耿昕穎，王家禎，董文龍，單曉楓，馬紅霞，高云航

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118）

異育銀鯽嗜水氣單胞菌的分離鑒定與病理組織學(xué)觀察

耿昕穎，王家禎，董文龍，單曉楓，馬紅霞，高云航

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118）

為鑒定吉林省某養(yǎng)殖場所養(yǎng)殖異育銀鯽（carassius auratus gibelio）死亡原因，在瀕死魚的肝、胰、脾、腎臟分離得到一株優(yōu)勢菌，經(jīng)細(xì)菌形態(tài)、常規(guī)理化特性鑒定、人工感染試驗(yàn)、16S rRNA基因序列測定、病理解剖學(xué)及病理組織學(xué)觀察，結(jié)果表明：分離株為氣單胞菌屬的嗜水氣單胞菌，并將其命名為JL-PW-3。該分離株對(duì)環(huán)丙沙星、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素、氯霉素等高度敏感；對(duì)慶大霉素、阿米卡星、阿莫西林、阿奇霉素、紅霉素、恩諾沙星、磺胺間甲氧嘧啶等完全耐藥。

異育銀鯽；嗜水氣單胞菌；分離鑒定；病理學(xué)

異育銀鯽是由方正銀鯽為母本，以興國紅鯉為父本，經(jīng)人工繁育的子代，具有生長快、個(gè)體大、抗病性強(qiáng)等特點(diǎn)，是我國著名的淡水魚類之一［1］。幾年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，加之水體環(huán)境的惡化，各種病害不斷出現(xiàn)，給我國異育銀鯽的養(yǎng)殖帶來巨大危害，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

嗜水氣單胞菌在世界各地均有分布，是人獸共患的條件性致病菌［2-4］，并能夠引起多種淡水魚類大量死亡［5-6］，給我國整個(gè)水產(chǎn)行業(yè)都造成了巨大的損失。2013年吉林省某養(yǎng)殖場的異育銀鯽自然發(fā)病并出現(xiàn)大批量死亡，病魚的主要癥狀為眼部突出，嘴角、體表、鰭條基部出血，腹部腫脹，肛門紅腫、外凸，尾鰭出血、潰爛，嚴(yán)重病魚體表鱗片脫落。本試驗(yàn)從具有典型癥狀的鯽魚體內(nèi)分離出該致病菌，對(duì)其菌落形態(tài)、生理生化特性鑒定，結(jié)合分子生物學(xué)16S rRNA核苷酸同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育構(gòu)建樹對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)其所導(dǎo)致的病理學(xué)變化及藥敏性檢測進(jìn)行研究，以便為鯽魚的病害防治提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料

1.1病料來源及試驗(yàn)動(dòng)物吉林省某養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的異育銀鯽自然發(fā)病并出現(xiàn)大量死亡，體重200～250 g，癥狀表現(xiàn)為鰓和鰭條出血、充血，腹部腫脹，腸道充血并伴有腹水，疑似嗜水氣單胞菌感染。供感染的試驗(yàn)魚，購自吉林省某養(yǎng)殖場的健康異育銀鯽，體重60～70 g。

1.2培養(yǎng)基、主要試劑及藥品普通瓊脂培養(yǎng)基、細(xì)菌微量生化鑒定管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；甲醛、無水乙醇、二甲苯、石蠟、蘇木精染液，均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、強(qiáng)力霉素、阿莫西林、紅霉素、阿奇霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、氯霉素、磺胺間甲氧嘧啶，均由海洋醫(yī)化生物科技有限公司惠贈(zèng)。

2　方法

2.1病原菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察在無菌條件下取典型癥狀的病異育銀鯽，以肝、胰、脾、腎臟為樣本劃線接種于普通瓊脂固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h做細(xì)菌分離，待長出菌落后，挑取單個(gè)菌落獲取純培養(yǎng)物，制成涂片標(biāo)本，經(jīng)革蘭染色后，鏡檢細(xì)菌形態(tài)。

2.2生理生化反應(yīng)純化后的細(xì)菌經(jīng)30℃培養(yǎng)后分別接種微量生化反應(yīng)管，按說明書操作進(jìn)行。同時(shí)進(jìn)行精氨酸雙水解酶試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、M.R.試驗(yàn)、H2S固體穿刺試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、肌醇試驗(yàn)，30℃培養(yǎng)24～72 h，觀察并記錄結(jié)果。

2.3人工感染試驗(yàn)

2.3.1人工注射感染試驗(yàn)采用菌落計(jì)數(shù)法將已培養(yǎng)的菌液濃度稀釋為5個(gè)梯度：4.725×104、4.725× 105、4.725×106、4.725×107、4.725×108CFU/mL。試驗(yàn)選用暫養(yǎng)1周的健康異育銀鯽，菌液腹腔注射30尾魚，0.15 mL/尾；同時(shí)設(shè)立同劑量無菌生理鹽水作為試驗(yàn)對(duì)照組。每組試驗(yàn)魚隔離養(yǎng)于恒溫25℃玻璃缸中，正常飼養(yǎng)管理，連續(xù)觀察1周，并記錄其感染發(fā)病時(shí)間與死亡情況。

2.3.2人工再感染試驗(yàn)在人工感染患病瀕死的試驗(yàn)魚中，取臨床癥狀與自然患病瀕死魚癥狀相似的魚肝、脾、腎臟和腸道等組織進(jìn)行常規(guī)再分離，挑取與原人工感染試驗(yàn)菌落形態(tài)特征一致的單菌落，進(jìn)行人工再感染試驗(yàn)，觀察魚的活動(dòng)情況并作好記錄。

2.4病理學(xué)觀察對(duì)主要病/死異育銀鯽進(jìn)行臨床和主要病理變化的觀察。采集發(fā)病癥狀明顯異育銀鯽的肝、脾、腎、腸道等主要組織，10%甲醛進(jìn)行固定并對(duì)相應(yīng)的組織進(jìn)行常規(guī)的石蠟切片，常規(guī)H.E.染色，在顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。

2.516S rRNA基因序列測定將純化后的菌株接種于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)12 h后，提取細(xì)菌DNA。16S rRNA基因PCR擴(kuò)增引物分別為：TY-1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、TY-2：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，以細(xì)菌DNA為模板，TY-1/TY-2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。將PCR回收產(chǎn)物與pMD18T-載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并將陽性克隆送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序的結(jié)果利用NCBI BLAST軟件進(jìn)行序列比較分析。

2.6藥物敏感性試驗(yàn)參照CLSI推薦的微量肉湯稀釋法檢測分離株對(duì)慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、強(qiáng)力霉素、阿莫西林、紅霉素、阿奇霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、氯霉素、磺胺間甲氧嘧啶的MIC值，以大腸桿菌ATCC?25922作為質(zhì)控株，將培養(yǎng)物于30℃培養(yǎng)18～24 h觀察結(jié)果，結(jié)果遵循CLSI的臨界濃度作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

3　結(jié)果與分析

3.1細(xì)菌的分離及形態(tài)特性分離菌株在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上經(jīng)30℃恒溫培養(yǎng)24 h后菌落為圓形，中央隆起，邊緣整齊，半透明呈淺黃色，芳香味，無水溶性色素，生長豐盛（見前插彩版圖1）。在普通肉湯培養(yǎng)基中經(jīng)30℃恒溫培養(yǎng)24 h后呈均勻渾濁生長，管壁有菌膜，管底有菌體沉淀，搖晃時(shí)易碎呈線狀上升并消散。對(duì)分離純化單菌落進(jìn)行革蘭染色，在40倍顯微鏡下觀察，結(jié)果為革蘭陰性菌，短桿狀，兩端鈍圓或直平（見前插彩版圖2）。

3.2細(xì)菌的生理生化鑒定生理生化鑒定結(jié)果顯示，分離株發(fā)酵葡萄糖、L-阿拉伯糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇等，不發(fā)酵鼠李糖、木糖。精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫氫酶、鳥氨酸脫氫酶、VP試驗(yàn)、M.R.試驗(yàn)、氧化酶、H2S固體穿刺試驗(yàn)均為陽性，吲哚試驗(yàn)、肌醇為陰性。

3.3人工注射感染試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1人工注射感染對(duì)從病魚分離出來的菌株進(jìn)行人工懸菌液感染試驗(yàn)，結(jié)果不同接菌濃度出現(xiàn)不同程度的死亡，當(dāng)菌液濃度為4.725×108CFU/mL時(shí)，試驗(yàn)組異育銀鯽在96 h內(nèi)全部死亡，而對(duì)照組在試驗(yàn)觀察期內(nèi)則未出現(xiàn)任何死亡現(xiàn)象（表1）。

表1　菌株人工注射感染鯽魚

3.3.2人工注射再感染試驗(yàn)在試驗(yàn)瀕死魚的肝、脾、腎、腸道中經(jīng)常規(guī)分離培養(yǎng)可分別得到與病原菌一致的菌株，經(jīng)再次感染又可分離到與病原菌一致的菌株，說明分離得到的菌株為魚的致病菌。

3.4病理學(xué)觀察結(jié)果

3.4.1臨床癥狀和剖檢變化癥狀主要表現(xiàn)為病魚口腔、頭部、眼眶、鰓蓋邊緣、鰭條基部及魚尾邊緣充血，腹部腫脹，肛門紅腫，剖檢后發(fā)現(xiàn)魚鰓充血、出血，腹腔內(nèi)有大量淡黃色積液，腸道充血發(fā)紅，肝胰臟顏色變淺，脾、腎顏色加深等癥狀。

3.4.2病理組織切片觀察結(jié)果與健康魚腸道相比較，感染魚腸絨毛崩解，腸腔內(nèi)充滿壞死的細(xì)胞碎片，腸黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死脫落，杯狀上皮細(xì)胞增多，固有層和黏膜下層毛細(xì)血管擴(kuò)張、淤血，有少量的炎性細(xì)胞和血細(xì)胞浸潤，腸肌纖維扭曲紊亂，加粗水腫（見前插彩版圖3）。

與健康魚肝臟相比較，病魚肝組織中央靜脈擴(kuò)張并有大量血細(xì)胞，肝細(xì)胞腫脹，局部有空泡，肝竇擴(kuò)張、淤血，其內(nèi)充滿完全溶解的紅細(xì)胞，少量魚肝組織可見局灶性壞死，尚未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重病變魚含有雙核細(xì)胞（見前插彩版圖4）。

與健康魚腎臟相比較，感染魚腎臟失去原有的組織結(jié)構(gòu)，崩潰解體，有大面積的壞死細(xì)胞，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，排序紊亂，嚴(yán)重區(qū)域腎小球崩解、壞死，血管球腫脹，毛細(xì)血管擴(kuò)張，可見較多被H.E.染色成棕黃色樣色素沉著（見前插彩版圖5）。

與健康魚相比較，感染魚充血，脾髓充滿紅細(xì)胞，脾臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，崩潰解體，有大量空泡樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核破裂溶解，脾小體結(jié)構(gòu)不清，嚴(yán)重區(qū)域可見大量被H.E.染色成棕黃色血源性色素沉著（見中插彩版圖6）。

3.516S rRNA基因序列測定及同源性分析PCR擴(kuò)增出1 450 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致（如圖7）。將測序結(jié)果與GenBank上已發(fā)表的幾株嗜水氣單胞菌的16S rRNA序列進(jìn)行同源性分析，該菌與GenBank所發(fā)表的嗜水氣單胞菌的16S rRNA同源性最高，達(dá)到了99%。

圖7　分離菌株J L-PW-3的PCR擴(kuò)增

3.6藥物敏感性試驗(yàn)在本試驗(yàn)中采用微量肉湯稀釋法來測定分離株的藥物敏感性，結(jié)果如表2所示。

4　討論

圖8　菌株J L-PW-3 16S rRNA基因序列發(fā)育樹

表2　11種抗菌藥物對(duì)分離株的MIC

嗜水氣單胞菌對(duì)淡水魚具有強(qiáng)致病性，祖國掌等報(bào)道了安徽省草魚細(xì)菌性敗血癥的主要致病菌為嗜水氣單胞菌，造成了魚類大量死亡［7］。王友娟等［8］在遼寧地區(qū)發(fā)現(xiàn)51株嗜水氣單胞菌引起淡水魚致病死亡，其中有24株以全身出血為主要癥狀，17株可引起魚體表潰爛，腹部腫脹，由此可見，不同地區(qū)嗜水氣單胞菌均會(huì)給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成不同程度的危害。本研究通過病理組織學(xué)觀察可發(fā)現(xiàn)，病死魚主要病理變化為全身各細(xì)胞腫脹，壞死脫落，特別是肝，脾，腎，腸道病變較為嚴(yán)重，導(dǎo)致體內(nèi)鈉、鉀代謝平衡失調(diào)，所以腹水嚴(yán)重，管腔變窄，導(dǎo)致血流發(fā)生障礙，致使循環(huán)血量降低，血流量減少，大量紅細(xì)胞侵潤，周圍淋巴細(xì)胞減少造成了魚體自身免疫力下降，加速了試驗(yàn)魚的死亡，腸肌纖維紊亂、扭曲成空泡樣結(jié)構(gòu)，嚴(yán)重影響了腸道消化吸收功能，從而導(dǎo)致異育銀鯽攝食量減少。本試驗(yàn)已證實(shí)造成異育銀鯽死亡的致病菌為嗜水氣單胞菌，其預(yù)防及防治措施還有待進(jìn)一步研究和探索。

Vivekanandhan等［9］利用15種抗生素對(duì)315株嗜水氣單胞菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果表明，對(duì)多粘霉素B，萬古霉素，利福平等7種抗菌藥物產(chǎn)生了高度耐藥性，且出現(xiàn)不同程度的多重耐藥。目前我國水產(chǎn)疫苗相對(duì)較少，抗菌藥物仍是治療嗜水氣單胞菌的主要方法，但藥物使用過多、濫用，導(dǎo)致抗藥性的菌株不斷增多。本試驗(yàn)采用了11種抗生素對(duì)分離的致病株JL-PW-3進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果該菌對(duì)8種抗生素等具有耐藥性，從耐藥性結(jié)果來看，該菌的耐藥性不容樂觀，可能與耐藥性的直接和間接傳播有關(guān)，后續(xù)可對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)一步的研究。洪經(jīng)等［10］對(duì)國內(nèi)不同地區(qū)40株嗜水氣單胞菌進(jìn)行耐藥機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌耐藥情況嚴(yán)重，且多重耐藥普遍抗菌藥物的過多使用會(huì)導(dǎo)致魚類致病菌出現(xiàn)更多的耐藥情況，導(dǎo)致想要獲得良好的治療效果需結(jié)合有效的藥敏試驗(yàn)科學(xué)、合理的用藥。

［1］沈懷舜，楊官品，許璞.異育銀鯽準(zhǔn)回交世代經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)勢的遺傳基礎(chǔ)研究［J］.中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，35（2）：219-214.

［2］Khushiranabi R，Girisha S K，Bhowmick P P.Prevalence of different outer membra-ne proteins in isolates of Aeromonas species［J］.Word Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，24：2263-2268.

［3］李鵬，陶茂暉，李曉云，等.雛雞嗜水氣單胞菌感染的診斷［J］.畜牧與獸醫(yī)，2005，37（6）：36-37.

［4］劉堂水，汪成竹，陳昌福.斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)菌性病原的分離與鑒定［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25（5）：550-554.

［5］周飛，劉娟，黎德兵.黃鱔嗜水氣單胞菌的分離鑒定及中藥體外抑菌效果研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（2）：135-137.

［6］孟彥，肖漢兵，張林，等.施氏鱘出血性敗血癥病原菌的分離和鑒定［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（6）：822-826.

［7］祖國掌，余為一，李槿年.草魚細(xì)菌性敗血癥的診斷及流行病學(xué)調(diào)查［J］.淡水漁業(yè)，2000，30（5）：35-37.

［8］王友娟，李榮峰，李華，等.遼寧地區(qū)養(yǎng)殖淡水魚感染嗜水氣單胞菌的流行病學(xué)調(diào)查［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2012，14（4）：128-134.

［9］Vivekanandhan G，Savithamani K，Hatha AAM，et al.Antibiotic resistance of Aeromorras hydrophila isolated form marketed fish and prawn of South India［J］.Food Microbiol，2002，76（1/2）：165-168.

［10］洪經(jīng)，潘連德.魚源嗜水氣單胞菌質(zhì)粒的指紋圖譜及其與耐藥性的關(guān)系［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2010，34（12）：1908-1915.

Isolation and Identification ofAeromonas hydrophliaand histopathological examination

GENG Xin-ying，WANG Jia-zhen，DONG Wen-long，SHAN Xiao-feng，MA Hong-xia，GAO Yun-hang
（College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

In order to identify the cause of death of carassius auratus gibelio in farms in Jilin Province，a dominant bacterium was isolated from liver，hepatopancreas，spleen and kidney in dying fish.All the results of morphological observation，physical and biochemical identification assays，artificial infection test，determination of 16S rRNA gene sequences and pathological and histological observation conformed that this bacterium was Aeromonas hydrophlia，named as JL-PW-1.This isolate was highly sensitive to ciprofloxacin，florfenicol，doxycycline，and chloramphenicol，but completely resistant to gentamicin，amikacin，amoxicillin，azithromycin，erythromycin，enrof-loxacin，sulfamono methoxine and other drugs.

carassius auratus gibelio；Aeromonas hydrophlia；isolated identification；pathology

GAO Yun-hang

S943

A

0529-6005（2016）04-0109-03

2015-03-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201927）；吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20150204065NY）

耿昕穎（1993-），女，碩士生，研究方向?yàn)閯?dòng)物疫病防治，E-mail：1160455285@qq.com

高云航，E-mail：gaoyunhang@163.com