張振東，王廣文，胡東方，牛玉娟，張民霞，呂傳位，呂　林，張清林，肖一紅，劉思當(dāng)

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271000；2.泰山職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物系，山東 泰安 271000）

一起綿羊偽狂犬病的發(fā)生及病毒gE基因的序列變異分析

張振東1，王廣文1，胡東方1，牛玉娟1，張民霞1，呂傳位1，呂林1，張清林2，肖一紅1，劉思當(dāng)1

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271000；2.泰山職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物系，山東 泰安 271000）

為了確診一起綿羊偽狂犬病的發(fā)生，采集送檢病羊的皮膚、脾臟、淋巴結(jié)、腦等組織器官進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病毒分離和PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，病料中擴(kuò)增出了偽狂犬病病毒的特異性gE基因片段。結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查、病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室診斷，確定引起此次疫情的病原為偽狂犬病病毒。為了進(jìn)一步了解此次疫情中PRV gE基因的分子特征，特對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序分析。遺傳進(jìn)化分析表明，該分離株與亞洲各分離株處于同一分支，基因同源性高達(dá)98.4%-99.4%，與歐洲、美洲分離株同源性相對(duì)較遠(yuǎn)，分別為97.0%-97.2%、97.2%-97.3%；gE蛋白氨基酸序列分析顯示，該分離株在gE蛋白的第48位和第492位各存在1個(gè)天冬氨酸的插入，與我國(guó)當(dāng)前流行的偽狂犬變異株相同，同時(shí)在當(dāng)前豬偽狂犬病病毒變異株基礎(chǔ)上又出現(xiàn)了新氨基酸位點(diǎn)的變異，如L49P、P160T、V406G、G445R，其分子生物學(xué)特性有待進(jìn)一步的研究。本文通過綜合診斷確定該病由偽狂犬病病毒引起，為我國(guó)綿羊偽狂犬病的流行病學(xué)分析及防控提供了重要的理論依據(jù)。

綿羊偽狂犬??；濟(jì)寧；gE；分離鑒定；遺傳變異

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病病毒（PRV）引起的一種急性熱性傳染病，病毒主要侵害家畜以及各種野生哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)，患病動(dòng)物主要表現(xiàn)為發(fā)熱、奇癢（豬除外）和腦脊髓炎等癥狀。該病于1813年于美國(guó)牛群首次被發(fā)現(xiàn)，我國(guó)在1948年首次報(bào)道該病［1］。近年來，伴隨著豬偽狂犬病的流行及肉羊養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，PR在羊群中的發(fā)病情況日益嚴(yán)重，特別是發(fā)病豬場(chǎng)周圍的羊群時(shí)有發(fā)病死亡的情況，起初多為零星散發(fā)，往往得不到足夠地重視，以致后來造成羊群大面積發(fā)病，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。2014年2月18日，山東濟(jì)寧地區(qū)某綿羊場(chǎng)發(fā)生偽狂犬病疑似病例，前來就診，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、癥狀觀察、病理剖檢及實(shí)驗(yàn)室綜合診斷，最終確診為羊偽狂犬病。隨后及時(shí)采取了綜合防控措施，使疫情得到了及時(shí)有效的控制，避免了更大的經(jīng)濟(jì)損失。

1　背景調(diào)查

該養(yǎng)殖場(chǎng)存養(yǎng)綿羊220只，近兩年來羊場(chǎng)無較大疫情發(fā)生。但于2014年2月15日下午突然出現(xiàn)2只病羊，表現(xiàn)為精神沉郁，離群站立，體溫升高至41℃以上，呼吸加快，食欲減退，不食，未引起畜主的注意，但未采取任何防控措施。2月16日早上，2只病羊均已死亡，發(fā)現(xiàn)鼻端、唇部發(fā)生水腫，口腔有泡沫樣唾液，皮膚存在擦傷，體側(cè)部被毛脫落。畜主將病死羊掩埋處理后，用20%石灰水對(duì)羊舍進(jìn)行噴灑消毒。2月18日上午，羊群又突然出現(xiàn)死羊1只，病羊2只，病羊表現(xiàn)不安、站立不穩(wěn)、偏向一側(cè)、倒地橫臥，經(jīng)?？幸Оl(fā)癢部位，皮膚破潰出血。畜主將病羊隔離治療，注射安痛定、頭孢噻呋鈉等藥物，但病羊在當(dāng)天先后死亡。并且羊群中陸續(xù)出現(xiàn)病羊，故帶病羊前來就診。

畜主介紹：羊場(chǎng)已經(jīng)營(yíng)3年，從未出現(xiàn)過類似病情，現(xiàn)今羊群發(fā)病率已超過30%，死亡率幾乎100%。該羊場(chǎng)周邊豬場(chǎng)較多且養(yǎng)豬密度大，附近豬場(chǎng)近段時(shí)間內(nèi)母豬群繁殖障礙的比例較高，母豬流產(chǎn)及產(chǎn)死胎現(xiàn)象嚴(yán)重。

2　病理剖檢

在做好人員防護(hù)措施的情況下對(duì)畜主送檢的兩只病羊進(jìn)行了剖檢。剖檢發(fā)現(xiàn)，兩只病羊的各內(nèi)臟器官僅見輕微眼觀病變，臉部皮下水腫有膠胨樣物質(zhì)沉積，腹部皮膚有擦傷、充血、出血，氣管內(nèi)有泡沫性黏液，肺臟水腫、充血，腦膜充血、水腫。

3　實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1病毒分離采集皮膚、肝、脾及淋巴結(jié)等組織器官，按常規(guī)方法勻漿，反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心30 min，將上清液經(jīng)0.22 μm濾器過濾后接種于鋪滿單層的Vero細(xì)胞，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察有無細(xì)胞病變，將培養(yǎng)96 h的細(xì)胞瓶取出，經(jīng)-20℃冰箱反復(fù)凍融3次后，收獲Vero細(xì)胞及上清，于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

3.2PCR檢測(cè)根據(jù)GenBank上公布的參考序列設(shè)計(jì)綿羊PRV gE基因的特異性擴(kuò)增引物，擴(kuò)增片段為2 060 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用北京全式金生物技術(shù)有限公司DNA/RNA Kit試劑盒提取細(xì)胞上清液偽狂犬病病毒DNA，取3 μL作為模板，反應(yīng)體系為TaKaRa Taq 0.2 μL，2×GC Buffer 10 μL，2.5 mmol/mL dNTPs 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，加Nucleasefree water至25 μL，混勻；擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，68℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃保溫。

4　結(jié)果

根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢變化以及實(shí)驗(yàn)室診斷，最終確定導(dǎo)致該場(chǎng)綿羊發(fā)病的病原為偽狂犬病病毒，可能由周邊豬場(chǎng)豬源偽狂犬病病毒傳播而來。通過及時(shí)采取撲殺消毒、緊急免疫、防止繼發(fā)感染等綜合措施［2-3］，疫情得到了有效控制，避免了更大的經(jīng)濟(jì)損失。

圖1　細(xì)胞上清液PRV gE擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

5　序列分析

為了更深入地了解引起此次疫情的PRV的分子特征，特對(duì)PCR擴(kuò)增出的gE基因目的片段進(jìn)行了連接、轉(zhuǎn)化和測(cè)序。

5.1PRV gE基因遺傳進(jìn)化分析對(duì)該綿羊偽狂犬病分離株序列分析表明，gE基因全長(zhǎng)為1 740 bp（去除PCR擴(kuò)增產(chǎn)物兩端的多余序列），編碼580個(gè)氨基酸。其與亞洲各分離株處于同一分支，基因同源性高達(dá)98.4%～99.4%，而與歐洲、美洲分離株同源性相對(duì)較遠(yuǎn)，分別為97.0～97.2%、97.2～97.3%（圖2）。

5.2gE基因氨基酸位點(diǎn)差異分析氨基酸差異位點(diǎn)分析，該綿羊偽狂犬病病毒分離株與亞洲豬源偽狂犬病病毒分離株基本上完全一致，在氨基酸位點(diǎn)的48位和496～497位上分別出現(xiàn)了一個(gè)天冬氨酸（D）的插入（表1，2），另外，還出現(xiàn)了新的氨基酸變異點(diǎn)，如L49P，P160T，V406G，G445R。

6　討論

有關(guān)羊偽狂犬病的病例以前鮮有報(bào)道，但最近12年內(nèi)該病的發(fā)病率明顯提高［3］，張克山、張文花等專家學(xué)者對(duì)此病例也進(jìn)行了報(bào)道分析［4-5］。近年來，豬偽狂犬病暴發(fā)流行，童光志等已發(fā)現(xiàn)偽狂犬病病毒全基因組和編碼蛋白的氨基酸序列發(fā)生了明顯變異［6］，趙鴻遠(yuǎn)等［7］的研究也表明，2012后我國(guó)流行的偽狂犬病病毒以變異株為主，變異株之間具有相同的分子特征，即在gE蛋白的第48位和第492位各有1個(gè)天冬氨酸的插入。該綿羊偽狂犬病病毒分離株在gE蛋白相應(yīng)位點(diǎn)也存在同樣的插入，說明此次在綿羊偽狂犬病疫情是由偽狂犬病變異株引起的，基因同源性高達(dá)98.4%～99.4%。該羊場(chǎng)周邊豬場(chǎng)較多，豬場(chǎng)較為密集，且豬場(chǎng)近段時(shí)間內(nèi)母豬產(chǎn)死胎及弱胎的現(xiàn)象嚴(yán)重，這些都進(jìn)一步地證明該偽狂犬病病毒分離株極有可能是由豬傳染給了綿羊。

圖2　gE基因氨基酸序列遺傳進(jìn)化分析

表1　該綿羊分離株與世界各國(guó)豬源偽狂犬病病毒gE氨基酸位點(diǎn)差異分析

表2　該綿羊分離株與世界各國(guó)豬源偽狂犬病病毒gE氨基酸位點(diǎn)差異分析

我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)均使用Bratha-k61疫苗來免疫偽狂犬病，長(zhǎng)期以來起到了良好的預(yù)防效果［8-9］。對(duì)于該病多發(fā)區(qū)疫苗免疫仍是防控羊偽狂犬病最為有效的方法，同時(shí)也建議羊場(chǎng)采取以下防控措施：第一：興建羊場(chǎng)時(shí)，盡量遠(yuǎn)離豬場(chǎng)、牛場(chǎng)；第二：控制傳染源，嚴(yán)禁從患偽狂犬病的地區(qū)引進(jìn)羔羊及種羊，加強(qiáng)對(duì)精液的管理；第三：加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提倡自繁自養(yǎng)，引種時(shí)嚴(yán)格檢疫，提高羊群對(duì)該病的抵抗力；第四：加大羊場(chǎng)的衛(wèi)生消毒力度、做好滅鼠工作，切斷該病在易感動(dòng)物間的傳播。

另外，對(duì)gE蛋白氨基酸差異位點(diǎn)分析，該綿羊分離株與亞洲豬源偽狂犬病病毒變異株幾乎完全一致，但又出現(xiàn)了新的氨基酸變異點(diǎn)：L49P，P160T，V406G，G445R。由于GenBank上沒有羊源偽狂犬病的gE基因序列，這些氨基酸位點(diǎn)的變異是否與病毒的宿主特性、毒力等相關(guān)，有待進(jìn)一步的研究。

［1］衛(wèi)廣森.獸醫(yī)全攻略-羊病學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002：116-119.

［2］趙云俠，付艷紅，郭百超.綿羊偽狂犬病的診治［J］.當(dāng)代畜牧，2013，03：27.

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［5］張文花，和國(guó)忠，和仕良，等.高海拔地區(qū)綿羊及牧羊犬偽狂犬病的防制［J］.云南畜牧獸醫(yī)，2011，02：19.

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TheOccurrenceof Sheep Pseudorabies and Variation Analysis of theGlycoprotein E Geneof theVirus

ZHANG Zhen-dong1，WANG Guang-wen1，HU Dong-fang1，NIU Yu-juan1，ZHANG Min-xia1，LV Chuan-wei1，LV Lin1，ZHANG Qing-lin2，XIAO Yi-hong1，LIU Si-dang1
（1.Animal Science and Technology of Shandong Agricultural University，Tai’an 271000，China；2.Biology Department of Taishan Polytechnic，Tai’an 271000，China）

To diagnose a suspected sheep pseudorabies case，pathologic autopsy was performed and tissues of the sheep were collected for virus isolation and identification using PCR.PRV was amplified from the tissues and its infection was confirmed.In order to further understand the molecule characteristic of the gE gene，the 1740-bp DNA fragment of gE gene was amplified，cloned and sequenced.Phylogenetic analysis showed that the sheep PRV isolate shared 98.4%to 99.4%sequence identity with all kinds of isolates from Asia，and shared 97.0%to 97.2%and 97.2%to 97.3%sequence identity with Europe and American isolates，respectively.The alignment results revealed that the isolate had the same sequence features with two insertions of Asp at sites of 48 and 492 comparing with the PRVs isolated from the modern prevalent mutations.Besides，four new amino acid sites emerged，and they were L49P，P160T，V406G and G445R compared with the prevalent mutated strains of swine PR.This study provides an useful information for the molecular epidemiology，prevention and control of sheep PRV in China.

sheep pseudorabies virus；Jining；gE；isolation and identification；sequence variation

LIU Si-dang

S852.65+5

A

0529-6005（2016）04-0046-03

2014-12-19

山東省牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助（SDAIT-12-011-04）

張振東（1990-），男，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物臨床病理學(xué)研究，E-mail：zhangzhend90@126.com

王廣文（1989-），男，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物臨床病理學(xué)研究，E-mail：1126255119@qq.com

注：王廣文與李振東對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)

劉思當(dāng)，E-mail：liusid@sdau.edu.cn