徐潔，余萍，董超，朱海濱，張靜，楊義，羅云，姚春馨，陶南，丁玉梅，王耀進(jìn)，周曉罡

1紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，云南 昆明 650202;

2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明650223;

3云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650223;

4農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650023;

5石林耀奇農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司

玫瑰與煙草間作對(duì)煙葉蛋白質(zhì)影響的生物信息學(xué)分析

徐潔1，余萍2,3,4，董超1，朱海濱1，張靜1，楊義1，羅云1，姚春馨2,3,4，陶南2,3,4，丁玉梅2,3,4，王耀進(jìn)5，周曉罡2,3,4

1紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，云南 昆明 650202;

2云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明650223;

3云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650223;

4農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650023;

5石林耀奇農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司

本試驗(yàn)應(yīng)用蛋白質(zhì)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)單作和與玫瑰間作的K326葉片蛋白質(zhì)進(jìn)行分離鑒定。利用Plant-mPLoc、Gene Ontolog、KOBAS、STRING對(duì)所鑒定蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。在每份樣品分離到的400左右個(gè)蛋白質(zhì)中，MALDI-TOF/TOF MS法成功鑒定了20個(gè)差異蛋白質(zhì)，生物信息學(xué)分析表明其中80%定位于葉綠體，主要參與光合作用和碳代謝，參與的生物過程主要是細(xì)胞過程、細(xì)胞成分組織或生物起源、生物調(diào)控、代謝過程和定位。研究表明，玫瑰散發(fā)的香氣物質(zhì)一方面促進(jìn)煙草產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)蛋白的表達(dá)來加強(qiáng)其自身的抗病性，另一方面降低煙草的光合作用，抑制烤煙的生長(zhǎng)發(fā)育。

玫瑰；烤煙；間作；生物信息學(xué)

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，K326是我國(guó)種植面積最大的烤煙品種，玫瑰是古老的天然香料植物，玫瑰花香主要包含醇類、萜烯類和酯類等揮發(fā)性有機(jī)物。這些揮發(fā)性有機(jī)物在植物之間信息交流中發(fā)揮重要作用[1-2]。黎華壽等[3]研究表明，香茅草揮發(fā)物對(duì)玉米和稗草幼苗的生物量、根長(zhǎng)及苗高產(chǎn)生顯著抑制作用。山艾樹的枝葉被剪去后會(huì)散發(fā)某些化合物增強(qiáng)相鄰煙草的抗病性[4]。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究植物受生物和非生物脅迫后蛋白質(zhì)變化已成為研究的熱點(diǎn)。近幾年也有不少煙草蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，但主要集中在煙草低氮[5]、紫外線[6]、低溫[7]、高鹽[8]和病原菌[9]等非生物和生物脅迫后響應(yīng)的研究。對(duì)于煙草受某些植物產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物影響的蛋白質(zhì)組學(xué)研究還未見報(bào)道。本研究采用雙向電泳聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)煙草單作和煙草與玫瑰間作的煙葉蛋白質(zhì)進(jìn)行比較分析，并應(yīng)用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、功能分類、代謝途徑分析及蛋白質(zhì)間互作網(wǎng)絡(luò)分析，旨在探討揮發(fā)性有機(jī)化合物是否對(duì)煙草的抗病性及生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)地設(shè)在云南石林煙莊，屬亞熱帶季風(fēng)氣候。供試煙草品種為K326；玫瑰品種為墨紅。試驗(yàn)地總面積為5040 m2，平均分為2塊地，一塊地種植煙草21行；另一塊地玫瑰與煙草間作，煙草7行，玫瑰14行，行距均為1.2 m，株距均為50 cm，煙草和玫瑰分別于2012年5月和2011年12月移栽。2012年8月5點(diǎn)取樣法采集2塊地團(tuán)棵期煙株中上部上數(shù)第4片煙葉葉尖，每塊地的5份葉尖混合作為1份樣品，置-80℃冰箱備用。

1.2 蛋白質(zhì)提取

稱取1.0 g煙草葉片。參照Su等[10]方法提取葉片總蛋白質(zhì)。 Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度[11]。

1.3 雙向電泳

每根IPG膠條的上樣量為600 μg，溶解在500μL的水化液（7 M尿素，2 M硫脲，4%CHAPS，65 mM DTT，0.2% IPG）中在IPGphorII中進(jìn)行等電聚焦。其聚焦程序：250 V 30 min，500 V 30 min，1000 V 30 min，8000 V 4 h，8000 V 65000 Vh。待等電聚焦結(jié)束，把IPG膠條分別放在平衡液1（6 M 尿素，2% SDS，50 mM Tris-HCl pH 8.8，20% 甘油，2% DTT）和平衡液2（6 M 尿素，2% SDS，50 mM Tris-HCl pH 8.8，20% 甘油，2.5% 碘乙酰胺）中先后各平衡15 min。平衡結(jié)束后將膠條轉(zhuǎn)移至含12.5%的聚丙烯酰胺上進(jìn)行第二向電泳。膠條用考馬斯亮藍(lán)G-250染色。

1.4 凝膠圖譜分析及差異點(diǎn)的確定

脫色后的凝膠用UMAX Power Look掃描儀掃描，分辨率設(shè)置為300 dpi的灰度模式。使用Image Master 5.0軟件進(jìn)行圖譜分析。以其中一塊以單作煙草為樣品的電泳圖譜為參考膠，其余5塊均與其進(jìn)行自動(dòng)匹配分析蛋白點(diǎn)之間的差異。參數(shù)設(shè)定為Smooth 2，Min Area 5，Saliency30。篩選3次試驗(yàn)中選取處理組與對(duì)照組相對(duì)豐度（vol%）大于2倍改變的點(diǎn)為差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)（包括有無蛋白），挖取并質(zhì)譜檢測(cè)。

1.5 MALDI-TOF/TOF MS分析及數(shù)據(jù)庫檢索

將所挖取的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)脫色、酶解、酶解產(chǎn)物的抽提和脫鹽，利用ABI公司的4800 Proteomics Analyzer MALDI-TOF/TOF儀器進(jìn)行分析，將質(zhì)譜儀分析獲得的質(zhì)譜PMF圖譜、二級(jí)質(zhì)譜圖，通過 Mascot搜 索 引 擎（http∶//matrixsciece.com） 進(jìn)行蛋白質(zhì)檢索。檢索的數(shù)據(jù)庫為NCBInr（NCBINational center for biotechnology information），物種為Viridplantae（綠色植物）。

1.6 差異表達(dá)蛋白亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)

利用植物蛋白亞細(xì)胞定位在線預(yù)測(cè)軟件PlantmPLoc[12]（http∶//www.csbio.sjtu.edu.cn/ bioinf/plantmulti/）進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.7 GO注釋

按 照 Gene Ontology（http∶//geneontology.org/）基因功能分類體系，對(duì)所有鑒定出的差異蛋白進(jìn)行GO功能注釋分析，并對(duì)三個(gè)本體（Ontology）：生物過程（Biological Process）、細(xì)胞位置（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）中所涉及的GO條目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 差異表達(dá)蛋白的代謝途徑分析

利用生物信息學(xué)在線工具KOBAS 2.0軟件[13]（http∶//kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do）對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行代謝途徑分析。

1.9 差異表達(dá)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

采 用 STRING 數(shù) 據(jù) 庫[14]（http∶//www.string-db.org/）對(duì)受玫瑰花花香影響的煙草差異蛋白進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建差異表達(dá)蛋白間的互作網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 煙草葉片蛋白質(zhì)2D圖譜

選用pH 4～7范圍，24 cm的IPG膠條，對(duì)煙葉的總蛋白質(zhì)提取樣重復(fù)雙向電泳，一次同時(shí)電泳6塊膠，得到分辨率和重復(fù)性均較好的6張2-DE圖譜（圖1）。利用ImageMaster 5.0軟件對(duì)6張圖譜進(jìn)行分析，通過圖譜比較分析發(fā)現(xiàn)，每張凝膠上都可檢測(cè)到400左右個(gè)可重復(fù)清晰的蛋白點(diǎn)，其中有26個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)豐度在處理與對(duì)照間存在顯著差異且分離清晰。

圖1 煙草葉片總蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜Fig.1 2-DE maps of tobacco leaf proteins

2.2 差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

26個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，除了6個(gè)蛋白點(diǎn)( spot3,5,8,19,22和24)未檢測(cè)成功外，共有20個(gè)差異蛋白點(diǎn)成功鑒定，在成功鑒定的差異蛋白中共包括 17個(gè)下調(diào)蛋白，2個(gè)上調(diào)蛋白，1個(gè)蛋白的表達(dá)量消失。其中2個(gè)上調(diào)蛋白分別為4號(hào)β-1,3-葡聚糖酶(PR2)和14號(hào)24K類萌發(fā)素蛋白(germin-like protein, GLP)，該2種蛋白在間作玫瑰的煙草葉片中表達(dá)量上升（表1）。

表1 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的鑒定結(jié)果Tab.1 Different espression spots identified by MALDI-TOF/TOF MS

2.3 差異表達(dá)蛋白亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)

圖2 差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的亞細(xì)胞定位分析Fig.2 Subcelluar location of differently expressed proteins

由圖2可看出，20個(gè)蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞的4個(gè)部位，其中在細(xì)胞壁和胞外區(qū)的蛋白質(zhì)各僅有1個(gè)，分別為14號(hào)蛋白和4號(hào)蛋白；細(xì)胞核上的2個(gè)，分別為13號(hào)、15號(hào)蛋白；其余16個(gè)蛋白均定位在葉綠體上，比例高達(dá)80%。

2.4 差異表達(dá)蛋白的GO注釋

為明確差異表達(dá)蛋白的功能，利用GO功能分類系統(tǒng)對(duì)20個(gè)鑒定的差異蛋白進(jìn)行生物過程、分子功能和細(xì)胞位置分類（圖3）。這20個(gè)蛋白主要參與生物過程中的細(xì)胞過程（18%）、細(xì)胞成分組織或生物起源（13%）、生物調(diào)控（12%）、代謝過程（12%）和定位（10%）。分子功能中的鏈接（52%）和催化活性（29%）。細(xì)胞位置中的細(xì)胞（29%）、細(xì)胞器（19%）、部分細(xì)胞（19%）、部分細(xì)胞器（10%）和胞外區(qū)（12%）。

圖3 差異表達(dá)蛋白的GO注釋Fig.3 GO analysis of differently expressed proteins

2.5 KOBAS分析差異表達(dá)蛋白的代謝途徑

為了解差異表達(dá)蛋白參與的代謝途徑，用KOBAS 2.0軟件對(duì)20個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析，以確定它們屬于哪一類生化代謝途徑（表2）。KOBAS 2.0分析把20個(gè)差異表達(dá)蛋白定位于8個(gè)代謝途徑。其中25號(hào)、26號(hào)、21號(hào)、23號(hào)、18號(hào)和1號(hào)6個(gè)蛋白既可能參與二羧酸代謝也可能參與碳代謝。9號(hào)、20號(hào)蛋白參與光合作用，其中9號(hào)蛋白是光系統(tǒng)II放氧復(fù)合體的外周蛋白PsbP，20號(hào)蛋白是細(xì)胞色素b/f復(fù)合物中的PetC蛋白。光合作用天線蛋白，氮代謝和蛋白酶體各一個(gè)蛋白。依此推測(cè)與玫瑰間作可能影響煙葉細(xì)胞中碳代謝和光合作用的相關(guān)蛋白。

表2 差異蛋白參與的代謝途徑Tab.2 Metabolic pathways of differently expressed proteins

2.6 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖譜

通過STRING在線分析數(shù)據(jù)庫對(duì)20個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析(圖4)，從圖4可以看出，這些蛋白之間有密切的作用關(guān)系，構(gòu)成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的差異表達(dá)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)20個(gè)差異表達(dá)蛋白可分為4類（圖5）。1號(hào)、18號(hào)、26號(hào)蛋白同為RBCS1B，21號(hào)、23號(hào)、25號(hào)蛋白同為RBCS1A， RCA蛋白與AT2G05840.1蛋白聚為一類，共同參與1,5二磷酸核酮糖轉(zhuǎn)化為磷酸乙醇酸的反應(yīng)。蛋白PETC、AT2G37660、AT1G77090聚為一類，說明AT2G37660未知蛋白可能是參與光合作用反應(yīng)相關(guān)蛋白。蛋白DHAR3、PSBP-1、LHCA1聚為一類。剩下的GER3、CA1、BGL2和EDA14為一類，說明EDA14推測(cè)蛋白與抗病蛋白在功能上緊密相關(guān)，這一預(yù)測(cè)結(jié)果還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

圖4 差異表達(dá)蛋白的蛋白—蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Protein-protein interaction network of the differentially expressed proteins

圖5 差異表達(dá)蛋白的聚類互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Clustering network map of the differentially expressed proteins

3 討論

植物揮發(fā)性有機(jī)化合物是通過植物體內(nèi)的次生代謝途徑合成的低沸點(diǎn)、易揮發(fā)的小分子化合物，其含量低但化學(xué)活性很高，在調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和環(huán)境脅迫等方面具有重要作用[15-17]。

3.1 防衛(wèi)反應(yīng)

防衛(wèi)反應(yīng)在抗病機(jī)制中起最終作用，防衛(wèi)反應(yīng)蛋白具有普遍性，一般是受誘導(dǎo)表達(dá)。PR2（點(diǎn)4）是植物病程相關(guān)蛋白中的一個(gè)重要類群，可由一些特定化合物，例如水楊酸（SA）[18]、茉莉酸（JA）[19]、β-氨基丁酸（BABA）[20]等化學(xué)因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，在植物抗病過程中擔(dān)任重要角色。因PR2可以水解真菌細(xì)胞壁的主要成分β-1,3-葡聚糖，水解過程釋放的寡糖可作為植物多種抗病反應(yīng)的激發(fā)因子，誘導(dǎo)植物的防衛(wèi)反應(yīng)[21]，PR2是植物的典型抗性標(biāo)志。Yoshikawa等[22]把大豆的β-1,3-葡聚糖酶基因?qū)霟煵菘商岣咿D(zhuǎn)化煙草對(duì)赤星病和黑脛病病菌的抗性。類萌發(fā)素蛋白（點(diǎn)14）是一類含有cupins結(jié)構(gòu)域的糖蛋白，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗性等方面起著重要作用[23]。有些GLP還具有草酸氧化酶或超氧化物歧化酶活性，促使植物細(xì)胞壁更為致密和堅(jiān)固[24]。具有OXO活性的GLP編碼基因?qū)霟煵葜?，可增?qiáng)煙草對(duì)核盤菌的抗性。本研究中，PR2和GLP在間作玫瑰的煙草葉片中上調(diào)表達(dá)，說明玫瑰花香釋放的醇類、萜烯類和酯類等揮發(fā)性有機(jī)化合物質(zhì)可能作為化學(xué)誘導(dǎo)因子促使煙草產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)蛋白，這些蛋白可能通過對(duì)自身和病原菌細(xì)胞壁的作用產(chǎn)生抗性。

3.2 光合作用

光合作用類蛋白質(zhì)RubisCO是卡爾文循環(huán)的關(guān)鍵酶，既參與光合作用又參與光呼吸作用，是所有光合生物進(jìn)行光合碳同化的關(guān)鍵酶，將CO2還原成有機(jī)碳的限速酶。煙草 RubisCO小亞基由細(xì)胞核基因組編碼，然后通過葉綠體膜上的ATP泵進(jìn)入葉綠體，其表達(dá)量可調(diào)節(jié)大亞基翻譯的起始[25]。RubisCO 活化酶（RCA）是一種核基因編碼的葉綠體蛋白，具有ATP酶活性和活化RubisCO的功能。當(dāng)RCA水平下降時(shí)，可促進(jìn)PSI的環(huán)式電子流、類囊體腔的酸化和能量耗散，以緩解碳同化下降導(dǎo)致激發(fā)能過剩[26]。這兩種酶的表達(dá)量在間作煙草葉片中下調(diào)，說明揮發(fā)性有機(jī)物影響光合作用中的碳同化可能使植物生長(zhǎng)發(fā)育所需要的碳源下降，從而對(duì)煙草的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。葉綠素a/b結(jié)合蛋白（點(diǎn)10）能夠迅速把光能傳到光系統(tǒng)Ⅰ和Ⅱ的反應(yīng)中心，引起光化學(xué)反應(yīng)，將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，是光合系統(tǒng)中重要的功能蛋白[27]。碳酸酐酶（carbonic anhydrase,CA）雖然在生物學(xué)功能分類中歸于氣孔運(yùn)動(dòng)調(diào)控類蛋白，但碳酸酐酶（點(diǎn)16）是一種含Zn2+的與光合作用密切相關(guān)的酶，其活性與光合速率和葉肉導(dǎo)度相關(guān)，在CO2傳導(dǎo)和運(yùn)輸中起著重要作用[28]。植物的光合速率和CO2的運(yùn)輸傳遞等間接調(diào)控氣孔運(yùn)動(dòng)。本研究中光合作用相關(guān)蛋白的表達(dá)量在間作玫瑰的煙草葉片中表達(dá)量下調(diào)，說明玫瑰釋放的揮發(fā)物中的某種或某些物質(zhì)通過影響CO2的傳導(dǎo)、運(yùn)輸、還原反應(yīng)以及電子傳遞等直接或間接的影響煙草的光合作用，從而影響煙草的生長(zhǎng)發(fā)育。

植物間可由某些揮發(fā)物進(jìn)行“信息交流”，這些揮發(fā)物可能作為化感物質(zhì)影響植物生長(zhǎng)發(fā)育。化感物質(zhì)可引起葉片中葉綠素含量的降低，造成植物光合作用的下降[29]。

4 結(jié)論

本研究表明，玫瑰散發(fā)的香氣物質(zhì)可能通過促進(jìn)煙草中PR2和24K類萌發(fā)素蛋白等防衛(wèi)反應(yīng)蛋白的表達(dá)來加強(qiáng)其自身的抗病性，該結(jié)論還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。另外對(duì)煙草的光合作用也會(huì)產(chǎn)生一定的影響，玫瑰香氣使煙草的光合作用降低，而光合作用受抑制可能對(duì)煙株生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生抑制作用，是否影響煙葉的品質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)為大田試驗(yàn)，對(duì)于單作與間作玫瑰K326之間檢測(cè)到的蛋白質(zhì)點(diǎn)差異如此之大的原因可能是地下營(yíng)養(yǎng)的競(jìng)爭(zhēng)，可能是地上光照的競(jìng)爭(zhēng)，也可能是地上揮發(fā)性有機(jī)化合物的作用，探明到底是單方面原因還是多方面原因相互作用還有待進(jìn)一步設(shè)計(jì)室內(nèi)盆栽試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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Bioinformatics analysis of protein in leaf of tobacco intercropped with rose plant

XU Jie1, YU Ping2,3,4, DONG Chao1, ZHU Haibin1, ZHANG Jing1, YANG Yi1, LUO Yun1, YAO Chunxin2,3,4, TAO Nan2,3,4,DING Yumei2,3,4,WANG Yaojin5,ZHOU Xiaogang2,3,4
1 Hongyun-Honghe Tobacco (Group)Ltd. Co, Kunming 650202, China；
2 Biotechnology and Genetic Germplasm Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223, China；
3 Kunming University Life science and technology department, Kunming 650223, China；
4 Key Laboratory of Agricultural Biotechnology of Yunnan Province, Kunming 650223, China；
5 Yaoqi Agricultural Development Ltd. Co, Kunming 652200, China

Leaf proteins of tobacco cultivar K326 from monoculture and intercropping with roses were isolated and identified by using two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Bioinformatics analysis identified protein using Plant-mPLoc, Gene ontology,KOBAS, STRING. 400 proteins were isolated in each sample. 20 proteins were identified by MALDI-TOF/TOF MS. Bioinformatics analysis showed that 80% of them were located in chloroplast. They were mainly involved in photosynthesis and carbon metabolism. They were also involved in biological processes such as cellular process, cellular component organization or biogenesis, biological regulation,metabolic process and localization. Flavoring substances from roses can strengthen tobacco resistance to diseases by improving defense responses protein expression on one hand, and reduce tobacco photosynthesis, thus suppressing tobacco growth on the other hand.

rose；flue-cured tobacco；intercropping；bioinformatics

徐潔，余萍，董超，等. 玫瑰與煙草間作對(duì)煙葉蛋白質(zhì)影響的生物信息學(xué)分析[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2016,22（5）

應(yīng)用生物多樣性理論提升煙葉品質(zhì)的技術(shù)研究(2015YL07)

徐 潔(1966—)， 博士，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事煙草原料研究， Email：1262254015@qq.com

周曉罡(1974—)， 研究方向：植物分子生物學(xué)，Email：zxg88@163.com

2015-12-30

：XU Jie, YU Ping, DONG Chao, et al. Bioinformatics analysis of protein in leaf of tobacco intercropped with rose plant [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016, 22(5)