趙光偉，陸　維，楊曉偉

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物疾病快速診斷中心，重慶 榮昌 402460）

鴨疫里默菌與大腸桿菌混合感染的診治

趙光偉，陸維，楊曉偉

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物疾病快速診斷中心，重慶 榮昌 402460）

2014年6月，四川省宜賓市某鴨場(chǎng)30日齡鴨發(fā)生一起以典型的心包炎、肝周炎、氣囊炎為特征的傳染病，經(jīng)臨床觀察和實(shí)驗(yàn)室診斷，確診為鴨疫里默菌與大腸桿菌混合感染。報(bào)告如下。

1　發(fā)病情況及病理變化

四川省宜賓市某鴨場(chǎng)飼養(yǎng)了3 000羽雛鴨，30日齡時(shí)有600多羽雛鴨出現(xiàn)精神委靡，食欲不振，腿軟，不愿走動(dòng)，拉黃白痢，瀕死前出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，頭頸震顫。發(fā)病后1周內(nèi)死亡率約為21%。病死鴨剖檢可見(jiàn)：氣囊增厚，表面被覆有纖維素性滲出物，呈灰白色；心包膜變厚，表面有纖維素性滲出物，心包液增量，呈淡黃色；肝臟腫大、質(zhì)地脆弱，被膜增厚，表面的纖維素膜較厚，呈灰白色，易剝離；腦膜水腫、充血和出血，腎臟病變不明顯。

2　實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1細(xì)菌分離取病死鴨腦組織，接種于巧克力培養(yǎng)基，于37℃溫箱有氧條件下和蠟燭罐培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落形態(tài)，挑選典型菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，并染色鏡檢。在巧克力培養(yǎng)基上長(zhǎng)出一大一小的兩種菌落，其中小的菌落暫命名為A菌，其表面光滑、稍突起、圓形、濕潤(rùn)、呈露珠狀，直徑1～1.5 mm。大的菌落暫命名為B菌，呈圓形凸起、光滑、濕潤(rùn)、半透明、灰白色菌落，直徑2～3 mm；分別從兩種菌中挑取單個(gè)菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37℃條件下以120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h獲得純培養(yǎng)物。將純培養(yǎng)物涂片，經(jīng)革蘭染色后，鏡檢，可見(jiàn)A菌為革蘭陰性小桿菌，B菌為革蘭陰性粗短桿菌。挑取A、B兩種菌分別接種于麥康凱瓊脂平板，A菌接種后不生長(zhǎng)，B菌能形成紅色菌落。

2.2生化鑒定對(duì)A、B兩種菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。其中A菌不發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖，不產(chǎn)生硫化氫和吲哚，V-P試驗(yàn)和M.R.試驗(yàn)均為陰性，觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，尿素酶試驗(yàn)陽(yáng)性，不液化明膠，無(wú)運(yùn)動(dòng)力，枸櫞酸鹽試驗(yàn)陰性，這些生化特征均與鴨疫里默菌相符；B菌可發(fā)酵麥芽糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇等多種糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，M.R.試驗(yàn)陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)和枸櫞酸鹽試驗(yàn)陰性，不產(chǎn)生硫化氫，吲哚和甲基紅試驗(yàn)均為陽(yáng)性，這些生化特性均與大腸桿菌相符。

表1　分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3PCR鑒定

2.3.1引物參照覃宗華等［1］的方法合成3條特異性引物，其中1條共用引物（RAE-CFOR）位于鴨疫里默菌和大腸桿菌16S rRNA基因中均保守的區(qū)域，另2條（RA-REV和EC-REV）則在各自種內(nèi)保守而種間不同的區(qū)域。RAEC-FOR與ECREV擴(kuò)增大腸桿菌特異性片段，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為718 bp。RAEC-FOR與RA-REV擴(kuò)增鴨疫里默菌特異性片段，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為354 bp。引物序列如下。

RAEGFOR：5′-ACGTCATCCCACCTTCCTC-3′；

RA-REV：5′-GTTCAGACTAAGCGAAAG-3′；

EC-REV：5′-TCATTGACGTTACCCGCA-3′。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

2.3.2PCR擴(kuò)增配制2個(gè)50 μL的反應(yīng)體系，其中Premix TaqTM（含TaKaRa Ex Taq1.25 U、dNTPs各0.4 mmol/L、4 mmol/L Mg2+）25 μL；引物RAECFOR（100 μmol/L）1 μL、RA-REV（50 μmol/L）1 μL、EC-REV（50 μmol/L）1 μL；在第1個(gè)體系加2 μL A菌純培養(yǎng)物，第2個(gè)體系加2 μL B菌純培養(yǎng)物；然后加滅菌雙蒸水補(bǔ)足50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照（見(jiàn)圖1）。結(jié)果A菌與B菌所擴(kuò)增的片段與陽(yáng)性對(duì)照大小一致。

圖1　分離菌PCR電泳結(jié)果

2.4藥敏試驗(yàn)取分離純化的鴨疫里默菌和大腸桿菌分別按K.B紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，敏感性的判斷參考動(dòng)物微生物實(shí)驗(yàn)教程［2］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離的鴨疫里默菌對(duì)克拉霉素、頭孢拉定、呋喃妥因、氧氟沙星高度敏感；對(duì)環(huán)丙沙星、氨芐青霉素、恩諾沙星、頭孢唑林、氯霉素、多粘菌素B、紅霉素中度敏感；對(duì)復(fù)方新諾明、慶大霉素、諾氟沙星、卡那霉素、頭孢噻肟、頭孢西丁、新霉素、青霉素G、鏈霉素耐藥。所分離的大腸桿菌對(duì)氨芐青霉素、慶大霉素、氧氟沙星、頭孢噻肟高度敏感；對(duì)卡那霉素、復(fù)方新諾明、頭孢西丁、多粘菌素B、呋喃妥因、克拉霉素中度敏感；而對(duì)鏈霉素、氯霉素、新霉素、頭孢唑林、諾氟沙星、頭孢拉定、環(huán)丙沙星、青霉素G、紅霉素、恩諾沙星不敏感。結(jié)果如表2所示。

表2　分離菌藥敏試驗(yàn)

3　診斷

根據(jù)臨床癥狀、剖檢病理變化、細(xì)菌形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化鑒定試驗(yàn)以及PCR鑒定綜合判斷，引起該場(chǎng)鴨群發(fā)病的病原為鴨疫里默菌與大腸桿菌混合感染。藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氧氟沙星對(duì)兩個(gè)病原均高度敏感。

4　治療

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，病鴨每羽肌肉注射3萬(wàn)IU頭孢氨芐，以氧氟沙星（50 mg/羽）飲水并添加禽用多維等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，連用3 d。同時(shí)做好鴨舍及用具的消毒工作，消毒前清掃鴨舍和運(yùn)動(dòng)場(chǎng)地，每天消毒1次，連續(xù)3 d。經(jīng)治療，鴨群精神狀況轉(zhuǎn)好，采食量增加，至第7天鴨群完全康復(fù)。

5　小結(jié)

由于發(fā)病前期氣溫變化較大，對(duì)鴨群是一應(yīng)激過(guò)程，易導(dǎo)致鴨疫里默菌與大腸桿菌混合感染的發(fā)生。因此要加強(qiáng)管理，做好雛鴨的保溫工作，同時(shí)注意通風(fēng)換氣，再以配合飼料進(jìn)行飼養(yǎng)。鴨舍及周圍環(huán)境的消毒工作也要重視，在每日早晚清掃糞便后可進(jìn)行帶鴨消毒。平時(shí)多觀察鴨的精神狀態(tài)，一旦發(fā)現(xiàn)腿軟、少食，應(yīng)馬上隔離治療，避免擴(kuò)大到全群。

［4］覃宗華，蔡建平，呂敏娜，等.鴨疫里默氏菌病和大腸桿菌病鑒別診斷雙重PCR方法的建立和應(yīng)用［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（4）：517-521.

［5］沙莎，宋振輝.動(dòng)物微生物實(shí)驗(yàn)教程［M］.重慶：西南師范大學(xué)出版社，2011：65-68.

S858.32

B

0529-6005（2016）04-0057-02

2014-12-04

趙光偉（1979-），男，副教授，博士，從事動(dòng)物疾病的快速診斷工作，E-mail：zhaoguangwei@swu.edu.cn