朱 玲　陳 強　龔金秋　曾 杰　胡 男　王水蓮

（湖南農(nóng)業(yè)大學，湖南長沙　410128）

不同轉(zhuǎn)染試劑對大鼠原代間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)染效率的比較分析

朱 玲陳 強龔金秋曾 杰胡 男王水蓮

（湖南農(nóng)業(yè)大學，湖南長沙410128）

目的:為了比較不同轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率，本實驗以大白鼠原代細胞為模型比較了兩種不同轉(zhuǎn)染試劑的效果。方法: 以pEGFP為報告基因，用兩種轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染大鼠睪丸間質(zhì)細胞，用熒光顯微鏡觀察，分析兩種轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率。結果:在質(zhì)粒為0.75μg和lipofectamine3000為0.75μl情況下，lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染效率最高（P＜0.05），lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染效率高于lipofectamine LTX。結論:與lipofectamine LTX相比，lipofectamine3000具有轉(zhuǎn)染效率高、劑量低和操作方便的優(yōu)點。

大鼠睪丸間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)染EGFP

睪丸間質(zhì)細胞成群分布在曲細精管的疏松結締組織中。從青春期開始，睪丸間質(zhì)細胞受垂體前葉嗜堿性細胞分泌的黃體生成素作用下能合成并分泌雄性激素。外源基因?qū)爰毎Ｓ棉D(zhuǎn)染的方法中應用較多的包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法和點穿孔法等。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對于儀器試劑操作要求低，是針對一般細胞轉(zhuǎn)染應用最多的轉(zhuǎn)染方法。本研究以間質(zhì)細胞為模型，用二種不同轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染，分析轉(zhuǎn)染效率，可為研究間質(zhì)細胞分泌睪酮的機制提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1試劑與動物

含GFP基因的PEGFP-N1質(zhì)粒（由華中農(nóng)業(yè)大學提供），opti-MEM、lipofectamine LTX和lipofectamine 3000試劑，膠原酶Ⅳ、DMEM高糖和四季青血清，3β-HSD染色液（實驗室保存）。

實驗動物：8周齡雄性SD大白鼠（湖南斯萊克景達動物有限公司）

1.2方法

1.2.1實驗分組與處理

將大鼠睪丸間質(zhì)細胞隨機分組，即lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染組（添加質(zhì)粒和lipofectamine LTX，用A表示）、lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染組（添加質(zhì)粒和lipofectamine 3000，用B表示）。A組依質(zhì)粒劑量與轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine LTX劑量分為A1組（0.8 μg：1 μl）、A2組（0.8 μg：2 μl）、A3組（0.8μg：3 μl）、A4組（1.0 μg：1 μl）、A5組（1.0 μg：2 μl）、A6組（1.0 μg：3 μl）、A7組（1.2 μg：1 μl）、A1組（1.2 μg：2 μl）、A1組（1.2 μg：3 μl），B組依質(zhì)粒劑量轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 3000劑量分為B1組（0.5 μg：0.75 μl）、B2組（0.75 μg：0.75 μl）、B3組（1.0 μg：0.75 μl）、B4組（0.5 μg：1.5 μl）、B5組（0.75μg：1.5 μl）、B6組（1.0 μg：1.5 μl）。

1.2.2間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化與效率的比較

（1）間質(zhì)細胞提取傳代

依照膠原酶濃度差異法[3］提取間質(zhì)細胞培養(yǎng)，間質(zhì)細胞傳代2次，胰酶消化后以2×105個/孔的密度接種到24孔細胞培養(yǎng)板中，細胞密度達70%-80%時轉(zhuǎn)染備用。

（2）試劑轉(zhuǎn)染

Lipofectamine LTX試劑不同劑量的質(zhì)粒溶解到50 μlopti-MEM中，加入1 uLlipofectamine Plus，各組不同劑量的lipofectamine LTX試劑溶解50 μlopti-MEM中，室溫靜置5 min，將兩種溶液混合，室溫靜置25 min，加入到含有500 μl無血清和雙抗的培養(yǎng)基的24孔板中，6 h后用含有血清培養(yǎng)基換液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用倒置熒光顯微鏡照相并分析。同時，用lipofectamine 3000進行轉(zhuǎn)染，各組質(zhì)粒溶解到25 μlopti-MEM溶液中，加入1 μl P 3000，各組不同劑量lipofectamine 3000溶解于25 uLopti-MEM中，將兩種溶液混合，室溫靜置5 min，加入到500 μl含有血清和雙抗的培養(yǎng)基的24孔細胞培養(yǎng)板中，48 h后用倒置熒光顯微鏡照相與并分析。

2　結果與分析

2.1lipofectamine LTX與lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)細胞條件的優(yōu)化

本研究結果表明lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染試劑中A5組轉(zhuǎn)染效率最高，高于A6組和A8組轉(zhuǎn)染效率且差異顯著（P＜0.05），A2組高于A3組轉(zhuǎn)染效率且差異顯著（P＜0.05），A7組高于A9組轉(zhuǎn)染效率且差異顯著（P＜0.05），其他組別相比差異不顯著（P＞0.05）（表1）。lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑中B2組轉(zhuǎn)染效率最高，高于B3組和B5組轉(zhuǎn)染效率且差異顯著（P＜0.05），B1組高于B4組轉(zhuǎn)染效率且差異顯著（P＜0.05）（表2）。

表1 不同劑量pEGFP和lipofectamineLTX轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)細胞后48 h的細胞轉(zhuǎn)染效率（%）

表2 不同劑量pEGFP和lipofectamine3000轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)細胞后48 h的細胞轉(zhuǎn)染效率（%）

綜上可知lipofectamine LTX在質(zhì)粒1.0 ug，lipofectamine LTX 2 μl時轉(zhuǎn)染效率最高lipofectamine 3000在質(zhì)粒0.75 μg，lipofectamine3000 0.75 μl時轉(zhuǎn)染效率最高。

2.2lipofectamine 3000與Lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染效率

圖1和圖2分別是lipofectamine 3000和lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染后的照片，圖1的轉(zhuǎn)染效率高于圖2的轉(zhuǎn)染效率。對睪丸間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)染lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑比lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率高且差異顯著（P＜0.05）（表3）。

圖1 （40×）lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染間質(zhì)細胞

圖2 （40×）lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染間質(zhì)細胞

3　討論

本研究是應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法比較轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率，結果中發(fā)現(xiàn)，ipofectamine3000試劑進行轉(zhuǎn)染時質(zhì)粒0.75 μg和轉(zhuǎn)染試劑0.75 μl時轉(zhuǎn)染效率最高。但當DNA加入過量時，轉(zhuǎn)染效率反而下降，結果與文章報道一致。這可能是因為過量的質(zhì)粒DNA可以形成一個類聚集體會產(chǎn)生額外的阻力，從而影響轉(zhuǎn)染水平，也可能是過量DNA會降低與帶負電荷的物質(zhì)相互競爭交換從LPP中解離出來的效率。

轉(zhuǎn)染間質(zhì)細胞時lipofectamine3000試劑在操作過程中不需要必須使用無血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中可以含有血清、雙抗等，在轉(zhuǎn)染6 h后無需再次換液直到48 h于熒光顯微鏡下進行觀察，因此操作較其他轉(zhuǎn)染試劑方便快捷，并且在轉(zhuǎn)染效率方面要高于lipofectamine LTX。雙抗對于細胞生長非常關鍵，有效抑制細菌生長，降低細胞污染概率。對于轉(zhuǎn)染試劑的使用量增加轉(zhuǎn)染效率反而降低的原因是由于轉(zhuǎn)染試劑本身具有毒性，伴隨轉(zhuǎn)染試劑試劑量增加毒性也會增加。本試驗中l(wèi)ipofectamine 3000的試劑和質(zhì)粒使用量遠遠低于其他轉(zhuǎn)染試劑的使用量，可減少陽離子脂質(zhì)體對于細胞的毒性作用。lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染后細胞狀態(tài)會良好，傳代后細胞死亡少，細胞狀態(tài)良好。蔣靜思等研究表明，lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染效率明顯高于lipofectamine 2000，本實驗中l(wèi)ipofectamine 3000轉(zhuǎn)染效率高于lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染效率且差異性顯著。因此，在使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法中l(wèi)ipofectamine 3000是更加適合轉(zhuǎn)染大鼠睪丸間質(zhì)細胞的試劑。

陳強（1990-），男，湖南農(nóng)業(yè)大學碩士研究生，研究方向為臨床獸醫(yī)學。

朱琳（1994-），女，湖南農(nóng)業(yè)大學本科生，研究方向為臨床獸醫(yī)學。

王水蓮，湖南農(nóng)業(yè)大學教授。