付 平 郭妮妮 全凡凡 余 毅 胡立昌 張文昆 赫海龍 葉 敏 張國慶

（湖北省畜禽育種中心，湖北武漢 430070）

幾種糖類對水牛精子凍后效果的觀察和比較

付 平 郭妮妮 全凡凡 余 毅 胡立昌 張文昆 赫海龍 葉 敏 張國慶

（湖北省畜禽育種中心，湖北武漢 430070）

本研究比較了幾種糖類對水牛精液冷凍保存的效果，以篩選出適于水牛精液冷凍保存的糖類保護劑。在水牛精液冷凍稀釋液中分別添加半乳糖、果糖、葡萄糖和蔗糖，觀察并比較它們對水牛精液冷凍保存的效果。試驗結(jié)果表明：在原Tris-檸檬酸鈉-雞卵黃-甘油基礎(chǔ)稀釋液中，加入果糖能較顯著提高水牛精子凍后的活力和頂體完整率（P＜0.05），加入半乳糖、蔗糖與葡萄糖沒有顯著差異（P＞0.05）。

水牛精液稀釋液糖類冷凍保存保護劑

伴隨著人工授精技術(shù)的廣泛應(yīng)用，家畜精液冷凍保存技術(shù)業(yè)已成熟，目前，冷凍精液研究在牛、豬、羊、馬、犬等動物上均有涉獵，其中牛的冷凍精液最為成功，已經(jīng)大量應(yīng)用于商品化生產(chǎn)。目前，精液冷凍保存技術(shù)在奶牛上研究的很多，相關(guān)研究報道也很多，但是在水牛上的研究比較少。畢竟水牛精液的理化性質(zhì)與奶牛存在較大差異，到底哪一種糖類更適合水牛精液冷凍保存，還有待研究。本文通過比較幾種糖類對水牛精液冷凍保存的效果，探討適用于水牛精液冷凍保存的糖類，從而為實際生產(chǎn)提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1試驗動物與精液采集

選取年齡相近、凍精畸形率＜25%的成年檳榔江水牛4頭，利用假陰道法采集種公牛精液，每周間隔兩天采集精液兩次。采集到的新鮮精液按照常規(guī)檢測法評價其品質(zhì)，包括外觀、色澤、氣味、活力、密度等，要求活力＞60%的精液才用于試驗。

1.2試驗設(shè)計

將生產(chǎn)中常用的Tris-檸檬酸鈉-雞卵黃-葡萄糖-甘油稀釋液中的糖類，分別換成半乳糖、果糖和蔗糖等三種糖類，各種糖類添加含量均為1%，葡萄糖組為對照組。實驗時將采集的新鮮水牛精液分別用含不同糖類的稀釋液稀釋，然后比較添加4種糖類的稀釋液對水牛精液冷凍保存的效果。

1.3精液稀釋、封裝、平衡和冷凍

通過一步稀釋的方法對水牛精液進行稀釋，各種稀釋液、試管等均要提前在34℃水浴鍋中預(yù)熱，按照GB4143-2008要求對新鮮水牛精液稀釋。稀釋后的精液靜置10min，然后在常溫下利用細管封裝機進行封裝，隨后計數(shù)、擺放至4℃低溫柜中平衡，3～4h后將細管精液迅速放入程序化冷凍儀中完成冷凍過程，冷凍結(jié)束將細管凍精存放臨時液氮罐，待48h后進行鏡檢。

1.4凍精質(zhì)檢

將試驗用水牛細管凍精從液氮罐中取出，立即放入38℃～40℃水浴鍋中進行解凍。解凍后用37℃恒溫相差顯微鏡來觀察水牛精子的活性，同時采用計算機精子圖像分析系統(tǒng)CASA對復蘇后的水牛精液進行活力評定，并記錄試驗結(jié)果。再將精液樣品利用姬姆薩染色法進行涂片，晾干后在400倍顯微鏡下觀察，精子畸形率每片計數(shù)200個以上精子，頂體完整率每片計數(shù)200個以上精子。

精子畸形率=（畸形精子數(shù)量/計數(shù)精子總數(shù)）×100%

頂體完整率=（頂體完整精子數(shù)量/計數(shù)精子總數(shù)）×100%

1.5數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5軟件進行方差分析和LSD多重比較，并用“均值±標準差”（Mean±SD）表示結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

如表1所示，添加果糖的稀釋液組水牛精子解凍后活力顯著高于半乳糖稀釋液組和蔗糖稀釋液組（P＜0.05），與葡萄糖稀釋液組沒有明顯差異（P＞0.05）。添加不同糖類的各稀釋液組解凍后精子的畸形率差異均不顯著（P＞0.05）。添加半乳糖和蔗糖的稀釋液組解凍后水牛精子的頂體完整率與葡萄糖（對照組）稀釋液組沒有顯著差異（P＞0.05），果糖稀釋液組精子頂體完整率顯著高于其他三組糖類（P＜0.05）。

表1　不同糖類對水牛精子解凍后活力、畸形率、頂體完整率的影響

圖1　水牛精子姬姆薩染色結(jié)果

3　討論

糖類保護劑在精液冷凍保存過程中，一方面作為主要能源物質(zhì)，為精子提供能量；另一方面作為主要的非電解質(zhì)，降低精液電解質(zhì)的濃度，從而緩和精漿的電離程度；同時還作為一種非滲透保護劑，增加稀釋液的滲透壓，通過穩(wěn)定精子膜結(jié)構(gòu)而起保護作用。鑒于牛精子代謝作用只能利用簡單的物質(zhì)，目前牛精液冷凍稀釋液中常添加糖類有葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、海藻糖等。水牛精液稀釋液中添加的糖類基本上借鑒于奶牛，相關(guān)報道卻很少，在本實驗中，通過比較不同糖類對水牛精子解凍后活力、畸形率等的影響，發(fā)現(xiàn)適于水牛精液冷凍保存的糖類。試驗結(jié)果表明，在原Tris-檸檬酸鈉-雞卵黃-甘油基礎(chǔ)稀釋液中，加入果糖能較顯著提高水牛精子凍后的活力和頂體完整率（P＜0.05），加入半乳糖、蔗糖與葡萄糖沒有顯著差異（P＞0.05）。

陳淑華在梅花鹿精液冷凍保存效果研究中，用果糖、蔗糖分別替代葡萄糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)果糖組解凍后活率、頂體完整率等均顯著高于葡萄糖組。梁琪妹在奶牛精液稀釋液中分別添加果糖、葡萄糖和海藻糖，結(jié)果表明3種糖對精子解凍后活力、畸形率、頂體完整率等均無顯著影響。這些研究表明不同糖類對同一種類動物精子冷凍保護效果不同，同一種糖對不同種類動物精子冷凍保護效果也存在差別（李新紅，2004）。另外許多研究發(fā)現(xiàn)糖類保護劑在很大程度上取決于同稀釋液中其他成分的相互作用，卵黃-甘油稀釋液中添加Tris時，果糖比葡萄糖更為適合（蔡虹，2009）。當然，還有許多學者研究證明，冷凍稀釋液中同時添加幾種糖類比只添加一種的效果要好（趙祥杰，2007；張齊卉，2006）。同時添加幾種性質(zhì)的糖類，能否對水牛精子冷凍保存起到更好的效果有待下一步研究。

[1]丁瑜.優(yōu)質(zhì)肉羊精液冷凍稀釋液的研究[D］.吉林農(nóng)業(yè)大學，2005.

[2]李新紅，鄒興淮，朱淑文.不同糖類對藍狐精子常溫及冷凍保存特性的影響[J］.上海交通大學學報，2004，22（4）：334-338，

[3]陳淑華.稀釋液中添加DMF、EG和不同糖對梅花鹿精液冷凍保存效果的影響[D］.中國農(nóng)業(yè)科學院，2013.

[4]梁琪妹.奶牛精液冷凍稀釋液的研究[D］.廣西大學，2006.

[5]蔡虹.牛精液冷凍稀釋液新配方研究[D］.華中農(nóng)業(yè)大學，2009.

[6]趙祥杰.豬精液冷凍保存技術(shù)的研究與應(yīng)用[D］.東北農(nóng)業(yè)大學，2007.

[7]張齊卉，孫娟，李波，等.細管凍精稀釋液以果糖部分替代乳糖配方試驗初報[J］.云南畜牧獸醫(yī)，2006，（4）：1-2.