王　棟，張煥容，張　冰，岳　華，湯　承

（西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 610041）

鴨IL-8 mRNA定量檢測方法的建立及應(yīng)用

王棟，張煥容，張冰，岳華，湯承

（西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 610041）

為檢測鴨IL-8細胞因子表達，設(shè)計鴨IL-8基因特異性引物，以鴨組織總RNA為模板，建立了鴨IL-8 SYBR Green I熒光定量RT-PCR（RRT-PCR）方法，應(yīng)用該法檢測了基因A型鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus genotype A，DHAV-A）弱毒疫苗免疫SPF雛鴨肝、脾和腦組織中鴨IL-8 mRNA的動態(tài)表達。結(jié)果鴨IL-8基因RRT-PCR擴增標準曲線相關(guān)系數(shù)0.993，溶解曲線呈特異性單峰，線性范圍10-2～10-9，Ct值范圍7.81～30.71，最低檢測量99.17 copies/μL，擴增效率1.08，組內(nèi)和組間變異系數(shù)范圍分別為0.67%～0.94%和0.96%～1.27%；鴨IL-8 mRNA在免疫鴨肝、脾和腦組織表達水平分別在第3天、第5天和第2天時間點達峰值，分別為對照組的2.75、35.29倍和10.79倍（P＜0.01）。本試驗建立的鴨IL-8 RRT-PCR特異、敏感、穩(wěn)定，能夠快速、準確檢測鴨體內(nèi)IL-8細胞因子的表達水平。

鴨IL-8；熒光定量RT-PCR；基因A型鴨甲肝病毒；SPF雛鴨；弱毒疫苗

急性鴨病毒性肝炎（Duck viral hepatitis，DVH）是由鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus，DHAV）引起的一種高度致死性傳染?。?］。DHAV主要感染4周齡以內(nèi)的雛鴨［2］。Wang等［3］根據(jù)DHAV基因結(jié)構(gòu)差異將其分為基因A型（DHAV-A）、B型和C型。DHAV-A 1945年首次報道于紐約長島的北京鴨雛鴨上［4］。DHAV-A 1963年在中國出現(xiàn)，直到1984年才確認其病原［5］。

疫苗免疫為當前防制DVH最有效的方法，免疫后細胞因子的表達可作為評價疫苗刺激機體先天性免疫的指標之一［6］。細胞因子在抗感染、抗腫瘤、抗排斥反應(yīng)、自身免疫疾病治療以及機體造血等方面都具有重要作用［7］。白介素8（Interleukin-8，IL-8）是一種重要的細胞因子，也稱為趨化因子，其在抗感染、抗腫瘤、抗毒素及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［8-9］。傳統(tǒng)的細胞因子檢測方法存在敏感性低、穩(wěn)定性差、耗時長等不足［10-11］。RRT-PCR具有快速、準確和高效等優(yōu)點，可用于檢測鴨在注射疫苗、免疫增強劑以及感染某種疾病等情況下體內(nèi)細胞因子mRNA的表達水平。本試驗建立基于SYBR Green I的鴨IL-8 mRNA RRT-PCR方法，用于檢測DHAV-A免疫鴨的IL-8 mRNA表達，為實踐中鴨感染或免疫機制研究提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1毒株和實驗動物DHAV-A弱毒株（MY株，TCID50=10-5.60/100 μL），由西南民族大學動物醫(yī)學實驗室保存；SPF鴨胚，購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，自行孵化。

1.2主要試劑TRIZol?試劑，購自Invitrogen公司；PrimescriptTMRT、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒，購自TaKaRa公司；ABI PRISM 7300 Real-Time PCR System為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.3鴨IL-8 mRNA RRT-PCR方法的建立

1.3.1引物信息根據(jù)GenBank登錄的鴨IL-8基因序列（AB236334）設(shè)計并合成IL-8引物，根據(jù)參考文獻合成DHAV-A、β-actin引物（見表1）。

1.3.2鴨IL-8 mRNA RRT-PCR陽性模板的制備

TRIZol?試劑提取鴨組織總RNA并PrimescriptTMRT合成cDNA，以合成的cDNA為模板擴增鴨IL-8基因。PCR產(chǎn)物電泳檢測后回收純化克隆至pMD19-T載體中，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，增菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，陽性重組質(zhì)粒經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測定量后作為陽性模板。

1.3.3鴨IL-8 mRNA RRT-PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化及標準曲線的建立以鴨IL-8陽性質(zhì)粒作為模板，優(yōu)化鴨IL-8 mRNA RRT-PCR反應(yīng)體系和條件。將已知濃度的陽性質(zhì)粒從101～101010倍梯度稀釋，每個稀釋度3個平行，按照優(yōu)化的反應(yīng)體系和條件進行RRT-PCR，以Ct值為縱坐標，以稀釋倍數(shù)的對數(shù)為橫坐標，建立標準曲線。

1.3.4重復性評價對3個不同的cDNA樣本在同一次擴增中進行3次重復測定，分別計算相同樣品各反應(yīng)管之間的組內(nèi)變異系數(shù)；對上述樣品檢測后-20℃保存，連續(xù)3 d每天復檢1次，計算同一樣品每次檢測結(jié)果之間的組間變異系數(shù)。

表1　熒光定量RT-PCR方法的引物序列信息

1.4鴨IL-8 mRNA RRT-PCR方法的應(yīng)用

1.4.1SPF雛鴨免疫與樣品采集48只5日齡SPF雛鴨隨機分成試驗組和對照組，各24只，試驗組每只雛鴨腿部肌肉注射0.5 mL 10 000倍TCID50DHAV-A MY株，對照組每只相同途徑注射0.5 mL無菌生理鹽水。于注射后0.25、0.5、1、2、3 d和5 d各組分別用戊巴比妥鈉麻醉4只雛鴨，采取雛鴨肝、脾和腦組織。

1.4.2鴨組織總RNA提取和cDNA合成按照TRIZol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的具體方法和步驟提取鴨肝、脾和腦組織中總RNA并合成cDNA。

1.4.3組織樣品的檢測與數(shù)據(jù)處理用建立的鴨IL-8 mRNA RRT-PCR方法檢測鴨IL-8 mRNA表達，用文獻報道的DHAV-A RRT-PCR方法［12］檢測DHAV-A增殖，以β-actin為內(nèi)參［13］分析鴨IL-8 mRNA和DHAV-A相對表達量，以對照組鴨肝、脾和腦組織總RNA為對照樣品，每個樣品進行3次重復檢測。使用Applied Biosystem熒光定量PCR儀7300型中的系統(tǒng)軟件分析RRT-PCR Ct值，利用2-△△CT法進行相對定量分析。

2　結(jié)果

2.1鴨IL-8目的基因片段PCR擴增結(jié)果經(jīng)RT-PCR擴增在195 bp位置出現(xiàn)特異性電泳條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖1）。

2.2鴨IL-8 mRNA RRT-PCR方法的建立

2.2.1溶解曲線、擴增曲線和標準曲線標準陽性質(zhì)粒RRT-PCR產(chǎn)物只有1個特異性峰，無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物，溶解溫度Tm=83.75℃± 0.55℃，該方法的線性范圍是103～1010倍稀釋的陽性質(zhì)粒，Ct值范圍7.81～30.71，相關(guān)系數(shù)0.993，回歸方程Y=-3.152χ+40.132，該方法的最低檢測量99.17copies/μL，擴增效率為1.08。

圖1　鴨IL-8基因片段PCR電泳結(jié)果

2.2.2鴨IL-8 mRNA RRT-PCR方法的重復性

RRT-PCR方法組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)范圍分別為0.67%～0.94%和0.96%～1.27%。表明本方法重復性好，從而保證了同一批次試驗及不同批次試驗間所得數(shù)據(jù)的可比性，結(jié)果見表2。

2.3雛鴨免疫DHAV-A弱毒疫苗后組織中IL-8 mRNA的表達量和疫苗毒的荷載量SPF雛鴨接種疫苗后肝、脾和腦組織中IL-8 mRNA的表達見圖2。肝組織中IL-8 mRNA表達量在0.25 d～5 d時分別是對照組的0.54、0.80、0.98、0.14、2.75倍和1.67倍，在3 d時達到峰值，是對照組的2.75倍（P＜0.01）。脾組織中IL-8 mRNA的表達量在0.25 d～5 d時分別是對照組的1.26、0.12、0.96、6.56、6.14倍和35.29倍，在5 d時表達量達到最高，為對照組的35.29倍（P＜0.01）。腦組織中IL-8 mRNA的表達量在0.25 d～5 d時分別是對照組的0.56、1.15、4.30、10.79、0.17倍和4.93倍，在2 d時表達量達到峰值，是對照組的10.79倍（P＜0.01）。

表2　鴨IL-8 RRT-PCR方法的重復性

圖2　DHAV-A弱毒疫苗免疫SPF雛鴨后不同時間點肝、脾和腦組織中IL-8 mRNA的表達水平 （※P＜0.01）

DHAV-A弱毒疫苗免疫SPF雛鴨后不同時間點肝、脾和腦組織中DHAV-A量見圖3。從0.25 d～5 d，肝組織中病毒量分別是對照組的1.28、1.77、4.41、280.14、32.00倍和26.72倍；脾臟中分別是對照組的1.11、1.28、2.30、22.91、86.61倍和46.76倍；腦組織中分別是對照組的1.07、1.19、1.88、4.40、3.30倍和2.10倍。肝和腦組織中病毒荷載量在2 d達到最高值，分別是280.1倍（P＜0.01）和4.40倍（P＜0.01）；脾臟中病毒荷載量在第3天達到最高，為對照的86.6倍（P＜0.01）。

圖3　DHAV-A弱毒疫苗免疫SPF雛鴨后不同時間點肝臟、脾臟和腦組織中DHAV-A載量 （※※P＜0.01）

3　討論

IL-8在抗感染和免疫調(diào)節(jié)方面具有重要作用，同時也是一種重要的趨化因子［15］。本試驗中選用SYBR Green I作為熒光染料建立了檢測鴨IL-8 mRNA的RRT-PCR，SYBR Green I熒光染料通用性好，能與所有雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生熒光信號，靈敏度高，通過特異性引物的擴增，把非特異性降到最低，為鴨組織中的IL-8 mRNA的檢測提供了可靠的方法。為了去除不同樣本在RNA產(chǎn)量、質(zhì)量以及逆轉(zhuǎn)錄效率上存在的差別，本試驗以表達相對恒定的內(nèi)參基因β-actin［13］對檢測結(jié)果進行了標化，準確檢測了DHAV-A弱毒疫苗免疫后IL-8 mRNA和病毒的增殖情況。

隨著DHAV-A在SPF雛鴨組織中增殖，IL-8 mRNA表達量也逐漸升高，因此，DHAV-A MY株弱毒疫苗有效刺激了IL-8 mRNA的表達。但肝臟中DHAV-A荷載量最高的2 d時間點，IL-8 mRNA的表達卻最低，隨后肝組織中IL-8顯著表達，這有利于清除該組織中的DHAV-A病毒，達到保護機體的作用；脾臟中DHAV-A荷載量3 d時達到峰值，顯著低于肝組織中病毒的表達量，病毒在脾臟中的復制明顯低于肝臟，可能由于脾臟作為機體主要的免疫器官，病毒的增殖受到了抑制，免疫后的2～5 d，脾臟中IL-8 mRNA持續(xù)高表達，同樣有利于疫苗病毒的清除；腦組織中DHAV-A荷載量顯著低于肝和脾，這可能是由于病毒難以突破血腦屏障，但腦組織中IL-8 mRNA表達量比肝組織略高，有利于清除病毒。張盼濤等［15］成功建立了鴨IFN-γ和IL-2 mRNA熒光定量RT-PCR方法，并用該方法檢測了不同佐劑禽流感滅活疫苗免疫櫻桃谷鴨后脾臟組織中IFN-γ和IL-2 mRNA的相對表達量。與該方法相類似，本試驗建立的鴨IL-8 RRT-PCR方法可以靈敏、特異、快速地在mRNA水平上定量檢測鴨免疫DHAV-A弱毒疫苗后組織中IL-8 mRNA的表達水平，為檢測鴨IL-8細胞因子mRNA表達提供了可靠的方法。

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中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（2014ZYXS53，2014NZYQN58）；四川省教育廳創(chuàng)新團隊項目（13TD0057）

王棟（1988-），男，碩士生，研究方向為動物傳染病診斷與防控，E-mail：758619856@qq.com

張煥容，E-mail：zhrong05@163.com