瑪爾江·木坎

（新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，新疆烏魯木齊 830063）

吡喹酮咀嚼片微生物限度檢查方法的建立

瑪爾江·木坎

（新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，新疆烏魯木齊 830063）

目的 吡喹酮咀嚼片為內(nèi)服給藥制劑，制劑中含有適合微生物生長的氮源和碳源，因此在原料采購、儲(chǔ)存，以及在制劑制備過程和儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)，如處理和控制不當(dāng)，則有滋生微生物的可能，因此對(duì)本制劑需要進(jìn)行微生物限度檢查，由于本制劑含有動(dòng)物組織（魚粉），依據(jù)按照2010年版《中國獸藥典》一部附錄143-158微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)吡喹酮咀嚼片進(jìn)行了細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法和控制菌檢查方法的驗(yàn)證，旨在為規(guī)范藥品的微生物限度檢查提供依據(jù)。

吡喹酮咀嚼片微生物限度方法建立

建立吡喹酮咀嚼片微生物限度檢查方法，依據(jù)按照2010年版《中國獸藥典》附錄的要求進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，因此對(duì)本制劑需要進(jìn)行微生物限度檢查和附錄271-272頁“微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則”，建立了吡喹酮咀嚼片微生物限度檢查方法，并將該方法納入吡喹酮咀嚼片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢查項(xiàng)中。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1菌種

大腸埃希菌〔CMCC（B）44102〕，金黃色葡萄球菌〔CMCC （B）26003〕，枯草芽孢桿菌〔CMCC（B）63501〕，白色念珠菌〔CMCC（F）98001〕，黑曲霉〔CMCC（F）98003〕，以上菌種由烏魯木齊市食品藥品檢驗(yàn)所提供。

1.2培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（YPD）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）、改良馬丁液體培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、沙門志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基（SS）、四硫黃酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacC）、4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸培養(yǎng)基（MUG），均購自北京奧博星科技有限公司生產(chǎn)。

1.3試劑與試液

氯化鈉（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）、磷酸氫二鉀（分析純）、吐溫80、定基質(zhì)試液，0.9%無菌氯化鈉溶液、pH值為7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

1.4樣品

愛普瑞克（吡喹酮咀嚼片）（規(guī)格100mg，批號(hào)分別為20131204），是由北京中農(nóng)華威制藥有限公司提供。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)菌菌懸液的制備

取出冷凍保藏的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物1ml接種于50ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在36℃培養(yǎng)20h；取結(jié)束的培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液進(jìn)行10倍等級(jí)稀釋至50～100cfu/ml。

2.2真菌菌液制備

冷凍保藏的白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)物各0.2ml，接種到真菌斜面培養(yǎng)基上，均勻涂布，在27℃培養(yǎng)，白色念珠菌培養(yǎng)約30h結(jié)束。真菌培養(yǎng)約5d結(jié)束。

白色念珠菌培養(yǎng)物表面加入4ml0.9%無菌氯化鈉溶液，用接種環(huán)刮下菌體，用無菌吸管吸取1ml加9ml無菌氯化鈉溶液進(jìn)行10倍等級(jí)稀釋至50～100cfu/ml。該菌懸液在室溫下放置，應(yīng)在2h內(nèi)使用。

黑曲霉培養(yǎng)物表面加入4ml0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，用接種環(huán)輕輕刮培養(yǎng)物表面，將孢子洗脫，用無菌吸管吸取1ml洗脫液加9ml0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液進(jìn)行10倍等級(jí)稀釋至50～100cfu/ml。孢子懸液在室溫下放置，應(yīng)在10h內(nèi)使用。

3　吡喹酮咀嚼片供試液的制備

3.1供試液A的制備

在超凈工作臺(tái)中，用滅菌的鑷子從經(jīng)過表面消毒的兩板鋁箔/ PVC泡罩中取出3片吡喹酮咀嚼片（每片重約1.7g）于滅過菌的研缽中搗碎并研成細(xì)粉，然后將細(xì)粉裝入100mlpH值7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液的250ml三角燒瓶中，用滅菌棉塞封口，在磁力攪拌器上攪拌1h，然后用孔徑大于100um的玻璃砂芯漏斗G1號(hào)過濾，濾液即為供試液A。

3.2供試液B的制備

取3片吡喹酮咀嚼片（每片重約1.7g）于滅過菌的研缽中搗碎并研成細(xì)粉，取約1 g細(xì)粉分別與以上2.1項(xiàng)制備的10-5菌懸液（金黃色葡萄球菌）10ml和10-4的黑曲霉孢子懸液10ml，充分混勻，用孔徑大于100μm的玻璃砂芯漏斗（G1）過濾，取濾液用稀釋液按1：10進(jìn)行稀釋，得供試品B。以上操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，制備好的供試液應(yīng)無菌存放，并及時(shí)使用。

4　采用平皿法細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)分為五組

4.1試驗(yàn)組

供試品+菌懸液，取1ml供試液A和1ml相對(duì)應(yīng)的菌懸液分別注入平皿中，之后立即傾注溫度為45℃以下的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（細(xì)菌用）和玫瑰紅鈉培養(yǎng)基（白色念珠菌和黑曲霉用），細(xì)菌培養(yǎng)在36℃培養(yǎng)3天，白色念珠菌和黑曲霉用在27℃培養(yǎng)5d，培養(yǎng)期間每天觀察并記錄菌落數(shù)。

4.2陽性對(duì)照組

取2.1項(xiàng)菌懸液或孢子懸液1ml注入平皿中，之后立即傾注以上試驗(yàn)組相同的培養(yǎng)基。

4.3陰性對(duì)照組

取氯化鈉-蛋白胨緩沖液1 ml注入平皿中，之后立即傾注以上試驗(yàn)組相同的培養(yǎng)基。

4.4供試品A 組

取供試液A組1 ml注入平皿中，之后立即傾注以上試驗(yàn)組相同的培養(yǎng)基。

4.5供試品B 組

取供試液B組1 ml注入平皿中，之后立即傾注以上試驗(yàn)組相同的培養(yǎng)基。愛普瑞克（吡喹酮咀嚼片）規(guī)格100mg，批號(hào)為20131204。結(jié)果見表1.

5　控制菌檢查

（1）試驗(yàn)設(shè)陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組和供試品檢查組。

（2）試驗(yàn)用培養(yǎng)基：a .檢查大腸埃希菌用的乳糖膽鹽增菌液和4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸培養(yǎng)基；b.檢查沙門氏菌用的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，四硫黃酸鈉亮綠培養(yǎng)基，沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基。

（3）供試品檢查主要包括以下兩步：

a.檢查大腸埃希菌

表1　細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)

供試液的制備：在超凈工作臺(tái)中，用滅菌的鑷子從經(jīng)過表面消毒的兩板鋁箔/PVC泡罩中取出3片吡喹酮咀嚼片置滅過菌的研缽中搗碎并研成細(xì)粉，全部移入裝有100ml氯化鈉-蛋白胨緩沖液的200ml三角瓶中，用滅過菌的高速剪切機(jī)處理3～5min得混懸液，該混懸液為供試液。

檢查過程：取上述供試液10ml加入100ml乳糖膽鹽增菌培養(yǎng)基的三角燒瓶中，35±1℃培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束取培養(yǎng)物0.2ml加入到含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)培養(yǎng)于5h、24h在360nm紫外光下觀察。

b.檢查沙門氏菌

供試液的制備：在超凈工作臺(tái)中，用滅菌的鑷子從經(jīng)過表面消毒的兩板鋁箔/PVC泡罩中取出3片吡喹酮咀嚼片，置滅過菌的研缽中搗碎并研成細(xì)粉，即為供試品。

檢查過程：取上述供試品約10g加入200ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的三角燒瓶中，用剪切機(jī)300～500rpm均質(zhì)化，于35±1℃培養(yǎng)24h，培養(yǎng)物取1ml接種于10ml四硫黃酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h后，用滅菌吸管吸取0.2ml，分別接種于沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基的平板上，涂布均勻，48h觀察。結(jié)果見表2

表2　控制菌檢查試驗(yàn)

6　結(jié)論

由“試驗(yàn)組”結(jié)果與“菌液組”比較可見，供試品對(duì)試驗(yàn)菌株無抑菌活性。供試品A組未檢出細(xì)菌、霉菌和酵母菌，菌落數(shù)均為0，這很可能與吡喹酮咀嚼片在加工過程采取了有效的殺菌方法有關(guān)。也與本品經(jīng)過鈷-60照射后，沒有活的微生物存在。并且采用的包裝物密封良好，產(chǎn)品在保存期間被微生物污染的可能性很小。

比較以上試驗(yàn)表明所采用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和供試品處理方法符合大腸埃希菌和沙門氏菌的要求，上述檢查表明供試品不含有大腸埃希菌和沙門氏菌。通過以上菌落計(jì)數(shù)和控制菌檢查表明，供試品制備方法及具體操作方法適用于本產(chǎn)品的微生物限度檢查。

菌落計(jì)數(shù)試驗(yàn)中，可知該試驗(yàn)組的回收率均高于70%，故可照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)方法測定吡喹酮咀嚼片的細(xì)菌和酵母菌數(shù)?？刂凭鷻z查試驗(yàn)中，可知陰性對(duì)照組未檢出陽性菌，試驗(yàn)組檢出陽性菌，故可用此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行吡喹酮咀嚼片的控制菌檢查。在試驗(yàn)過程中為了避免污染，應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)范，保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

[1]中華人民共和國獸藥典委員會(huì).中國獸藥典[S］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010：附錄121.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程[S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：351.

[3]馬緒榮.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊[M］北京：科學(xué)出版社，2000：89-90.

瑪爾江·木坎（1963-），女，大學(xué)本科，高級(jí)獸醫(yī)師，從事抗生素檢驗(yàn)、飼料及畜產(chǎn)品安全檢測。