高海燕

（內(nèi)蒙古產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010070）

GC-QQQ頂空進(jìn)樣法測(cè)定牛乳中香蘭素

高海燕

（內(nèi)蒙古產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010070）

應(yīng)用三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-QQQ）技術(shù)建立了牛乳中香蘭素定量分析方法，以乙醚為萃取劑直接提取樣品中的香蘭素，濃縮乙醇定容后頂空進(jìn)樣法排除牛奶中乳脂等成分的干擾，通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)樣品中香蘭素進(jìn)行測(cè)定，效果良好。方法定量限0.02 mg/kg（S/N=3），加標(biāo)濃度為0.2 mg/kg時(shí)，回收率79.1%～86.2%，RSD值3.3%，線性范圍0.1～4.0 mg/L（R2=0.999 8）。該法具有樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，適用于牛乳中香蘭素的測(cè)定及其他樣品中香蘭素的快速定性。

GC-QQQ；頂空；牛乳；香蘭素

香蘭素（Vanillin）即4-羥基-3-甲氧基苯甲醛（4-hydroxy-3-methoxybenzal-dehyde），又稱香草醛（Vanillic aldehyde），白色針狀結(jié)晶，有芳香氣味。香蘭素是從大型蘭科植物香莢蘭的種子中提取出來(lái)的物質(zhì)［1］，是第1種人工合成香精，且合成工藝簡(jiǎn)單、原料成本較低［2］，目前的主要合成方法有酶合成法、微生物發(fā)酵法和植物細(xì)胞培養(yǎng)法［3］。因乙基香蘭素的香味比等量的香蘭素強(qiáng)且能持久留香，香蘭素往往搭配乙基香蘭素使用，搭配比例約為3∶1［4］。根據(jù)GB 2760—2011食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)的要求，凡使用范圍涵蓋0～6個(gè)月嬰幼兒配方食品，禁止添加任何食用香料。目前，尚缺乏嬰幼兒配方食品中香蘭素的官方檢測(cè)方法，因此建立一種香蘭素的快速定性檢測(cè)方法對(duì)食品品質(zhì)的控制十分重要。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定方法有高效液相色譜法、氣相色譜［5-6］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［7-8］、紫外分光光度法［9］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。本文通過(guò)優(yōu)化樣品的測(cè)試條件，簡(jiǎn)化前處理過(guò)程，建立了頂空進(jìn)樣結(jié)合GC-QQQ/MRM測(cè)定牛乳中香蘭素的方法，以期為嬰幼兒食品安全質(zhì)量監(jiān)控、保證牛乳品質(zhì)和人體健康提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)方法

Agilent 7000-7890A型三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀；Agilent 7697型頂空自動(dòng)進(jìn)樣器；恒溫水浴鍋；電子分析天平；香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%，CAS No. 121-33-5），環(huán)境保護(hù)部環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)研究所提供；無(wú)水乙醇、乙醚（色譜純）；無(wú)水硫酸鈉（分析純）。

稱取10 g乳樣于帶蓋離心管中，用60 mL乙醚分3次萃?。?0，20，10 mL），合并乙醚層，經(jīng)高溫活化后的無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾，濃縮（控制速度以防香蘭素?fù)p失），乙醇定容至2 mL，于10 mL頂空進(jìn)樣品瓶中供GC-QQQ分析測(cè)定。

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制。準(zhǔn)確稱取香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品，用無(wú)水乙醇配制成質(zhì)量濃度1 000 mg/L的香蘭素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制。吸取0.1 mL香蘭素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用無(wú)水乙醇定容至10 mL，得到10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液。

分別吸取0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，4.0 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液并以無(wú)水乙醇定容至10 mL，得到香蘭素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，4.0 mg/L。

（1）頂空條件。平衡時(shí)間30 min，加熱箱溫度60℃，定量環(huán)溫度70℃，傳輸線溫度90℃。

（2）氣相色譜條件。色譜柱0.25 mm×30 m× 0.25 μm，HP-5ms型；載氣：氦氣（純度不低于99.999%）；恒流流速1.0 mL/min，分流比2∶1；進(jìn)樣口溫度250℃；升溫程序：70℃保持4.5 min，以5℃/min升到160℃，再以30℃/min升到250℃，保持5 min。

（3）質(zhì)譜條件。電子轟擊EI離子源，離子源溫度250℃；四級(jí)桿1溫度150℃；四級(jí)桿2溫度150℃；電離電壓70 eV；電子倍增器電壓1 200 V；接口溫度280℃；自動(dòng)調(diào)諧；溶劑延遲10 min。

通過(guò)MS1 Scan全掃描模式獲得總離子流圖，根據(jù)Scan條件下香草醛的保留時(shí)間及相應(yīng)的質(zhì)譜圖，確定子離子并進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能，最后確定MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1.1 母離子的確定

采用GC-QQQ對(duì)香蘭素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行MS1 Scan模式全掃描，掃描范圍35～200 u，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定性確定分析。

香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品全掃描色譜見(jiàn)圖1，香蘭素全掃描質(zhì)譜見(jiàn)圖2。

圖1 香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品全掃描色譜

由圖1可知，采用GC-QQQ對(duì)香蘭素進(jìn)行測(cè)定，香蘭素保留時(shí)間為18.747 min，色譜圖中無(wú)其他雜峰。由圖2可知，通過(guò)MS1 Scan全掃描香蘭素豐度最大的離子峰質(zhì)荷比為151（152）m/z。

質(zhì)譜圖匹配結(jié)果見(jiàn)表1。

圖2 香蘭素全掃描質(zhì)譜

表1 質(zhì)譜圖匹配結(jié)果

由表1可知，最佳匹配化合物為香蘭素，匹配度為96.71%。

NIST譜庫(kù)中香蘭素全掃描質(zhì)譜見(jiàn)圖3。

圖3 NIST譜庫(kù)中香蘭素全掃描質(zhì)譜

由圖3可知，與試驗(yàn)中香蘭素全掃描質(zhì)譜圖一致。綜合MS1 Scan全掃試驗(yàn)及譜庫(kù)檢索結(jié)果確定，產(chǎn)物離子掃描母離子質(zhì)荷比為152 m/z。

2.1.2 產(chǎn)物離子的確定

設(shè)定母離子質(zhì)荷比為152 m/z，設(shè)置不同的碰撞能，對(duì)其產(chǎn)物離子進(jìn)行掃描。

產(chǎn)物離子掃描色譜見(jiàn)圖4，產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜見(jiàn)圖5。

經(jīng)過(guò)對(duì)所有產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖的分析，選擇豐度高的特征子離子作為MRM方法的子離子，確定產(chǎn)物離子質(zhì)荷比為81，108 m/z。

2.1.3 MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件的確定

確定特征離子對(duì)（母離子→子離子）后分別設(shè)定不同碰撞能運(yùn)行序列，優(yōu)化每個(gè)離子對(duì)的最優(yōu)碰撞能量，最后使用優(yōu)化的碰撞能量，離子源參數(shù)保持不變，建立MRM方法。

圖4 產(chǎn)物離子掃描色譜

圖5 產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜

香蘭素MRM掃描參數(shù)見(jiàn)表2，香蘭素多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描色譜見(jiàn)圖6，香蘭素多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描定量及定性離子對(duì)見(jiàn)圖7。

表2 香蘭素MRM掃描參數(shù)

圖6 香蘭素多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描色譜

圖7 香蘭素多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描定量及定性離子對(duì)

取0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，4.0 mg/L香蘭素系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，自動(dòng)進(jìn)樣體積1 μL，每次進(jìn)樣前用溶劑清洗進(jìn)樣針6次，按照上述分析條件通過(guò)GC-QQQ/MRM進(jìn)行定量測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、計(jì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

香蘭素標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖8。

圖8 香蘭素標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=387.684 843X+16.257 187，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。以S/N=3確定本方法的檢出限，得到香蘭素的檢出限為0.02 mg/kg。

稱取空白樣品6份，每份10.0 g，對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)定。

加標(biāo)回收試驗(yàn)（n=6）見(jiàn)表3。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)（n=6）

由表3可知，添加水平為0.2 mg/kg時(shí)香蘭素的加標(biāo)回收率在79.1%～86.2%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%（n=6），滿足試驗(yàn)要求。

利用有機(jī)溶劑直接提取牛乳中香蘭素會(huì)將乳脂等其他復(fù)雜成分同時(shí)提取出來(lái)，乳脂成分的沸點(diǎn)極高，提取液不能直接進(jìn)氣相及相關(guān)儀器進(jìn)行分析。若同時(shí)去除乳脂等復(fù)雜成分的方法操作較為繁瑣，處理時(shí)間較長(zhǎng)，容易造成樣品損失。本研究中利用乙醚對(duì)樣品進(jìn)行3次提取，直接利用頂空進(jìn)樣器進(jìn)樣，不但操作步驟簡(jiǎn)單、處理時(shí)間短，且能高效去除其他復(fù)雜成分的干擾，減少對(duì)儀器的污染，不但能夠提高檢測(cè)效率，同時(shí)減少操作人員接觸有機(jī)試劑的時(shí)間，從而降低風(fēng)險(xiǎn)。試驗(yàn)證明，該法操作簡(jiǎn)單，適用于香蘭素的日常檢測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)等大批量快速檢測(cè)及定性判斷。

3 結(jié)論

本文建立了牛乳基質(zhì)中香蘭素的GC-QQQ多反應(yīng)監(jiān)測(cè)測(cè)定方法，可大大簡(jiǎn)化樣品前處理操作過(guò)程，二級(jí)篩查及頂空進(jìn)樣方式有效消除復(fù)雜基質(zhì)的干擾，具有定性準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便快速、分離度高等特點(diǎn)，是牛乳中香蘭素含量快速測(cè)定及大批量樣品中香蘭素定性的較好方法。同時(shí)，由于香蘭素具有一定的揮發(fā)性，利用頂空進(jìn)樣的優(yōu)勢(shì)及GC-QQQ定性的準(zhǔn)確性可實(shí)現(xiàn)其他樣品直接上樣的香蘭素快速定性分析方法。

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A method for the determination of vanillin in milk powder by triple quad gas chromatography is developed.The sample is extracted with diethyl ether，concentrated，dissolved in ethyl alcohol，headspace sampled for eliminating consideration of butterfat，determined by MRM.The detection limit is 0.02 mg/kg（S/N=3） .The average recoveries range from 79.1%～86.2%with the relative standard deviations 3.3%.It shows good linearity over the range assayed 0.1～4.0 mg/L（R2=0.999 8）.The method is suitable for determination of vanillin in milk and quick qualitative analysis.

GC-QQQ；headspace sampling；milk；vanillin

1671-9646（2016）09a-0043-03

O657

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.09.015

2016-06-09

高海燕（1987— ），女，碩士，工程師，研究方向?yàn)楫a(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)與研究。