陳海云，賈麗娟，單文杰，楊　旭，劉雪蘭

Nalp3 MDA5和TLR7受體在青年雞組織中的表達(dá)水平

陳海云，賈麗娟，單文杰，楊旭，劉雪蘭

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 人獸共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036）

天然免疫受體在機(jī)體抗病毒過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。為了解Nalp3、MDA5和TLR7受體在青年雞組織中分布特征，首先應(yīng)用RT-PCR方法從18周齡雞肝臟中分別擴(kuò)增目的片段，建立實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量RT-PCR檢測(cè)多種組織中Nalp3、MDA5和TLR7受體的表達(dá)譜及相對(duì)含量。結(jié)果表明，3種受體在不同組織中轉(zhuǎn)錄水平差異較大，其中Nalp3在肝臟和腎臟、TLR7在心、脾和肺臟中表達(dá)量相對(duì)較高，而MDA5在各組織中表達(dá)均較低。該3種受體在不同組織中轉(zhuǎn)錄水平的差異提示其識(shí)別的相對(duì)作用可能不同。

病毒RNA受體；mRNA轉(zhuǎn)錄水平；相對(duì)定量；組織分布特征

天然免疫在識(shí)別各種病原體感染以及隨后觸發(fā)獲得性免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［1］。天然免疫識(shí)別受體中TLR7已被證實(shí)能識(shí)別病毒RNA，介導(dǎo)多種病毒的免疫應(yīng)答［2］。除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)，MDA5可識(shí)別單股正鏈RNA病毒［3］。Nalp3受體在HIV和流感病毒感染后激活下游信號(hào)通路［4-6］。相比哺乳動(dòng)物，禽類天然免疫受體及其激活通路的探討明顯滯后，尤其是禽類Nalp3的相關(guān)研究更少，尚未建立有效的檢測(cè)方法。為了解TLR7、MDA5和Nalp3等識(shí)別RNA病毒的天然受體在雞體內(nèi)的表達(dá)水平及其組織分布特征，本文從雞肝臟組織中分別擴(kuò)增出這3種受體的基因片段，建立實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量RT-PCR方法用于檢測(cè)這3種不同受體雞同一組織以及同一受體在不同組織中表達(dá)水平，為進(jìn)一步探討該類受體在雞抗病毒作用提供研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1主要試劑及儀器RNA樣本保存液、總RNA提取試劑，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；熒光定量檢測(cè)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等，購(gòu)自Ta-KaRa公司；Real Time PCR儀為ABI7500。

1.2引物設(shè)計(jì)及合成在參考GenBank上雞TLR7、Nalp3和MDA5基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)引物（見表1），擴(kuò)增β-actin的引物參考文獻(xiàn)［7］，送Invitrogen公司合成。

1.3Total RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄無(wú)菌采集4只18周齡SPF雞（購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)在嚴(yán)格消毒的環(huán)境里），心、肝、脾、肺、腎和肌肉組織，儲(chǔ)存于RNAStore中，然后提取各組織總RNA，去基因組和反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　Nalp3、MDA5、TLR7實(shí)時(shí)定量PCR的引物設(shè)計(jì)

1.4目的基因的擴(kuò)增、克隆及鑒定PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；98℃10 s，（51℃～60℃）30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃終止反應(yīng)。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，與pMD18-T載體4℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)Amp+LB平板37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，PCR鑒定為陽(yáng)性后送Invitrogen公司測(cè)序。

1.5繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和相對(duì)定量檢測(cè)分別以目的基因和內(nèi)參基因的重組質(zhì)粒為模板以10倍梯度稀釋后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，獲得擴(kuò)增各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)溶解曲線分析擴(kuò)增的特異性、擴(kuò)增效率E值，并進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序：95℃30 s，95℃5 s，退火溫度34 s，退火延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行溶解曲線分析，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，以檢測(cè)各組織中Nalp3、MDA5、TLR7 mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

1.6數(shù)據(jù)分析采用相對(duì)比較Ct法（△△Ct）法分析相對(duì)定量結(jié)果。首先計(jì)算各組織樣品中目的基因與內(nèi)參基因Ct差值，然后以肌肉樣品為對(duì)照，通過(guò)相對(duì)Ct值（△△Ct）計(jì)算公式：△△Ct=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實(shí)驗(yàn)組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對(duì)照組，計(jì)算相對(duì)差異倍數(shù)，即QR=2-△△Ct，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2　結(jié)果

2.1總RNA提取及目的基因PCR擴(kuò)增的結(jié)果提取肝臟等組織總RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)期大小相符的單一擴(kuò)增條帶（如圖1所示），經(jīng)測(cè)序Nalp3大小為126 bp，MDA5為309 bp，TLR7為225 bp，通過(guò)BLAST檢索測(cè)序所得4個(gè)基因的序列均為雞相對(duì)應(yīng)的受體和內(nèi)參序列。

圖1　總RNA的提取及基因擴(kuò)增的結(jié)果

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物的特異性經(jīng)溶解曲線分析Nalp3，MDA5，TLR7和內(nèi)參基因β-actin的溶解溫度Tm分別是83～84之間，均成單峰，無(wú)引物二聚體或其他雜峰，表明特異性較好。

2.3目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率通過(guò)儀器分析軟件獲得目的基因及內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率 E值如下：ENalp3=110.385，EMDA5=103.087，ETLR7= 99.073，Eβ-actin=98.425，相應(yīng)的擴(kuò)增相關(guān)系數(shù)R2分別為0.987、0.990、0.995和0.997，表明Ct值與模板濃度的線性關(guān)系較好。

2.4Nalp3、MDA5、TLR7組織表達(dá)譜經(jīng)檢測(cè)Nalp3、MDA5、TLR7 mRNA在雞不同組織器官的表達(dá)譜，如圖4所示，相對(duì)肌肉組織，3種受體在心、肝、脾、肺和腎臟組織中表達(dá)變化較大，在心臟中未檢測(cè)到Nalp3和MDA5。此外，Nalp3在腎臟、肝臟中相對(duì)表達(dá)量較高（P＜0.05），TLR7在心、脾和肺臟中表達(dá)量相對(duì)較高（P＜0.05），而MDA5在各組織中表達(dá)量均較低。

3　討論

模式識(shí)別受體識(shí)別病原微生物的保守結(jié)構(gòu)，在抗病原感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TLR7主要識(shí)別經(jīng)過(guò)內(nèi)吞作用形成的病毒核酸成分。Cornelissen等發(fā)現(xiàn)，雞巨噬細(xì)胞中TLR7在H9N2亞型禽流感病毒感染初期顯著上調(diào)，而感染后期下降［8］。周作勇［9］和Mackinnon［10］分別報(bào)道了1日齡和2日齡雛雞TLR3、TLR7和TLR21等在不同組織中轉(zhuǎn)錄水平差異較大。

圖2　3種受體與內(nèi)參基因相對(duì)定量PCR擴(kuò)增的溶解曲線

圖3　基因擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4　Nalp3、MDA5和TLR7 mRNA在不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平

Gitlin等［11］證明，MDA5缺陷細(xì)胞在受到某些RNA病毒感染時(shí)，IFN-α和IFN-β產(chǎn)生的量明顯減少。關(guān)于禽類MDA5主要集中于雞和鵝［12］，Karpala等首次從雞體內(nèi)分離出MDA5基因，并發(fā)現(xiàn)MDA5在識(shí)別RNA病毒后可調(diào)節(jié)IFN-β的產(chǎn)生［13］。Nalp3通過(guò)識(shí)別流感病毒的RNA，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子如IL-1β和IL-18的釋放，在抗流感病毒和仙臺(tái)病毒（SeV）中發(fā)揮著重要的作用［5-6］。

本文建立了同時(shí)，檢測(cè)雞3種受體的相對(duì)RT-qPCR方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與雛雞［9-10］相似，MDA5、Nalp3和TLR7受體尤其是后兩者在青年雞各個(gè)組織中表達(dá)水平變化較大，提示3種受體在病原體識(shí)別過(guò)程中的相對(duì)作用可能不同。此外，在非病原體感染誘導(dǎo)情況下，這3種受體在同一組織中相對(duì)表達(dá)水平差異也較大，提示除識(shí)別病原體外，可能還擔(dān)負(fù)著其他功能，需進(jìn)一步探討。

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Tissue-sepecific mRNA Expression of Nalp3，MDA5 and TLR7 in Young Chicken

CHEN Hai-yun，JIA Li-juan，SHAN Wen-jie，YANG Xu，LIU Xue-lan

（College of Animal Science&Technology key laboratory of zoonoses，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

Innate immune receptor plays a major role in antiviral responses.Here，distributions of transcription of the pattern recognition receptors Nalp3，MDA5 and TLR7 in tissues were analyzed.The gene fragments of three receptor genes were amplified from young chicken livers with the specific primers.The quantitative real-time reverse transcription PCR（RT-qPCR）was established for the detection of the receptor mRNAS in different tissues of young chicken at the age of 18 weeks.The results showed that there were comparatively large differences in the transcription levels of three receptor mRNAS in different tissues.Nalp3 gene expression in the liver and kidney was relatively higher，and TLR7 expression in the heart，spleen and lung was relatively higher. However，MDA5 expression was very low in different tissues.Difference transcription levels of the three receptors may indicate that their differences reflect their relative roles in chicken.

immune receptors；mRNA transcription；RT-qPCR；tissue distribution

LIU Xue-lan

S852.4

A

0529-6005（2016）04-0019-03

2015-01-16

國(guó)家自然科學(xué)基金（31101846）

陳海云（1989-），男，碩士生，研究方向?yàn)閯?dòng)物微生物與免疫學(xué)，E-mail：602037349@qq.com

劉雪蘭，E-mail：liuxuelan@ahau.edu.cn