王新增， 任 重， 宋 穎， 吳忠偉

（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，浙江 臺州 318000）

偶聯(lián)試劑SMCC的一鍋法合成

王新增， 任 重， 宋 穎， 吳忠偉

（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，浙江 臺州 318000）

SMCC是一類含有N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）活性酯和馬來酰亞胺的雙功能偶聯(lián)劑，可以分別將含有巰基和氨基的化合物鍵接在一起，在生物及化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。本文采用一鍋法將反式氨甲環(huán)酸、馬來酸酐在 DMF作溶劑的條件下反應(yīng)生成反式氨甲環(huán)酸的馬來酰胺，再與三氟乙酸酐、N-羥基丁二酰亞胺、三甲基吡啶等反應(yīng)生成SMCC，對合成SMCC的工藝進行了簡單優(yōu)化，得出了最佳合成條件，總收率可達92%，純度可達99%以上。

SMCC；一鍋法；合成；偶聯(lián)試劑

SMCC（琥珀酰亞胺4-（N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己胺-1-羧酸）是一類含有N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）活性酯和馬來酰亞胺的雙功能偶聯(lián)劑，可以分別將含有巰基和氨基的化合物鍵接在一起，可作為鏈接子將抗體與毒素分子連接起來，在免疫實驗、腫瘤成像的放射性標記中廣泛應(yīng)用［1-2］，其最早由Yoshitake及其團隊合成出［3］，以氨甲環(huán)酸為原料，與馬來酸酐反應(yīng)生成氨甲環(huán)酸的馬來酰胺，在乙酸酐及醋酸鈉作用下環(huán)合，與N-羥基丁二酰亞胺經(jīng)酯化反應(yīng)得到SMCC，收率僅21%。1991年，Nielsen 和 Buchardt報道了一鍋法合成SMCC的方法［4］，氨甲環(huán)酸與馬來酸酐反應(yīng)生成氨甲環(huán)酸的馬來酰胺，然后再加入DCC和NHS，反應(yīng)完后經(jīng)提取濃縮結(jié)晶得到SMCC，收率75%，Paterson 和 Eggleston 采用TFA-NHS作為酯化試劑，合成出SMCC，馬來酸酐與氨甲環(huán)酸反應(yīng)生成氨甲環(huán)酸的馬來酰胺，然后一鍋環(huán)合酯化生成SMCC，此方法得到的SMCC收率為89%［5］，但需要分離出氨甲環(huán)酸的馬來酰胺， TFA-NHS試劑在使用之前需要單獨配制好，操作步驟較繁瑣。Nicholas 和 Jarmila在對SMCC的合成優(yōu)化過程中［6］，發(fā)現(xiàn)采用TFA-NHS試劑能有效地促進羧酸轉(zhuǎn)化為丁二酰亞胺酯及馬來酸環(huán)合轉(zhuǎn)化為馬來酰亞胺，采用一鍋法反應(yīng)后，水洗及乙醚打漿后，可以分離得到SMCC，總收率超過90%。

本文采用Nicholas和 Jarmila所述的方法，一鍋法反應(yīng)生成SMCC，然后水洗，濃縮，得到SMCC固體后，用二氯甲烷和正庚烷重結(jié)晶得到SMCC，收率92%，純度大于99%。

1 實驗

1.1 主要儀器及試劑

Bruker 400兆核磁共振儀，Bruker microTOF-QII質(zhì)譜儀，BRUKER VECTOR22紅外光譜儀，SHIMADZU UV240PC紫外光譜儀。

反式氨甲環(huán)酸，常州市尚科醫(yī)藥化工材料有限公司；馬來酸酐，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；2,4,6-三甲基吡啶，Alfar Aesar試劑公司；三氟乙酸酐，上海億日化工科技有限公司；N-羥基丁二酰亞胺，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 合成方法

往2L四口圓底燒瓶中加入15.72 g（100 mmol）反式氨甲環(huán)酸、9.80 g（100 mmol）馬來酸酐，加入500 mL DMF，室溫攪拌6 h，在攪拌過程中，溶液逐漸變澄清。然后將反應(yīng)液用冰鹽浴冷卻至0～-5℃，用100 mL滴液漏斗將27.8 mL（210 mmol）2,4,6-三甲基吡啶加入至反應(yīng)液中，滴加過程保持反應(yīng)液溫度在0～-5℃，再另一1 000 mL四口燒瓶中，加入46g（400 mmol）N-羥基丁二酰亞胺、500 mL DMF，攪拌，冰鹽浴冷卻至0～-5℃之間，量取55.6 mL（400 mmol）三氟乙酸酐，通過滴液漏斗滴加至1 000 mL燒瓶中，滴加過程保持溫度在0～-5℃，滴加完畢后，此溫度下攪拌反應(yīng)10 min，再量取2,4,6-三甲基吡啶52.8 mL（400 mmol），通過滴液漏斗滴加到1 000 mL燒瓶反應(yīng)液中，攪拌10 min，將1 000 mL燒瓶中液體慢慢加入到2L燒瓶中，保持兩燒瓶中液體溫度在0～-5℃，1～2 h內(nèi)加完，加完后，撤去冰鹽浴，室溫攪拌過夜，反應(yīng)混合物用600 mL二氯甲烷稀釋，冰水浴冷卻，加入1N鹽酸500 mL，分去上層水相，下層有機層再用1N鹽酸500 mL洗滌二次，有機相用無水硫酸鎂干燥，過濾，濾液濃縮至干，得到固體約33 g，用250 mL二氯甲烷溶解，在布氏漏斗上面墊約2 cm厚的硅膠，將SMCC二氯甲烷溶液過濾，濾液攪拌下加入500 mL的正庚烷，析出白色固體，過濾，真空干燥得到SMCC純品約31.0 g，收率92%。

1H-NMR（ CDCl3）δ：1.05 （ m, 2H）；1. 39（ m, 2H）；1. 59 （ m, 1 H）；1. 63（ m, 2H）；2.01（ m, 2 H）；2. 10～2. 33（ m, 4H）；2. 67（ m, 1H）；2.80（ s, 4H） Hz）；3. 27（ d, 2 H, J=6.93）；7. 00 （s, 2H），13C-NMR：δ25.89，28.26，29.5，36.15，39.91，43.22，134.83，170.65，171.30，171.70. MS：m/z=335.1241 ［M+H］+。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)方程式

圖1 合成SMCC的反應(yīng)方程式

圖2 SMCC合成反應(yīng)機理圖

試劑和條件，i）馬來酸酐，DMF，室溫，6 h；ii）三氟乙酸酐4eq，N-羥基丁二酰亞胺4eq，2,4,6-三甲基吡啶6.1eq，DMF，0℃到室溫

該反應(yīng)機理為氨甲環(huán)酸與馬來酸酐先反應(yīng)生成氨甲環(huán)酸的馬來酰胺，然后與TFA-NHS作用，生成酯化中間態(tài)5，5在TFA-NHS作用下環(huán)合，得到SMCC，在氨甲環(huán)酸的馬來酰胺與TFA-NHS反應(yīng)時，也會有副產(chǎn)物4生成，4不能轉(zhuǎn)化為SMCC。

2.2 滴加NHS-TFA溶液溫度對反應(yīng)的影響

如果酯化反應(yīng)溫度過高，或者滴加速度太快，則會生成副產(chǎn)物4，而4不能轉(zhuǎn)化為SMCC，溫度低可以抑制此副反應(yīng)，在0℃幾乎沒有該副產(chǎn)物，因此，在滴加TFA-NHS試劑時，反應(yīng)溫度為0℃左右，滴加速度要慢，滴加速度快，溫度高。生成的副產(chǎn)物多，得到的產(chǎn)物較難以提純純化。

2.3 反應(yīng)配比對產(chǎn)率的影響（NHS-TFA）配比對反應(yīng)影響

該反應(yīng)根據(jù)反應(yīng)機理，先是氨甲環(huán)酸與馬來酸酐1∶1的反應(yīng)生成氨甲環(huán)酸的馬來酰胺， TFAA與NHS反應(yīng)定量生成TFA-NHS，TFAA與NHS配比為1∶1，在TFA-NHS和2,4,6-三甲基吡啶作用下，然后得到SMCC。分別考察了TFA-NHS、2,4,6-三甲基吡啶與氨甲環(huán)酸配比對收率的影響，結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3 TFA-NHS與氨甲環(huán)酸配比對收率的影響

圖4 2,4,6-三甲基吡啶配比對收率的影響

根據(jù)上述數(shù)據(jù)，NHS-TFA與氨甲環(huán)酸配比為4，2,4,6-三甲基吡啶為 6當(dāng)量時，收率最高。因此選擇配比為氨甲環(huán)酸∶馬來酸酐∶TFA-NHS/2,4,6-三甲基吡啶=1∶4∶6。

2.4 反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)化率的影響

隨著反應(yīng)時間增加，產(chǎn)率逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)10 h后，轉(zhuǎn)化率不再增加，此時反應(yīng)完全。反應(yīng)時間選擇10 h。

優(yōu)化后的工藝為：反應(yīng)物配比為馬來酸酐/反式氨甲環(huán)酸∶TFAA/NHS∶2,4,6-三甲基吡啶=1∶4∶4∶6，反應(yīng)時間為10 h。滴加TFA-NHS時的溫度為0℃。

圖5 反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)化率的影響

3 結(jié)論

以反式氨甲環(huán)酸、N-羥基丁二酰亞胺、馬來酸酐為原料，一鍋法合成出SMCC，對合成工藝進行了優(yōu)化，收率達92%，產(chǎn)物純度99%以上，操作簡單，收率高。采用質(zhì)譜及1H-NMR和13C-NMR對SMCC結(jié)構(gòu)進行了表征。反應(yīng)物配比為馬來酸酐/反式氨甲環(huán)酸∶TFAA/NHS∶2,4,6-三甲基吡啶=1∶4∶4∶6，反應(yīng)時間為10 h，滴加TFA-NHS時的溫度為0℃。

［1］ Bieniarz C, Husain M, Barnes G, et al. Extended length heterobifunctional coupling agents for protein conjugations［J］. Bioconjugate Chem, 1996, 7（1）: 88-95.

［2］ Shreve P, Aisen A M. Monoclonal antibodies labeled with polymeric paramagnetic ion chelates［J］. Magn Reson Med, 1986（3）: 336-340.

［3］ Yoshitake S, Yamada Y, Ishikawa E, et al. Conjugation of glucose oxidase from Aspergillus niger and rabbit antibodies using N-hydroxysuccinimide ester of N-（4-carboxycyclohexylmethyl）-maleimide［J］. Eur J Biochem, 1979, 101（2）: 395-399.

［4］ Nielsen O, Buchardt O. Facile synthesis of reagents containing a terminal maleimido ligand linked to an active ester［J］. Synthesis, 1991（10）: 819-821.

［5］ Paterson M J, Eggleston I M. Convenient preparation of N-maleoyl amino acid succinimido esters using N-trifluoroacetoxysuccinimide［J］. Syn Comm. 2008, 38（2）: 303-308.

［6］ Nicholas M Leonard, Jarmila Brunckova. In situ formation of N-trifluoroacetoxy succinimide （TFA-NHS）: one-pot formation of succinimidyl esters, N-trifluoroacetyl amino acidsuccinimidyl esters, and N-maleoyl amino acid succinimidyl esters［J］. The Journal of Organic Chemistry, 2011, 76（21）: 9169-9174.

One-pot Synthesis of Conjugate Agent Succinimidyl-4-（N-maleimidomethyl）cyclohexane-1 -carboxylate （SMCC）

WANG Xin-zeng, REN Zhong, SONG Ying, WU Zhong-wei
（Zhe Jiang Hisun Pharmaceutical CO., LTD. Taizhou, 318000 China）

SMCC was used as a heterobifunctional linker, containing N-hydroxy succinimidyl active ester and maleimide，could crosslink amino group and mercapto group, had found utility in numerous areas of chemistry and biotechnogoly. SMCC was synthesized by one-pot with trans-4-（aminomethyl）cyclohexane carboxylic acid, maleic anhydride to give maleamino of trans-4-（aminomethyl）cyclohexane carboxylic acid, then reactived with N-hydroxysuccinimide, trifluoroacetic anhydride and sym-collidine to yield SMCC. The syntheisis process of SMCC was optimized. And the better process parameters was got, the yield was about 92%，the purity was beyond 99%.

SMCC； one-pot synthesis； conjugate agent

TQ421.2

A

1009-220X（2016）05-0050-04

10.16560/j.cnki.gzhx.20160514

2016-05-27

王新增（1976～），男，浙江臺州人，碩士；主要從事藥物合成的研究。xzwang@hisunpharm.com