廖光宇　劉成　肖建華　陳名?！±铌栍瘛￡惷h

（1.湖南永州市藍(lán)山縣畜牧水產(chǎn)局動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所425800；2.湖南永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物科學(xué)技術(shù)系劉成425000；3.湖南永州市藍(lán)山縣楠市鎮(zhèn)動(dòng)物防疫站425800）

湖南永州地區(qū)家養(yǎng)犬弓形蟲病的血清學(xué)調(diào)查

廖光宇1劉成2肖建華3陳名海1李陽玉1陳名鋒1

（1.湖南永州市藍(lán)山縣畜牧水產(chǎn)局動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所425800；2.湖南永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物科學(xué)技術(shù)系劉成425000；3.湖南永州市藍(lán)山縣楠市鎮(zhèn)動(dòng)物防疫站425800）

為初步調(diào)查湖南永州地區(qū)家養(yǎng)犬弓形蟲感染情況，筆者于2015年5月至2016年4月用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法檢測(cè)采集的家養(yǎng)犬血清樣本998份，其中，家養(yǎng)犬血清樣本896份，流浪犬血清樣本102份。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，家養(yǎng)犬弓形蟲IgG抗體陽性率23.6%，流浪犬弓形蟲IgG抗體陽性率28.43%，平均感染率為24.15%。家養(yǎng)犬弓形蟲血清抗體陽性率不同季節(jié)間差異顯著（P＜0.05），夏季最高，為31.29%；不同性別家養(yǎng)犬弓形蟲血清抗體陽性率無顯著差異（P＞0.05）。隨著年齡增長，家養(yǎng)犬弓形蟲抗體陽性率均有明顯增長，其中大于5歲的家養(yǎng)犬弓形蟲血清抗體陽性率達(dá)到了26.16%。本次檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，湖南永州地區(qū)犬感染弓形蟲較普遍，需要進(jìn)一步提高自身對(duì)犬弓形蟲病的認(rèn)識(shí)并做好日常防護(hù)工作。

弓形蟲；血清；檢測(cè)；犬

弓形蟲病是由剛地弓形蟲引起的重要人畜共患寄生蟲病，以發(fā)熱、流產(chǎn)、死胎、畸形胎為主要特征，重癥者可引起死亡。此外，弓形蟲感染與艾滋?。ˋIDS）有密切的關(guān)系。剛地弓形蟲是一種呈世界范圍分布的能夠感染多種動(dòng)物的寄生性原蟲，在我國，1978年崔君兆首次在國內(nèi)進(jìn)行流行病學(xué)研究，采用統(tǒng)一的正向間接血凝試驗(yàn)（IHA）方法檢測(cè)全國81963人血清平均感染率為5.17%。與人類關(guān)系密切的犬弓形蟲感染率也非常普遍，據(jù)統(tǒng)計(jì)，1985～2006年期間，我國犬弓形蟲感染率在0.66%～62.3%之間不等。隨著寵物品種和數(shù)量的急劇增加，人類與動(dòng)物接觸的日益頻繁，通過動(dòng)物將寵物源人畜共患病傳播給人類的風(fēng)險(xiǎn)日益加大，給人類健康和正常生活帶來了威脅。因此，無論是就動(dòng)物本身的健康而言，還是考慮到公眾健康，充分了解犬的弓形蟲發(fā)病及感染情況都具有重要現(xiàn)實(shí)意義。為此，筆者于2015年5月至2016年4月運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法（以下簡(jiǎn)稱ELISA法）對(duì)湖南永州地區(qū)896只家養(yǎng)犬的弓形蟲感染情況進(jìn)行了調(diào)查。

1　材料與方法

1.1.1主要儀器及器材酶標(biāo)儀（MULTISKAN MK3），購自Thermo公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（5810R），購自德國Eppendorf公司。洗滌器，50ul、100ul精確微量移液器，一次性移液器吸頭，稀釋樣品的U型96孔稀釋板等。

1.1.2主要試劑犬弓形蟲抗體檢測(cè)試劑盒，購自廣州健侖生物科技有限公司，批號(hào)為20141208。試劑盒中包含抗原預(yù)包被微孔板條96T、酶結(jié)合物（1號(hào)液）、洗滌液（2號(hào)液）、底物（3號(hào)液）、顯色液（4號(hào)液）、樣本稀釋液（5號(hào)液）、終止液（6號(hào)液）、陽性對(duì)照血清和陰性對(duì)照血清。

1.1.3待檢血清采集犬998（1.5ml～2ml/只）只靜脈血，3000r/min離心5min，分離血清，置-20℃保存待檢。

1.2.1樣本稀釋用樣本稀釋液（5號(hào)液）將待檢血清按1：100稀釋。陰、陽對(duì)照血清不用稀釋，直接加樣。

1.2.2加樣反應(yīng)樣本檢測(cè)孔每孔分別加已稀釋待檢血清100ul。同時(shí)設(shè)陰性、陽性及空白對(duì)照各1孔，取陰性、陽性對(duì)照各100ul分別加入反應(yīng)孔內(nèi)，空白對(duì)照孔僅加入100ul樣本稀釋液（5號(hào)液）。37℃避光反應(yīng)30min后甩去孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液（2號(hào)液）1滴，立即用蒸餾水注滿，靜置30s后甩去，再直接用蒸餾水洗滌四次，每次均需靜置30s，最后一次甩去，拍干。

1.2.3加酶反應(yīng)除空白對(duì)照孔外其余每孔加酶結(jié)合物（1號(hào)液）2滴，37℃避光反應(yīng)30min后甩去孔內(nèi)液體，按1.2.2洗滌步驟進(jìn)行，拍干。

1.2.4顯色反應(yīng)每孔加底物（3號(hào)液）和顯色劑（4號(hào)液）各1滴，混勻，37℃下避光顯色10min，然后加終止液（6號(hào)液）1滴，混勻，終止反應(yīng)（加終止液后藍(lán)色會(huì)變?yōu)辄S色）。

1.3結(jié)果判定及統(tǒng)計(jì)分析陰性對(duì)照接近無色，陽性對(duì)照呈明顯黃色，表示實(shí)驗(yàn)有效。待檢孔接近無色表示該標(biāo)本為陰性，待檢孔呈明顯黃色表示該標(biāo)本為陽性。以空白對(duì)照調(diào)零，用酶標(biāo)儀（MULTISKAN MK3）于450nm（620nm作參比波長）測(cè)定OD450nm值。待檢孔OD450nm值大于陰性對(duì)照2.1倍者為陽性。當(dāng)陰性對(duì)照OD450nm值低于0.07時(shí)按0.07計(jì)算。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果

2015年5月至2016年4月期間，共采集到998份血清樣本，其中，家養(yǎng)犬血清樣本896份，流浪犬102份，采用ELISA法對(duì)犬血清進(jìn)行了弓形蟲IgG抗體的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表2—1。結(jié)果顯示，家養(yǎng)犬弓形蟲IgG抗體陽性樣本212份，陽性率為24.2%，流浪犬弓形蟲IgG抗體陽性樣本29份陽性率為28.43%，平均感染率為24.15%。

表2—1　永州地區(qū)犬弓形蟲IgG抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2.1不同季節(jié)家養(yǎng)犬弓形蟲血清抗體陽性率在896份家養(yǎng)犬血清中，不同季節(jié)采集的家養(yǎng)犬血清弓形蟲抗體陽性率變化較大，檢測(cè)結(jié)果見表2—2。結(jié)果顯示，夏季弓形蟲陽性率最高為31.29%，與陽性率最低的春季15.83%。用配對(duì)資料卡方檢驗(yàn)分析，二者差異顯著（P＜0.05）。

2.2.2不同性別家養(yǎng)犬弓形蟲血清抗體陽性率對(duì)已知性別的670只家養(yǎng)犬和未知性別的226只家養(yǎng)犬檢測(cè)結(jié)果見表2—3。結(jié)果顯示，雌性犬血清弓形蟲抗體陽性率為25.82%，雄性犬血清弓形蟲抗體陽性率為20.53%。用配對(duì)資料卡方檢驗(yàn)分析，二者差異不顯著（P＞0.05）。

表2—2　家養(yǎng)犬血清弓形蟲IgG抗體檢測(cè)結(jié)果季節(jié)分布

表2—3　不同性別家養(yǎng)犬弓形蟲血清抗體陽性率

2.2.3不同年齡段家養(yǎng)犬弓形蟲血清抗體陽性率對(duì)已知年齡的1474只家養(yǎng)犬的檢測(cè)結(jié)果見表2—4。結(jié)果顯示，隨著犬年齡增長，弓形蟲血清抗體陽性率呈逐漸上升趨勢(shì)。8月齡以內(nèi)犬弓形蟲血清抗體陽性率僅為17.5%，而大于5歲的犬弓形蟲血清抗體陽性率達(dá)到了26.16%。用配對(duì)資料卡方檢驗(yàn)分析，兩個(gè)年齡段之間，犬弓形蟲血清抗體陽性率差異顯著（P＜0.05）。

表2—4　各個(gè)年齡階段家養(yǎng)犬弓形蟲血清抗體陽檢測(cè)結(jié)果

3　小結(jié)與討論

3.1目前弓形蟲病免疫預(yù)防仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段，尚無安全有效、保護(hù)力強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間長和易于保存的弓形蟲疫苗使用，因此，家養(yǎng)犬的抗體陽性率可以反映出永州地區(qū)弓形蟲正在感染或曾經(jīng)感染的狀況，具有重要的流行病學(xué)意義。本次檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，湖南永州地區(qū)犬感染弓形蟲較普遍，平均感染率為24.15%，這一調(diào)查結(jié)果應(yīng)引起寵物主人的高度重視，需要進(jìn)一步提高自身對(duì)弓形蟲病的認(rèn)識(shí)并做好日常防護(hù)工作。

3.2不同生活習(xí)慣犬的弓形蟲血清抗體陽性率不同，流浪犬陽性率最高，為28.43%，家養(yǎng)犬為23.6%，可能與犬的飲食有關(guān)，流浪犬接觸感染源的機(jī)會(huì)較多，而作為寵物的家養(yǎng)犬，有些是長期生活在室內(nèi)，飼喂商品犬糧，不接觸生肉類，所以感染源的機(jī)會(huì)較低。另外，家養(yǎng)犬一般都有外出遛的習(xí)慣，也可能增加了家養(yǎng)犬感染弓形蟲的機(jī)會(huì)［5］。犬弓形蟲病分布于世界各地，感染范圍很大，可呈先天性感染或獲得性感染。許多學(xué)者認(rèn)為經(jīng)腸道感染可能是犬天然弓形蟲病的主要感染形成。因此，犬主人在攜犬外出時(shí)，應(yīng)用引導(dǎo)繩牽引，避免犬在外撿食，同時(shí)在家飼喂熟食或成品犬糧，避免犬感染弓形蟲病。

3.2檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，家養(yǎng)犬弓形蟲血清抗體陽性率不同季節(jié)間差異顯著（P＜0.05），夏季最高，為31.29%；不同性別家養(yǎng)犬弓形蟲血清抗體陽性率無顯著差異（P＞0.05）；隨著年齡增長，家養(yǎng)犬弓形蟲抗體陽性率均有明顯增長，其中大于5歲的家養(yǎng)犬弓形蟲血清抗體陽性率達(dá)到了26.16%。建議家養(yǎng)犬外出遛時(shí)應(yīng)避開炎熱高溫時(shí)節(jié)。

（略）