胞突變，將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，因此針對(duì)EGFR及其信號(hào)通路的靶標(biāo)檢測(cè)和靶向藥物治療成為腫瘤個(gè)體化診療的重要研究對(duì)象［2］。本次研究檢測(cè)了云南昆明地區(qū)173例NSCLCs患者EGFR基因突變情況，同時(shí)對(duì)其突變特點(diǎn)及與臨床特征關(guān)系進(jìn)行了分析，為臨床靶向用藥方案的選擇提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2014年5月至2016年2月經(jīng)臨床手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的昆明地區(qū)非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本173例，其中男性84例，女性89例；年齡29～79歲，中位年齡54歲；有吸煙史病人79例。按世界衛(wèi)生組織肺癌組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分型，腺癌145例、鱗癌20例、腺鱗癌5例及其他3例。所有患者均未接受過(guò)放化療和EGFR-TKI治療等抗腫瘤治療。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集

腫瘤組織病理石蠟切片：由肺癌亞?？撇±磲t(yī)師篩片，調(diào)取蠟塊，由于標(biāo)本保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，DNA會(huì)降解（組織固定所使用的10％中性福爾馬林中的甲醛與組織DNA大分子之間隨著儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)形成廣泛的亞甲基交聯(lián)橋，導(dǎo)致DNA鏈的脆性增加，從而更容易發(fā)生隨機(jī)斷裂），一般選擇儲(chǔ)存時(shí)間在2年以內(nèi)的蠟塊。用刀片剔除多余蠟塊，為防止標(biāo)本間交叉污染，每切一例標(biāo)本前用75％酒精擦拭刀片和鑷子，切片厚度：6～10μm，數(shù)量6～10片，然后用鑷子移至干凈的1.5 m L離心管中。

1.2.2 DNA提取

將已裝有患者組織的離心管置于生物安全柜，使用德國(guó)QIAGEN公司的QIAamp DNA FFEP Tissue Kit（試劑編碼：Cat.No.56404）試劑盒并嚴(yán)格按照說(shuō)明書提取步驟操作，完成后用紫外分光光度計(jì)（品牌型號(hào)：廈門艾德生物技術(shù)有限公司AmonyDx SMA4000）測(cè)定DNA濃度。

1.2.3 熒光定量PCR擴(kuò)增

嚴(yán)格按照人類EGFR突變檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）（上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司）說(shuō)明書在生物安全柜中加樣，并采用德國(guó)ABI公司QPCR儀（型號(hào)：Stepone Plus），依據(jù)突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）的原理檢測(cè)EGFR基因外顯子18、19、20及21的突變情況。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)定陰、陽(yáng)對(duì)照及內(nèi)參照。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：42℃，5m in；94℃，3min；94℃，15 s，60℃，60 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為25μL。在PCR循環(huán)的第一步60℃時(shí)收集熒光信號(hào)。檢測(cè)通道為：FAM-TAMRA。參比熒光設(shè)定為none。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)率的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變特點(diǎn)

在173例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本中，共檢出EGFR基因突變67例（38.7％）。其中外顯子19檢測(cè)到突變39例（58.2％）；外顯子21檢測(cè)到突變28例（25.4％）；未查見外顯子19和外顯子21的雙突變；外顯子18檢測(cè)到突變3例（4.5％）；外顯子20檢測(cè)到突變2例（2.9％），外顯子18和S768I位點(diǎn)雙突變3例（4.5％）；外顯子21和T790M位點(diǎn)雙突變3例（4.5％）?？梢娫颇侠ッ鞯貐^(qū)EGFR突變類型主要以19號(hào)外顯子突變和21號(hào)外顯子突變?yōu)橹鳎ū?）。

表1 EGFR基因突變特點(diǎn)（n=67）Table 1 Distribution of EGFR genemutation（n=67）

2.2 EGFR基因突變與臨床特征分析

在173例云南昆明地區(qū)NSCLCs病例數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析可知：男性患者的EGFR突變率為27.4％（23/84），明顯低于女性患者49.4％（44/89）（P= 0.002）；≤60歲患者EGFR突變率為36.2％（38/ 105），＞60歲患者EGFR突變率為42.6％（29/68），兩者之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.394）；無(wú)吸煙史患者EGFR基因突變率為51.1％（48/94），有吸煙患者為24.1％（19/79），二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在145例患者腺癌中64例發(fā)生突變（44.1％）與鱗癌及其他組織類型比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在20例鱗癌中均未發(fā)生突變；在5例腺鱗癌中3例發(fā)生突變（60％）；其它組織類型標(biāo)本未發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變（表2）。

表2 EGFR基因突變與臨床特征的關(guān)系Table 2 Correlation between EGFR genemutation and patient clinical characters

3 討論

表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是屬于酪氨酸激酶I型受體家族，基因定位于人類第7號(hào)染色體的短臂，含有28個(gè)外顯子，廣泛分布于各種上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)3個(gè)部分［3］。EGFR基因突變主要發(fā)生在胞內(nèi)TK區(qū)域前4個(gè)外顯子上（18～21）［4］。位于EGFR酪氨酸激酶活性區(qū)域的ATP結(jié)合位點(diǎn)，TKI通過(guò)與ATP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合EGFR信號(hào)通路的傳導(dǎo)，最終達(dá)到抑制腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、血管形成等一系列腫瘤細(xì)胞生物活動(dòng)［5］，進(jìn)而有效的治療EGFR基因突變的肺癌患者。因此，EGFR突變可以作為NSCLCs患者EGFR-TKI治療敏感性的預(yù)測(cè)因子，通過(guò)檢測(cè)EGFR突變的情況可以指導(dǎo)靶向用藥及針對(duì)性的個(gè)體化治療。

相關(guān)研究資料表明，EGFR-TKI的療效主要與EGFR基因外顯子19和21的突變狀態(tài)有關(guān)，且突變多發(fā)生于腺癌、非吸煙和女性肺癌患者［6］。本次研究對(duì)云南昆明地區(qū)173例NSCLCs患者EGFR 18～21外顯子突變特點(diǎn)及與臨床特征分別進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示：云南昆明地區(qū)EGFR突變類型主要以19號(hào)外顯子突變和21號(hào)外顯子突變?yōu)橹?，和目前亞洲人群EGFR檢測(cè)突變主要以19和21外顯子為主的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致［7］；同時(shí)檢測(cè)到外顯子外顯子18和S768I位點(diǎn)雙突變4.5％（3/67）和外顯子21和T790M位點(diǎn)雙突變4.5％（3/67），可能與我省地域環(huán)境、民族和遺傳因素等有相關(guān)性，有待進(jìn)一步跟蹤研究；EGFR突變?cè)诓煌詣e和病理組織學(xué)類型等的病例中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，女性突變49.4％（44/89）高于男性27.4％（23/84）（P= 0.002）；無(wú)吸煙史（48/94）明顯高于具有吸煙史患者（19/79）（P＜0.05）；腺癌44.1％（64/145）和腺鱗癌60％（3/5）的突變率高于其它病理組織學(xué)類型（P＜0.05）；但EGFR突變與肺癌患者的年齡無(wú)明顯關(guān)系（P=0.394）。綜上所述，云南昆明地區(qū)EGFR基因突變主要以19號(hào)外顯子缺失突變和21號(hào)外顯子點(diǎn)突變?yōu)橹鳎嘁娪谂?、無(wú)吸煙史、腺癌和腺鱗癌患者。

肺癌細(xì)胞中EGFR酪氨酸酶基因編碼區(qū)外顯子19或21突變（體細(xì)胞突變）的患者，靶向藥物吉非替尼/厄洛替尼的有效率高達(dá)80％以上。19號(hào)外顯子堿基缺失主要發(fā)生在746～750位的氨基酸；21外顯子點(diǎn)突變表現(xiàn)為858位密碼子的亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼幔↙858R）［8-9］。此外還有研究表明EGFR基因外顯子18、20和22的突變，也與NSCLCs對(duì)EGFR-TKIs的治療敏感性相關(guān)，EGFR基因Exon18突變型患者對(duì)藥物敏感性增強(qiáng)，藥效更佳［10-11］；EGFR基因外顯子Exon20（常見于T790M位點(diǎn)）突變型患者對(duì)藥物耐藥性增強(qiáng)，藥效差（但其中S768I位點(diǎn)突變目前多考慮對(duì)TKI治療具低敏感性）。EGFR基因22號(hào)外顯子E884K突變型患者對(duì)易瑞沙（吉非替尼）敏感，對(duì)特羅凱（厄洛替尼）耐藥；但當(dāng)同時(shí)伴有21號(hào)外顯子L858R突變時(shí)，患者對(duì)吉非替尼和厄洛替尼敏感性都有增加［12-13］。本研究NSCLCs患者EGFR突變主要發(fā)生在19和21號(hào)外顯子，分別占突變總數(shù)的58.2％（39/67）和25.4％（17/67）。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，中國(guó)不同地區(qū)EGFR基因突變存在顯著的地域差異，臺(tái)灣地區(qū)的EGFR基因的突變主要以外顯子21為主［14］，云南和廣東地區(qū)主要以外顯子19為主，而北京、上海地區(qū)區(qū)域間無(wú)明顯差異［15］。本次研究得出云南昆明地區(qū)EGFR基因突變主要發(fā)生在外顯子19和21，同時(shí)發(fā)現(xiàn)3例外顯子18與S768I位點(diǎn)罕見雙突變，證實(shí)了我國(guó)NSCLCs患者EGFR基因突變類型存在著地域差異，其可能與民族、遺傳背景、環(huán)境等有相關(guān)性。

綜上所述，云南昆明地區(qū)NSCLCs的EGFR基因突變與患者的性別、病理組織學(xué)類型有關(guān)，主要以19號(hào)外顯子缺失突變和21號(hào)外顯子點(diǎn)突變?yōu)橹鳎嘁娪谂?、無(wú)吸煙史、腺癌和腺鱗癌患者，這可為NSCLCs患者個(gè)體化診療方案的選擇提供重要的依據(jù)。

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Study on mutation of EGFR gene in non-small cell lung cancers in Kunming of Yunnan

SU Guomiao，YANG Zhe，BIAN Li，PAN Guoqing★
（The Department of Pathology of First affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming，Yun Nan，China，650032）

Objective This study aimed to investigate gene mutations of epidermal grow th factor receptor（EGFR）and the relation between mutation types and clinical features（gender，age，history of smoking，histology）of NSCLSs in Kunming，Yunnan.Methods Mutations of exons 18，19，20 and 21 of EGFR in 173 NSCLCs from Kunming were detected by PCR-amplification refractory mutation system，and the correlation between mutations and clinical features of NSCLCs were analyzed.Results Mutations were found in 67 cases of 173 lung cancer samples，with an incidence of 38.7％.Mutations were mainly detected in exon 19（58.2％，39/67）and exon 21（25.4％，17/67）.Mutation frequency in adenocarcinoma and adenosquamous cell carcinoma was（41.1％，64/145）and（60％，3/5）respectively.Mutations in non-smoking patients（51.1％，48/94）were higher than those who had a history of smoking（24.1％，19/79）.Mutations in female patients（49.4％，44/ 89）were higher than in males（27.4％，23/84）.Conclusion Mutation frequency of EGFR in lung cancer from patients in Kunming of Yunnan is more frequently detected in female，non-smoking，adenocarcinoma and adenosquamous cell carcinoma and the main types of mutation are exon 19 and exon 21mutations.

Non-small cell lung cancer；Amplification refractory mutation system；Epidermal grow th factor receptor；Gene muation

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，云南，昆明650032

★通訊作者：潘國(guó)慶，E-mail：guoqing_pan@163.com