吐爾洪·阿木提阿布力孜·吾斯曼宋玉坤張效生王旭光何長久傅祥偉朱士恩張金龍*劉國世，*

（1.新疆阿克蘇市畜禽育種改良站，新疆阿克蘇 843000；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京 100193；3.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 8300522；4.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

黑頭薩?？司d羊胚胎玻璃化快速凍胚移植效果分析

吐爾洪·阿木提1阿布力孜·吾斯曼3宋玉坤2張效生4王旭光3何長久2傅祥偉2朱士恩2張金龍4*劉國世2，3*

（1.新疆阿克蘇市畜禽育種改良站，新疆阿克蘇 843000；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京 100193；3.新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 8300522；4.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

本試驗應用玻璃化胚胎冷凍方法進行黑頭薩?？司d羊胚胎冷凍和移植，比較了受體羊卵巢上黃體數(shù)量、受體羊的體況、移植胚胎的數(shù)量對受體受胎率的影響。受體羊卵巢上有一個黃體的移植受胎率42.7%與有2～3個黃體受體羊移植受胎率44.4%無顯著差異；受體的體況對受胎率有顯著影響，中上等（含中等）體況水平的受體的受胎率47.2%顯著高于中下等的受體的受胎率43.0% （P＜0.05）；使用玻璃化胚胎冷凍法的冷凍解凍胚胎移植受胎率54.2%顯著高于常規(guī)胚胎冷凍法的凍胚移植受胎率44.0%（P＜0.05）；移植1枚桑葚胚（1M）的受胎率47.5%略高于移植1枚囊胚（1B）的受胎率44.3%（P＞0.05）。因此，受體羊黃體數(shù)、冷凍桑葚胚和囊胚對胚胎移植受胎率沒有顯著影響，而受體中上等（含中等）體況水平和玻璃化胚胎冷凍法冷凍解凍胚胎移植受胎率顯著提高。

綿羊胚胎玻璃化冷凍胚胎移植胚胎階段受胎率

胚胎的冷凍保存是動物繁殖及生物工程的關(guān)鍵應用技術(shù)之一。將質(zhì)量較好的胚胎進行冷凍保存，同期發(fā)情后胚胎移植技術(shù)的結(jié)合，不僅可以起到保存瀕危動物的品種，還可以使動物引種不再受地點和時間條件的局限，提高了胚胎移植的推廣應用。玻璃化冷凍是繼程序化冷凍之后發(fā)明的一種簡單高效的冷凍方法，無須經(jīng)歷緩慢的程序化降溫過程，細胞在玻璃化液中短暫處理后直接投入液氮冷凍即可。玻璃化冷凍相對程序化冷凍大大降低昂貴的冷凍儀，冷凍過程耗時較短，便于推廣應用。新疆阿克蘇地區(qū)，近幾年逐步加大了對當?shù)囟嗬搜虻母牧剂Χ?，?015 年利用當?shù)氐亩嗬搜蜃鍪荏w進行胚胎移植，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種羊，向農(nóng)牧民提供質(zhì)優(yōu)價廉的種公羊。本文旨在通過試驗探討受體羊的飼養(yǎng)管理水平、胚胎胚齡、胚胎冷凍方法等因素對多浪羊胚胎移植受胎率的影響，為今后胚胎移植技術(shù)在該地的推廣、提高胚胎移植受胎率提供參考。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1時間和地點

本試驗于2015年在新疆阿克蘇富民養(yǎng)殖場進行。

1.1.2受體母羊的準備與飼養(yǎng)管理

本試驗選用新疆當?shù)仄贩N年齡1.5～4歲的多浪羊。所有的試驗羊已經(jīng)做過預飼養(yǎng)、驅(qū)蟲、免疫，體格健壯，無遺傳及傳染性疾病、寄生蟲病、生殖系統(tǒng)疾病等，具有正常發(fā)情周期。受體羊在舍飼情況下要保證有良好的體況。

1.1.3藥品與試劑

促卵泡素（FSH）：三生藥業(yè)有限公司

促黃體激素釋放激素（A3）：三生藥業(yè)有限公司

孕馬血清促性腺激素（PMSG）：三生藥業(yè)有限公司

陰道栓（CIDR）：新西蘭CIDR，20個/袋

Holding培養(yǎng)液：新西蘭生產(chǎn)，50ml/袋

0.5mol/L蔗糖液：美國ICP公司生產(chǎn)，6ml/支

玻璃化冷凍液：實驗室自配

酒精、碘酒、新潔爾滅、抗生素、生理鹽水、青霉素、鏈霉素等為國產(chǎn)。

1.1.4設(shè)備及器械

胚胎移植針，細菌濾器，體視鏡，恒溫臺，水浴鍋等。

1.2實驗方法

1.2.1玻璃化胚胎冷凍保存及解凍方法

（1）冷凍：胚胎首先在10%EG或10%EG+10%D預處理液中平衡5min，然后針用撿卵將胚胎移進事先裝好玻璃化溶液的0.25ml塑料細管內(nèi)，平衡30s后投進液氮容器內(nèi)冷凍保存。

（2）解凍：在25℃室溫下，將裝有胚胎的細管從液氮中取出，迅速放入25℃水浴中平行晃動10s，待細管內(nèi)蔗糖部分由乳白變?yōu)橥该鲿r，取出細管，搽去細管表面的水珠，剪掉兩端口，將細管內(nèi)的液體推入0.5mol/L蔗糖液的表面皿中，在實體顯微鏡下找到胚胎，并將胚胎移入放有0.5mol/L蔗糖液的平皿中平衡5.0min去除抗凍保護劑，最后用PBS液洗凈胚胎，移入Holding液中等待移植。

1.2.2受體羊同期發(fā)情方法

多浪羊受體在發(fā)情周期任意一天放置CIDR，第13d注射PMSG，同時取出CIDR，并進行記錄。受體羊發(fā)情后用腹腔內(nèi)窺鏡法進行冷凍胚胎移植，見表1。

表1　受體羊冷凍胚胎移植方案

1.2.3卵巢上黃體個數(shù)對冷凍胚胎移受胎率的影響

多浪羊受體選擇要求健康，無繁殖疾病，同期發(fā)情前一個月進行補飼，使之達到最佳的生理狀態(tài)，為保證后期高的同期發(fā)情率和受胎率。在試驗中比較雙側(cè)卵巢上有一個黃體的受體和卵巢上有2-3個黃體對受體移植受胎率的影響。

1.2.4受體的體況對冷凍胚胎移植效果的影響

對本試驗選擇不同體況的多浪羊受體（中上等、中下等）進行同期發(fā)情處理，比較受體體況對冷凍胚胎移植效果的影響。羊的體況按照體重分為中上、中下等體況，體況按照年齡、體重區(qū)分見表2。

表2　按照體重劃分羊的體況表

1.2.5不同的冷凍方法對胚胎移植效果的影響

本試驗選用兩種不同冷凍方法生產(chǎn)的冷凍胚胎（常規(guī)冷凍法和玻璃化法），胚胎解凍后每只羊移植1枚胚胎，其他條件相同的前提下移植到同期發(fā)情處理的多浪羊子宮角內(nèi)，觀察比較其受孕情況。

1.2.6不同胚齡對冷凍胚胎受胎率的影響

本試驗選擇常規(guī)胚胎冷凍法冷凍的凍胚251枚，分別移植給251只多浪受體羊，比較移植1枚桑葚胚和移植1枚囊胚受胎率情況。

1.2.7數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)應用Excel2003軟件進行整理，試驗結(jié)果采用SAS軟件中的PROCFREQ統(tǒng)計程序進行數(shù)據(jù)分析。

2　實驗結(jié)果

2.1卵巢不同黃體個數(shù)對冷凍胚胎移受胎率的影響

本試驗比較了多浪羊的雙側(cè)卵巢上有1個黃體或有2個及以上黃體，冷凍胚胎移植后受胎率，由表3可知，受體羊卵巢上有1個黃體的移植受胎率42.7%，有2-3個黃體受體羊移植受胎率44.4%，兩組受胎率差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同黃體個數(shù)對冷凍胚胎移受胎率的影響

2.2受體體況對冷凍胚胎移植效果的影響

由表4可見，受體的體況對受胎率有顯著影響，中上等（含中等）體況水平的受體的受胎率47.2%顯著高于中下等的受體的受胎率43.0%（P＜0.05）。

表4　受體體況對受胎率的影響

2.3不同胚齡對冷凍胚胎受胎率的影響

由表5可知，不同胚齡對冷凍胚胎受胎率有顯著影響，移植1枚桑葚胚（1M）的受胎率47.5%略高于移植1枚囊胚（1B）的受胎率44.3%（P＞0.05）。

表5 不同胚齡對冷凍胚胎移植效果的影響

2.4不同的冷凍方法對胚胎移植效果的影響

由表6可見，胚胎冷凍方法對受體的受胎率有顯著影響，使用玻璃化胚胎冷凍法的凍胚移植受胎率54.2%顯著高于常規(guī)胚胎冷凍法的凍胚移植受胎率44.0%（P＜0.05）。

表6 不同的冷凍方法對胚胎移植效果的影響

3　分析與討論

3.1卵巢不同黃體個數(shù)對冷凍胚胎移受胎率的影響

本試驗結(jié)果表明卵巢上黃體多少不影響移植效果，這與付靜濤等（付靜濤等，2005）和王素梅（2004）等結(jié)果相一致。受體綿羊血漿中的孕激素濃度與黃體的數(shù)量有關(guān)（Ashworth et al.，1989），孕激素的主要功能是促進胚胎著床并維持受胎（張忠誠，2004）。但受體羊卵巢上的黃體數(shù)量對胚胎移植后的受胎率沒有顯著影響（Bari et al.，2003）。也就是說只要血漿中的孕激素達到了受胎所需的閾值就足以維持受胎了，多了效果也是一樣。所以在移植時觀察黃體要注重對黃體質(zhì)量的觀察。

3.2受體體況對冷凍胚胎移植效果的影響

受體羊的飼養(yǎng)管理十分重要。受胎率與受體羊的飼養(yǎng)管理有著直接的聯(lián)系。當胚胎移植時受體羊的體況達到中等以上水平，大部分胚胎能夠著床發(fā)育成活。營養(yǎng)條件不足，對胚胎著床和產(chǎn)后羔羊的生長不利，顯著影響受體胚胎移植效果（張紅等，2005）。本試驗體況中上等的受體羊的受胎率明顯好于中下等體況的受體羊，這一結(jié)果與以上等人的研究結(jié)果相符合。所以在進行胚胎移植前，先對受體羊進行選擇，盡量選擇體況好、體質(zhì)好的青年羊作為受體，以保證較高的受胎率。

3.3不同胚齡對冷凍胚胎受胎率的影響

一般認為處于桑葚胚前的胚胎，移植效果好，受胎率較高。張紅等（2001）研究證明，桑葚胚移植受胎率、胚胎存活率均要高于囊胚。也有試驗證明，囊胚期是胚胎移植的最佳時間期，且受胎非常高。王麗娟等（2003）認為道賽特等綿羊凍胚移植中，囊胚的受胎率顯著高于桑葚胚（P＜0.01）；陳永昌等研究也得出杜泊羊囊胚的受胎率顯著高于桑葚胚（P＜0.01）?？墒潜驹囼灥慕Y(jié)果表明，移植1枚桑葚胚（1M）的受胎率47.5%略高于移植1枚囊胚（1B）的受胎率44.3%，但二者差異不顯著（P＞0.05），說明胚齡對冷凍胚胎受胎率沒有顯著影響。

3.4不同的冷凍方法對胚胎移植效果的影響

牛胚胎常規(guī)冷凍已經(jīng)廣泛應用于生產(chǎn)中，玻璃化冷凍移植產(chǎn)犢也有報道（saha et al，1996）。牛胚胎的玻璃化冷凍研究表明，第7天擴張囊胚冷凍后可以獲得較高的存活率（80%），而桑葚胚冷凍存活率相對較低（62%）（Campos-chillon et al，2006）。eldridge-panuska等（2005）用細管法玻璃化冷凍馬胚胎，管內(nèi)解凍直接移植后獲得62%的受胎率，和對照無顯著差異。玻璃胚胎冷凍化法優(yōu)點是不使用冷凍儀，且在室溫（20℃～25℃）下徒手操作，僅30s即可完成冷凍程序。而常規(guī)胚胎冷凍法，需要借助冷凍儀，冷凍的所耗時間長，且降溫過程需1.5h才能完成。盡管國內(nèi)已有許多玻璃化法冷凍和解凍胚胎的研究，但多數(shù)均在實驗室范圍內(nèi)的研究，綿羊玻璃化冷凍胚胎應用在生產(chǎn)中報道較少。本試驗的結(jié)果表明，將玻璃化胚胎冷凍法應用于綿羊冷凍胚胎移植，并且使用玻璃化胚胎冷凍法的凍胚移植受胎率54.2%顯著高于常規(guī)胚胎冷凍法的凍胚移植受胎率44.0% （P＜0.0 5），所以在今后的胚胎生產(chǎn)中可推廣玻璃化胚胎冷凍法進行胚胎冷凍保存。

因此，受體羊黃體數(shù)、冷凍桑葚胚和囊胚對胚胎移植受胎率沒有顯著影響，而受體中上等（含中等）體況水平和玻璃化胚胎冷凍法冷凍解凍胚胎移植受胎率顯著提高。

[1]付靜濤，朱士恩. 綿羊同期發(fā)情與冷凍胚胎移植技術(shù)的研究[J］.中國畜牧雜志，2005，41（8）：32-33，57.

[2]朱士恩. 家畜繁殖學（第五版）[M］. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009.

[3]王麗娟，李 武，張廣民.優(yōu)質(zhì)肉羊冷凍胚胎移植技術(shù)的研究 應用[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2003，（1）：29.

[4]陳永昌，王 繼，和占星，等.杜泊羊冷凍胚胎批量移植試驗 [J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2004，（10）：32-34.

課題資助：支疆項目（2016E02037）；國家重大專項（2014ZX08008-002B，2013ZX08008—005）；中國農(nóng)業(yè)大學與新疆農(nóng)業(yè)大學合作基金（2015TC050）