應(yīng)雄，賴文芳，許力偉，宋百穎，蘇燕青，南麗紅

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

筋骨草總黃酮抗小鼠肝纖維化的作用機(jī)制

應(yīng)雄，賴文芳，許力偉，宋百穎，蘇燕青，南麗紅

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

目的研究筋骨草總黃酮抗小鼠肝纖維化的作用機(jī)制。方法健康成年雄性昆明種小鼠60只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、筋骨草總黃酮0.54 g／kg組（低劑量組）、筋骨草總黃酮1.08 g／kg組（中劑量組）、筋骨草總黃酮2.16 g／kg組（高劑量組），20%CCl4橄欖油溶液小鼠背部皮下注射，制作小鼠肝纖維化模型，Elisa法檢測(cè)HA、PCⅢ、Ⅳ型膠原、LN的濃度，W estern Blot檢測(cè)MMP-13、TIMP-1、SDF-1α、CXCR 4、GRP78、CRT蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與模型對(duì)照組比較，筋骨草總黃酮3個(gè)劑量組能明顯降低HA、PCⅢ、Ⅳ型膠原、LN含量，促進(jìn)MMP-13的蛋白表達(dá)，抑制TIMP-1、SDF-1α、CXCR 4、GRP78、CRT蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論筋骨草總黃酮抗小鼠肝纖維化的機(jī)制是促進(jìn)MMP-13，抑制TIMP-1、SDF-1、CXCR 4、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子表達(dá)蛋白表達(dá)，使ECM沉積減少，抑制肝纖維化發(fā)生。

筋骨草總黃酮；肝纖維化；細(xì)胞外基質(zhì)；基質(zhì)金屬蛋白酶；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

肝纖維化是肝臟對(duì)各種原因所致肝損傷的修復(fù)反應(yīng)，其特征表現(xiàn)為肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatric，ECM）過(guò)度合成、沉積，是慢性肝病發(fā)展為肝硬化的中間過(guò)程，也是發(fā)生肝癌的危險(xiǎn)因素之一，是各種慢性肝病的共同病理過(guò)程。肝纖維化伴隨著肝臟形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的改變，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和代謝的異常［1］。肝星狀細(xì)胞（haptic stellate cel1，HSC）是肝臟病理情況下ECM沉積的主要細(xì)胞來(lái)源，在纖維化發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)變中，處于中心細(xì)胞環(huán)節(jié)的地位。在肝臟病理情況下，HSC可分泌Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原、層黏蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）等多種ECM成分，用以修補(bǔ)壞死脫落的肝組織缺損空間?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）屬于趨化因子CXC亞家族成員，CXCR4為其受體。研究發(fā)現(xiàn)，肝組織卵圓細(xì)胞增殖及外周血干細(xì)胞可促進(jìn)肝組織再生，SDF-1和CXCR4基因在體內(nèi)動(dòng)員和活化中起到重要作用［2］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（（endoplasmicreticulum stress，ERS）與慢性肝損傷尤其是肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性，鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）與GRP78作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白［3］，目前對(duì)SDF-1、CXCR4、CRT與GRP78在肝纖維化肝組織中的研究尚少。

筋骨草為唇形科植物金瘡小草（Ajuga Decumbens Thunb）的全草，性味苦寒，具有燥濕解毒、清熱瀉火、養(yǎng)筋活血的功效，對(duì)多種細(xì)菌具有抑制作用，其主要有效部位為黃酮類、研究表明筋骨草黃酮類具有改善肝細(xì)胞功能的保肝作用［4］。本研究通過(guò)檢測(cè)ECM主要成分HA、PCⅢ、Col-Ⅳ和LN的含量，研究筋骨草總黃酮對(duì)小鼠肝纖維化的作用機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物選取健康昆明種小鼠60只，雌雄各半，SPF級(jí)，體質(zhì)量20～25 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（閩）2012-0001，福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。

1.2試劑筋骨草總黃酮（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室，總黃酮含量為18.14%）；MMP-13多克隆抗體（批號(hào)：sc-30073）、TIMP-13多克隆抗體（批號(hào)：sc-21734）、SDF-1α多克隆抗體（批號(hào)：sc-28876）、CXCR4多克隆抗體（批號(hào)：sc-9046）、GRP78多克隆抗體（批號(hào)：sc-376768）、CRT多克隆抗體（美國(guó)santa cruz公司，批號(hào)：sc-8861）；β-actin（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：H015）；HA（北京博奧森生物公司，批號(hào)：ER-1398）；PCⅢElisa試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：H212）；Ⅳ型膠原Elisa試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：H145）；LN Elisa試劑盒（上海信裕生物科技有限公司，批號(hào)：SEA082Mu）。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-rad公司）、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1模型的制備用CC145 m L／kg在小鼠背部皮下注射，后用20%CCl4橄欖油溶液5 m L／kg在背部皮下注射，3 d 1次，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水和進(jìn)食。

2.2實(shí)驗(yàn)分組與處理昆明種小鼠60只，適應(yīng)喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，于造模第4周，5組小鼠灌胃給藥，按30 mL／kg分別給予生理鹽水和筋骨草總黃酮。低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予筋骨草總黃酮0.54 g／kg、1.08 g／kg、2.16 g／kg，每日1次，連續(xù)4周。末次給藥2 h后，摘眼球取血，取肝組織凍存于液氮，備用。

2.3Elisa測(cè)定按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清HA、PCⅢ、Col-Ⅳ、LN相對(duì)含量。

2.4Western blot檢測(cè)大鼠肝組織MMP-13、TIMP-1、SDF-1α、CXCR4、GRP78、CRT的蛋白表達(dá)提取總蛋白，用SDS-PAGE垂直板全濕法電泳，總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用封閉液封閉2 h后，加入稀釋的一抗（MMP-13抗體1∶500、TIMP-1抗體1∶800、SDF-1α抗體1∶800、CXCR4抗體1∶800、GRP78抗體1∶300、CRT抗體1∶500、β-actin單克隆抗體1∶3 000，4℃下孵育過(guò)夜，次日TBS洗3遍，每次10 min，加入1∶1000稀釋HRP標(biāo)記二抗，室溫下孵育2 h后TBS洗膜。加ECL試劑，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)，分析目標(biāo)條帶的灰度值，計(jì)算3個(gè)給藥組與空白對(duì)照組灰度值的比值，并統(tǒng)計(jì)各組之間的差異。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用x±s表示，用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1筋骨草總黃酮對(duì)肝纖維化小鼠血清HA、PCⅢ、Ⅳ型膠原、LN含量的影響見表1。

3.2TFA對(duì)肝纖維化小鼠MMP-13和TIMP-1蛋白表達(dá)的影響見圖1、表2。

3.3TFA對(duì)肝纖維化小鼠SDF-1α和CXCR4蛋白表達(dá)的影響見圖2、表3。

3.4TFA對(duì)肝纖維化小鼠GRP78和CRT蛋白表達(dá)的影響見圖3、表4。

表2　筋骨草總黃酮對(duì)MMP-13、TIMP-1蛋白表達(dá)的影響（x±s）

4　討論

4.1HA、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、LN是ECM的主要成分，病理狀態(tài)下HA、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ的表達(dá)為靜止時(shí)的60～70倍。經(jīng)TFA作用后，HA、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、LN含量顯著降低?；|(zhì)金屬蛋白酶MMP-13是降解ECM的主要間質(zhì)膠原酶，MMP-13主要受TIMP-1調(diào)控。我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)TFA不同濃度作用后，MMP-13蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，TIMP-1蛋白明顯下調(diào)，結(jié)果表明筋骨草總黃酮可通過(guò)促進(jìn)MMP-13、抑制TIMP-1蛋白表達(dá)，促進(jìn)HA、Col-Ⅲ、Col-Ⅳ、LN含量降解，抑制細(xì)胞外基質(zhì)積聚。

表3　筋骨草總黃酮對(duì)SDF-1α和CXCR4蛋白表達(dá)的影響（x±s）

表4　筋骨草總黃酮對(duì)GRP78和CRT蛋白表達(dá)的影響（x±s）

4.2SDF-1有2個(gè)亞型：SDF-1α和SDF-1β，它們是由同一基因編碼的2種不同的拼接變異體，二者在表達(dá)及功能上無(wú)明顯區(qū)別。人與小鼠的SDF-1有99%同源性，且CXCR4為SDF-1唯一受體。本研究發(fā)現(xiàn)模型對(duì)照組小鼠SDF-1和CXCR4表達(dá)升高，這部分是因?yàn)楦窝讜r(shí)，膽管上皮細(xì)胞及膽小管增生，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致肝炎組織SDF-1和CXCR4表達(dá)升高，經(jīng)不同濃度TFA作用后，SDF-1和CXCR4表達(dá)降低。研究表明，在肝細(xì)胞損傷時(shí)，蛋白質(zhì)不能在肝細(xì)胞內(nèi)正常折疊而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中，會(huì)發(fā)生一系列細(xì)胞因子，如TGF-β等，細(xì)胞因子促使肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生膠原纖維，最終導(dǎo)致纖維化的發(fā)生［5］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78介導(dǎo)新生蛋白的加工成熟，是細(xì)胞蛋白質(zhì)成熟、維系細(xì)胞功能和生命的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)蛋白，被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白［6］。我們的研究表明在肝纖維化小鼠的肝組織中，GRP78、CRT蛋白表達(dá)水平顯著升高，經(jīng)筋骨草總黃酮不同濃度作用后，能夠降低GRP78、CRT蛋白表達(dá)水平。

綜上所述，用20%的CCl4橄欖油溶液建立的小鼠肝纖維化模型中，ECM含量異常增高，MMP-13、TIMP-1、SDF-1、CXCR4、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子表達(dá)異常，參與了肝纖維化的發(fā)生。經(jīng)TFA不同濃度作用后，能使ECM沉積減少，逆轉(zhuǎn)相關(guān)基因的表達(dá)，抑制肝纖維化的發(fā)生。

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R285.5

B

1000-338X（2016）05-0013-03

2016-05-10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題（81473382），福建省自然科學(xué)基金資助課題（2015J01328），福建中醫(yī)藥大學(xué)科技項(xiàng)目資助課題（X2013010）

應(yīng)雄（1992—），男，2014級(jí)藥理學(xué)專業(yè)碩士研究生，主要從事藥理學(xué)研究。

南麗紅（1985—），女，副教授。E-mail：13559102126@163. com