周建國(guó)張應(yīng)國(guó)段博芳楊余山羅曼榕濮永華匡繼才劉紹陽(yáng)彭正啟黃 杰

（1.云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南昆明　650051；2.保山市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南保山　678000；3.云南省獸醫(yī)生物制品研制中心，云南保山 678000；4.施甸縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南施甸 678200）

口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍(lán)耳病三種疫苗同步兩點(diǎn)免疫新技術(shù)研究與應(yīng)用

周建國(guó)1張應(yīng)國(guó)1段博芳1楊余山1羅曼榕1濮永華2匡繼才2劉紹陽(yáng)3彭正啟3黃 杰4

（1.云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南昆明650051；2.保山市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南保山678000；3.云南省獸醫(yī)生物制品研制中心，云南保山 678000；4.施甸縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南施甸 678200）

本研究采用豬口蹄疫（FMD）滅活疫苗和合成肽疫苗、豬瘟（CSF）脾淋活疫苗和高致病性豬藍(lán)耳病（HPPRRS）活疫苗同步兩點(diǎn)免疫技術(shù)，對(duì)被免疫豬只分別進(jìn)行了小組試驗(yàn)、免疫持續(xù)期觀察等試驗(yàn)研究，并用ELISA方法定期對(duì)各階段血清抗體進(jìn)行檢測(cè)，旨在探索一種適合基層應(yīng)用的FMD、CSF、HPPRRS三種疫苗同步分點(diǎn)注射免疫技術(shù)，提高免疫密度和免疫效果，降低基層防疫人員勞動(dòng)強(qiáng)度，提高工作效率，破解基層強(qiáng)制免疫工作難題。本研究得出下列結(jié)論:（1）建立了口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍(lán)耳病三種疫苗同步兩點(diǎn)免疫技術(shù)方法并證明了其臨床應(yīng)用的可行性與科學(xué)性。（2）口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍(lán)耳病三種疫苗同步兩點(diǎn)免疫證明了三種疫苗同步分點(diǎn)免疫相互間未出現(xiàn)免疫干擾現(xiàn)象。同時(shí)，對(duì)應(yīng)用三種疫苗同步兩點(diǎn)免疫技術(shù)中各病種免疫效果的同步評(píng)估需在免疫后35～40d期間進(jìn)行監(jiān)測(cè)為佳。（3）三種疫苗同步兩點(diǎn)免疫技術(shù)列入云南省2013年重大動(dòng)物疫病免疫方案，在全省范圍內(nèi)推廣應(yīng)用至今。本研究證明了三種疫苗同步分點(diǎn)注射的可行性和科學(xué)性，并將三種疫苗同步兩點(diǎn)免疫技術(shù)大面積應(yīng)用于免疫工作，解決了困擾基層臨床免疫的難點(diǎn)問(wèn)題，為其臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，在生產(chǎn)實(shí)際的臨床應(yīng)用中具有重要意義。

口蹄疫豬瘟藍(lán)耳病疫苗兩點(diǎn)免疫技術(shù)研究與應(yīng)用

口蹄疫（Foot-and-mouth Disease，F(xiàn)MD）、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），又稱“藍(lán)耳病”、豬瘟（Swine Fever；Hog Cholera，CSF）是近年來(lái)危害養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將口蹄疫、豬瘟列為 A 類家畜傳染病，將藍(lán)耳病列為B 類傳染病，并將這三種疾病列為世界范圍內(nèi)重要傳染病研究病種[1-5］。我國(guó)對(duì)上述三種疫病采取強(qiáng)制免疫和撲殺相結(jié)合的綜合防控措施，國(guó)家發(fā)布的免疫計(jì)劃中，高致病性豬藍(lán)耳病、口蹄疫和豬瘟的免疫程序是散養(yǎng)生豬每年春秋兩季各免疫1次，規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)按程序化進(jìn)行免疫，三種疫苗要分3個(gè)階段3次注射免疫，每次免疫間隔一定時(shí)間。隨著這3種疫病陸續(xù)納入國(guó)家重大動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫病種，基層防疫員按傳統(tǒng)方免疫式每季防疫要完成3種動(dòng)物疫病的免疫任務(wù)需要分3個(gè)階段開(kāi)展強(qiáng)制免疫工作，免疫周期長(zhǎng)達(dá)60～75d，工作量較以往呈幾何倍數(shù)增加，勞動(dòng)強(qiáng)度非常大，工作效率低、疫苗利用率低。為探索一種適合基層生豬口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍(lán)耳病同步免疫的新技術(shù)，優(yōu)化免疫程序，降低基層防疫人員勞動(dòng)強(qiáng)度，提高工作效率，提高免疫質(zhì)量，破解強(qiáng)制免疫工作中的難點(diǎn)問(wèn)題，本研究在豬口蹄疫（滅活疫苗、合成肽疫苗）、豬瘟脾淋活疫苗高致病性豬藍(lán)耳病活疫苗三種疫苗同步三點(diǎn)免疫技術(shù)研究與應(yīng)用[6］基礎(chǔ)上，采用三種疫苗同步兩點(diǎn)免疫新技術(shù)，通過(guò)小組試驗(yàn)、免疫持續(xù)期觀察試驗(yàn)研究，建立了適合臨床操作且免疫效果理想的生豬三種疫苗同步兩點(diǎn)注射一次完成的免疫技術(shù)方法（生豬“321”免疫新技術(shù)）。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和疫苗

選取45～60日齡斷奶仔豬，且滿足口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍(lán)耳病基礎(chǔ)抗體和病原同時(shí)為陰性，試驗(yàn)地點(diǎn)為云南省獸醫(yī)生物制品研發(fā)中心。

豬O型口蹄疫合成肽疫苗為申聯(lián)生物醫(yī)藥（上海）有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20111001。豬O型口蹄疫滅活疫苗為中牧實(shí)業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20120303001。豬瘟活疫苗（脾淋源）為云南生物制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20120302。高致病性豬藍(lán)耳病活疫苗（豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗NVDC-JXA1株）為洛陽(yáng)普萊柯生物工程股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)1202021。

1.2試劑和儀器

口蹄疫病毒O型抗體檢測(cè)試劑盒（阻斷ELISA）為韓國(guó)金諾（北京金諾百特科技有限公司）產(chǎn)品，批號(hào)107SD298。豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒（阻斷ELISA）為韓國(guó)金諾（北京金諾百特科技有限公司）產(chǎn)品，批號(hào)107SD340。LSI豬繁殖和呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒（間接ELISA）為北京天之泰生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)5—VE7PRA—024。

酶標(biāo)儀為安圖實(shí)驗(yàn)儀器（鄭州）有限公司產(chǎn)品，型號(hào)：PHOMO

1.3免疫試驗(yàn)分組與免疫方法

為確保各免疫組免疫劑量，各病種疫苗免疫劑量均為1.2頭份。

第1組，30頭，口蹄疫合成肽疫苗、豬瘟和高致病性豬藍(lán)耳病三種疫苗同步兩點(diǎn)免疫注射組，即口蹄疫合成肽疫苗于頸部左側(cè)注射，在同等規(guī)格下將豬瘟疫苗和高致病性豬藍(lán)耳病疫苗用豬瘟稀釋液按1：1：1比例進(jìn)行稀釋后于頸部右側(cè)注射。

第2組，30頭，口蹄疫滅活疫苗、豬瘟和高致病性豬藍(lán)耳病三種疫苗同步兩點(diǎn)免疫注射組，即口蹄疫滅活疫苗于頸部左側(cè)注射，在同等規(guī)格下將豬瘟疫苗和高致病性豬藍(lán)耳病疫苗用豬瘟稀釋液按1：1：1比例進(jìn)行稀釋后于頸部右側(cè)注射。

第3組，17頭，口蹄疫合成肽疫苗單苗免疫對(duì)照組，頸部左側(cè)深部肌肉注射。

第4組，18頭，口蹄疫滅活疫疫苗單苗免疫對(duì)照組，頸部左側(cè)深部肌肉注射。

第5組，18頭，豬瘟疫苗單苗免疫對(duì)照組，頸部右側(cè)深部肌肉注射。

第6組，21頭，高致病性豬藍(lán)耳病疫苗單苗免疫對(duì)照組，頸部深部肌肉注射。

第7組，21頭，免疫效果持續(xù)期觀察試驗(yàn)組，即口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍(lán)耳病三種疫苗同步兩點(diǎn)免疫效果持續(xù)期觀察免疫組，即口蹄疫合成肽疫苗于頸部左側(cè)注射，豬瘟疫苗和高致病性豬藍(lán)耳病疫苗用豬瘟稀釋液按1：1：1比例進(jìn)行稀釋后于頸部右側(cè)注射。

1.4抗體檢測(cè)和觀察

第1～7組免疫后每15d采集1次血清，進(jìn)行各組相應(yīng)病種免疫抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)情況檢測(cè)，其中1～6組檢測(cè)4次。第7組檢測(cè)8次。

各組實(shí)施免疫后觀察24h，主要觀察精神、飲食和排泄物等有無(wú)異常情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。P≥0.05為差異不顯著，0.01≥P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2　結(jié)果

到并高于國(guó)家要求，至免疫后60d監(jiān)測(cè)時(shí)仍高于國(guó)家要求以上。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，免疫后15～60d第1組與第6組之間、第2組與第6組之間的差異極顯著（P＜0.01），而30～60d抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率第1組與第6組之間、第2組與第6組之間的差異不顯著（P≥0.05）。（見(jiàn)表1）

2.1試驗(yàn)免疫效果

2.1.1免疫抗體

第1組、第2組與第5組豬瘟免疫抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率結(jié)果相比較，三組均于免疫后15d達(dá)到并高于國(guó)家要求，3個(gè)試驗(yàn)組免疫抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率至免疫后60d監(jiān)測(cè)時(shí)轉(zhuǎn)陽(yáng)率仍保持100%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，免疫后15～60d第1組與第5組、第2組與第5組之間的差異不顯著（P≥0.05）。（見(jiàn)表1）

王加啟等[38]利用瘤胃持續(xù)模擬裝置研究了日糧精粗比為7∶3、1∶1和3∶3時(shí)對(duì)NDF降解率的影響，結(jié)果表明日糧精粗比為1∶1時(shí)，NDF降解率最高，當(dāng)精粗比增加到7∶3時(shí)，NDF降解率降低。趙祥等[39]報(bào)道，綿羊瘤胃中不同精粗比TMR的NDF有效降解率隨精料水平提高而降低。胡琳等[40]研究了以木薯莖葉為粗料、不同精粗比全混合日糧養(yǎng)分在山羊瘤胃中的降解率，結(jié)果表明日糧精粗比為5∶5時(shí)NDF有效降解率顯著高于精粗比為2∶8、3∶7、4∶6、6∶4和7∶3的實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）。

第1組、與第3組口蹄疫合成肽疫苗免疫抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率相比較，兩組均于免疫后30d達(dá)到并高于國(guó)家要求，并至免疫后60d監(jiān)測(cè)仍高于國(guó)家要求以上。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，免疫后15～60d兩組之間差異極顯著（P＜0.01），而30～60d兩組之間差異不顯著（P≥0.05）（見(jiàn)表1）

第2組、第4組口蹄疫滅活疫苗免疫抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率結(jié)果相比較，兩組于免疫后45d達(dá)到并高于國(guó)家要求，至免疫后60d時(shí)檢測(cè)抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率仍高于國(guó)家要求。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，免疫后15～60d兩組之間的差異極顯著（P＜0.01），而45～60d兩組之間差異不顯著（P≥0.05）。（見(jiàn)表1）

第1組、第2組、第6組高致病性豬藍(lán)耳病免疫抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率結(jié)果相比較，三組高致病性豬藍(lán)耳病免疫抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率均于免疫后30d達(dá)

表1 各免疫組免疫抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率

2.1.2免疫抗體持續(xù)期效果

豬瘟和高致病性豬藍(lán)耳病均在免疫后30d達(dá)到國(guó)家要求標(biāo)準(zhǔn)，口蹄疫于免疫后45d達(dá)到國(guó)家要求標(biāo)準(zhǔn)以上，且三種疫病有效免疫抗體維持期長(zhǎng)，至免疫后120d時(shí)口蹄疫與豬瘟免疫抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率仍為100%，高致病性豬藍(lán)耳病免疫抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率仍為77.78%。（見(jiàn)表2）

表2　免疫抗體持續(xù)期抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率

2.2免疫應(yīng)激反應(yīng)

各試驗(yàn)組在免疫后24h內(nèi)均未出現(xiàn)精神沉郁、飲食減退、嘔吐、腹瀉和死亡等免疫應(yīng)激反應(yīng)情況。

3　討論

綜合分析，采用“321”免疫技術(shù)的第1組、第2組各病種各階段免疫抗體產(chǎn)生的規(guī)律特點(diǎn)，豬瘟活疫苗、口蹄疫合成肽疫苗、口蹄疫滅活疫苗、高致病性豬藍(lán)耳病活疫苗分別于免疫后15d、30d、45d、30d達(dá)到國(guó)家要求，免疫抗體持續(xù)期至免疫后120d以上，三種疫苗同步兩點(diǎn)免疫未表現(xiàn)各疫苗間相互干擾現(xiàn)象，且可同步產(chǎn)生有效免疫抗體，擴(kuò)大應(yīng)用試驗(yàn)與小組試驗(yàn)免疫抗體產(chǎn)生規(guī)律較為一致，無(wú)論是免疫效果還是實(shí)際可操作性均優(yōu)于與之前報(bào)告[6］的三種疫苗同步三點(diǎn)免疫，更適用于基層防疫推廣應(yīng)用。同時(shí)，研究結(jié)果提示，對(duì)三種疫苗同步兩點(diǎn)免疫有效抗體的同步評(píng)估需在免疫后35～40d期間為佳。無(wú)論是免疫效果還是實(shí)際可操作性均優(yōu)于三點(diǎn)免疫。

對(duì)應(yīng)用三種疫苗同步兩點(diǎn)免疫技術(shù)中各病種免疫效果的同步評(píng)估需在免疫后35～40d期間進(jìn)行監(jiān)測(cè)為佳。

本研究結(jié)果表明，“321”免疫技術(shù)適用于基層防疫推廣應(yīng)用，可提高防疫工作效率，縮短免疫周期和免疫空白期，降低基層防疫成本和疫病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

4　結(jié)論

建立了口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍(lán)耳病三種疫苗同步分點(diǎn)兩點(diǎn)免疫技術(shù)方法并證明了其臨床應(yīng)用的可行性與科學(xué)性。

口蹄疫、豬瘟和高致病性豬藍(lán)耳病三種疫苗同步兩點(diǎn)免疫證明了三種疫苗同步免疫相互間未出現(xiàn)免疫干擾現(xiàn)象，且兩點(diǎn)免疫

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