王子茹，徐升敏，吳李君*

(1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與光電技術(shù)學(xué)院，安徽 合肥 230026；2.中國科學(xué)院 合肥物質(zhì)科學(xué)研究院 環(huán)境毒理與污染控制技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031)

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納米銀與富里酸對AL細(xì)胞增殖及產(chǎn)生RNS/ROS的影響

王子茹1,2，徐升敏2，吳李君1,2*

(1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與光電技術(shù)學(xué)院，安徽 合肥 230026；2.中國科學(xué)院 合肥物質(zhì)科學(xué)研究院 環(huán)境毒理與污染控制技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031)

利用ALamar Blue法和RNS/ROS熒光特異性探針，探討不同濃度納米銀(nAg，0.1～5 μg·mL-1)、銀離子(Ag+，0.01～0.5 μg·mL-1)及納米銀與富里酸(FA，10 μg·mL-1)協(xié)同作用對人鼠雜交瘤(AL)細(xì)胞增殖及活性氮/活性氧自由基產(chǎn)生的影響及在這一過程中的作用.結(jié)果顯示：在低濃度(小于等于1 μg·mL-1)情況下，nAg對AL細(xì)胞的毒性作用主要來自于nAg釋放的銀離子(Ag+)，Ag+通過誘導(dǎo)胞內(nèi)RNS的產(chǎn)生，進(jìn)而產(chǎn)生增殖抑制作用;在高濃度(5 μg·mL-1)情況下，nAg對AL細(xì)胞的毒性主要來自于Ag+誘導(dǎo)的RNS和nAg本身誘導(dǎo)的ROS二者共同的作用.模擬水環(huán)境中存在的FA(10 μg·mL-1)能夠顯著降低nAg和Ag+對AL細(xì)胞增殖的抑制作用，并且能顯著降低nAg和Ag+引起的AL細(xì)胞內(nèi)RNS和ROS的升高作用.

納米銀；富里酸；自由基；增殖抑制

因?yàn)橥怀龅目咕饔?，納米銀(silver nanoparticles，簡稱nAg)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、水質(zhì)處理、空氣凈化等生產(chǎn)及生活的各個(gè)方面.nAg的大量使用將不可避免地導(dǎo)致其進(jìn)入水環(huán)境并擴(kuò)散，對環(huán)境及人類健康產(chǎn)生潛在的危害，因此nAg的安全性評估也受到人們的廣泛關(guān)注.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)為評價(jià)nAg細(xì)胞毒性提供了有力手段，目前的研究發(fā)現(xiàn)nAg可以引起細(xì)胞毒性和基因毒性等在內(nèi)的各種毒性效應(yīng)[1-5].如nAg對MCF-7細(xì)胞可以產(chǎn)生細(xì)胞毒性[1].報(bào)道還顯示小粒徑的nAg與大粒徑的nAg相比更容易改變細(xì)胞的新陳代謝等[4].同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)納米銀對不同的細(xì)胞毒性存在差異，如通過研究發(fā)現(xiàn)納米銀對HepG2比對L02細(xì)胞活性影響更大[5].此外，nAg進(jìn)入水環(huán)境中會(huì)釋放出銀離子(Ag+)[4]，由于Ag+也能產(chǎn)生生物學(xué)作用，nAg的生物毒性是來源于其本身還是其釋放的Ag+引起的有待進(jìn)一步研究.nAg對不同細(xì)胞產(chǎn)生的毒性效應(yīng)是有差別的.中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)與人成纖維細(xì)胞構(gòu)建的雜交瘤AL細(xì)胞已被用于輻射等多種環(huán)境因素的細(xì)胞和遺傳毒性的檢測，該檢測系統(tǒng)相比于其他體系更加靈敏[6-7].因此，筆者利用雜交瘤AL細(xì)胞來探討不同濃度的nAg的細(xì)胞毒性.

富里酸(fulvic acid，簡稱FA)普遍存在于水環(huán)境中，由于其具有多種功能性基團(tuán)[8]，這些基團(tuán)可能與金屬離子和納米材料相互作用.這些相互作用可能會(huì)改變納米材料的環(huán)境行為，也可能影響納米材料的生物毒性.因此，F(xiàn)A可能會(huì)對水環(huán)境nAg產(chǎn)生作用，進(jìn)而引起nAg生物毒性的改變.所以這種作用對nAg生物毒性影響的研究對實(shí)際評價(jià)nAg在環(huán)境中的毒性效應(yīng)是十分必要的.

自由基主要有活性氧自由基(reactive oxygen species，簡稱ROS)及活性氮自由基(reactive nitrogen species，簡稱RNS)[9].研究發(fā)現(xiàn)，自由基可以顯著影響細(xì)胞活力水平，因此被作為一個(gè)重要的指標(biāo)來間接反映細(xì)胞受影響的程度[10].在外源物質(zhì)的刺激下，能使細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，使細(xì)胞內(nèi)高活性分子如ROS及RNS產(chǎn)生過多，從而改變線粒體功能，使脂質(zhì)和DNA產(chǎn)生氧化損傷,進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[11].

因此，筆者擬對nAg、FA與nAg的協(xié)同作用對AL細(xì)胞增殖和RNS/ROS產(chǎn)生的影響進(jìn)行研究，并以nAg在培養(yǎng)基中釋放約有濃度為10%的Ag+量到溶液中作為nAg的實(shí)驗(yàn)對照，探討自由基在nAg誘導(dǎo)AL細(xì)胞毒性中的作用，為進(jìn)一步研究nAg毒理學(xué)安全性評價(jià)提供參考依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

nAg(貨號(hào)576832-5G，小于100 nm)、硝酸銀、甘氨酸、ALamar Blue試劑等購自sigma公司.FA(貨號(hào) 479-66-3)購自上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司.F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone公司.慶大霉素購自江蘇漣水制藥有限公司.RNS的熒光探針由中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院王素華教授饋贈(zèng)，使用方法參考文獻(xiàn)[12].

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀(SpectraMax M2)、熒光顯微鏡(OLYMPUS IX71)、高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、細(xì)胞計(jì)數(shù)板(Bright-LineTMHemacytometer)、CK2倒置光學(xué)顯微鏡(Olympus 公司)、艾科浦超純水系統(tǒng)(美國Aquapro公司)、低溫高速離心機(jī)(MR1822,Jouan,France)、電感耦合等離子體-質(zhì)譜儀(ICP-MS)(Agilent 7500CE).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鈉米銀(nAg)、硝酸銀溶液以及FA與nAg復(fù)合體系的制備

nAg溶于無菌超純水中配制成1 mg·mL-1的儲(chǔ)備液，低溫超聲 30 min 后，儲(chǔ)備液于4 ℃保存?zhèn)溆茫褂们皟?chǔ)備液低溫超聲振蕩10 min，用含 8% 胎牛血清的F12培養(yǎng)液稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度，混勻后使用.硝酸銀(即Ag+)溶于無菌超純水中配制成1 mg·mL-1的儲(chǔ)備液，儲(chǔ)備液于4 ℃保存?zhèn)溆茫煤?%胎牛血清的F12培養(yǎng)液稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度，混勻后使用.FA溶于無菌超純水中配制成1 mg·mL-1的儲(chǔ)備液，儲(chǔ)備液于4 ℃保存?zhèn)溆?，使用前在?shí)驗(yàn)所需的不同濃度的nAg溶液中加入終濃度為10 μg·mL-1FA即得FA與nAg復(fù)合體系，混勻后使用[13].

1.3.2 納米銀溶液中釋放的銀離子測定

將暴露在培養(yǎng)基24 h的nAg溶液從96孔板收集后加入超濾管中，50 000 r·min-1的超速離心機(jī)離心1 h分離出nAg溶液中的Ag+溶液，隨后將過濾液用10%的硝酸酸化后用電感耦合等離子體-質(zhì)譜儀(ICP-MS)測定溶液中的Ag+濃度.

1.3.3 細(xì)胞的培養(yǎng)

人鼠雜交瘤AL細(xì)胞(由哥倫比亞大學(xué)Tom K.Hei 教授饋贈(zèng))培養(yǎng)在含有8%胎牛血清、2×10-4M甘氨酸和25 μg·mL-1慶大霉素的F12完全培養(yǎng)液中.細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37 ℃，CO2濃度為5%常規(guī)傳代培養(yǎng).

1.3.4 ALamar Blue分析

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1× 105cell·mL-1，接種于96孔板，培養(yǎng)過夜后吸去原培養(yǎng)液，分別加入0(對照)，0.1，0.5，1，5 μg·mL-1的nAg溶液和0(對照)，0.01，0.05，0.1，0.5 μg·mL-1Ag+溶液以及0(對照)，F(xiàn)A(對照)，0.1，0.5，1，5 μg·mL-1的 FA與nAg的復(fù)合溶液，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，染毒24 h后，用PBS洗滌3次，加入含10% ALamar Blue溶液的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后終止培養(yǎng)，采用酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長550 nm，發(fā)射波長590 nm)，此Alamar Blue法測定的熒光強(qiáng)度與活性細(xì)胞數(shù)成正比[14]，得到實(shí)驗(yàn)組和只有培養(yǎng)液的空白對照值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率

1.3.5 RNS的檢測

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1× 105cells·mL-1，接種于96孔板，培養(yǎng)過夜后吸去原培養(yǎng)液，分別加入0(對照)，0.1，0.5、1，5 μg·mL-1的nAg溶液和0(對照)，0.01，0.05，0.1，0.5 μg·mL-1Ag+溶液以及0(對照)，F(xiàn)A(對照)，0.1，0.5，1，5 μg·mL-1包含10 μg·mL-1FA與nAg的復(fù)合溶液，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，染毒24 h后，用PBS洗滌3次，加入含6 μM probe-DOTAP(方法參考文獻(xiàn)[11])溶液的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)5 h后終止培養(yǎng)，PBS洗滌3次，采用熒光顯微鏡綠光激發(fā)，觀察RNS成像，用Image J圖片分析軟件分析RNS熒光強(qiáng)度[15].

1.3.6 ROS的檢測

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1× 105cells·mL-1，接種于96孔板，培養(yǎng)過夜后吸去原培養(yǎng)液，分別加入0(對照)，0.1，0.5，1，5 μg·mL-1的nAg溶液和0(對照)，0.01，0.05，0.1，0.5 μg·mL-1Ag+溶液以及0(對照)，F(xiàn)A(對照)，0.1，0.5，1，5 μg·mL-1包含10 μg·mL-1FA與nAg的復(fù)合溶液，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，染毒24 h后，用D-Hanks液洗3次，每孔加入含20 μM DCFH-DA的無胎牛血清F12培養(yǎng)液50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用D-Hanks液(含1% FBS)洗3次，采用酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm).按以下公式計(jì)算細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有樣品均設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)，RNS熒光圖片應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件分析并進(jìn)行繪圖.數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，用方差分析法對數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異顯著性比較，P<0.05表示差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*代表與對照組比較的顯著性差異(*P<0.05)，#代表nAg與Ag+組比較的顯著性差異(#P<0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 nAg溶液中釋放出的Ag+濃度

培養(yǎng)基中分別加入0(對照)，0.1，0.5，1，5 μg·mL-1的nAg溶液，暴露24 h，收集離心后，用電感耦合等離子體-質(zhì)譜儀(ICP-MS)進(jìn)行測定.0(對照)，0.1，0.5，1，5 μg·mL-1的nAg溶液釋放的Ag+的平均濃度為6×10-6，0.009 6，0.047，0.095，0.46 μg·mL-1.這表明實(shí)驗(yàn)中使用的nAg在培養(yǎng)液中暴露24 h約有濃度為9.4%的Ag+量的釋放.因此，以nAg釋放出約10% Ag+的相同濃度硝酸銀溶液作為nAg的對照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究(表1).

表1 nAg在培養(yǎng)基中釋放的Ag+濃度及釋放的Ag+占原nAg百分比

2.2 nAg和Ag+對AL細(xì)胞毒性的影響

ALamar Blue分析結(jié)果表明，nAg處理AL細(xì)胞24 h，隨著染毒濃度的升高，AL細(xì)胞的存活率呈下降趨勢，即對AL毒性隨nAg濃度的升高增強(qiáng).與對照組相比，染毒濃度0.1 μg·mL-1nAg 處理對AL細(xì)胞增殖影響不大，0.5，1 μg·mL-1nAg處理AL細(xì)胞可以使細(xì)胞相對活力下降至89%，81%，而5 μg·mL-1nAg處理使細(xì)胞活力下降至36%，其抑制作用遠(yuǎn)大于0.5，1 μg·mL-1nAg的影響(圖1).研究還發(fā)現(xiàn)，0.5，1 μg·mL-1的nAg對細(xì)胞增殖的抑制作用與0.05，0.1 μg·mL-1Ag+對細(xì)胞增殖的抑制作用相當(dāng)，而5 μg·mL-1nAg的細(xì)胞增殖的抑制作用遠(yuǎn)大于0.5 μg·mL-1Ag+.0.05 μg·mL-1及以上劑量 Ag+處理AL細(xì)胞24 h后，細(xì)胞的存活率顯著降低(圖1).

圖1 nAg和Ag+對AL細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of nAg and Ag+ on viability of AL cells

2.3 nAg和Ag+對AL細(xì)胞產(chǎn)生RNS/ROS的影響

根據(jù)nAg和Ag+對AL細(xì)胞毒性的影響，進(jìn)一步檢測其對AL細(xì)胞RNS的影響.熒光顯微鏡觀察的結(jié)果經(jīng)Image J分析顯示，染毒濃度為0，0.1，0.5，1，5 μg·mL-1nAg處理AL細(xì)胞24 h后，各劑量nAg暴露組AL細(xì)胞的RNS相對熒光強(qiáng)度均較高.其中，與對照組相比，0.1，0.5，1，5 μg·mL-1nAg處理AL細(xì)胞24 h后，各劑量nAg暴露組AL細(xì)胞的RNS相對熒光強(qiáng)度增加了29%，30%，41%，72%(圖2).0，0.01，0.05，0.1，0.5 μg·mL-1Ag+處理AL細(xì)胞24 h后，各劑量Ag+暴露組AL細(xì)胞的RNS相對熒光強(qiáng)度也均有顯著性提升.并且nAg產(chǎn)生的胞內(nèi)RNS與其10%濃度相對應(yīng)的Ag+導(dǎo)致的細(xì)胞RNS熒光強(qiáng)度增加相當(dāng)(圖2A).

圖2 nAg和Ag+對AL細(xì)胞內(nèi)RNS/ROS水平的影響 Fig.2 Effect of nAg and Ag+ on RNS/ROS production in AL cells

此外，ROS熒光檢測結(jié)果顯示，染毒濃度為0，0.1，0.5，1，5 μg·mL-1nAg處理AL細(xì)胞24 h后，各劑量nAg暴露組AL細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度均升高.與對照組相比，0.1，0.5，1，5 μg·mL-1nAg處理AL細(xì)胞24 h后，各劑量nAg暴露組AL細(xì)胞的RNS相對熒光強(qiáng)度分別增加了12%，27%，35%，59%(圖2A).而Ag+處理AL細(xì)胞24 h后，與對照組相比，0.01，0.05 μg·mL-1Ag+能夠顯著誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS的增加，0.1，0.5 μg·mL-1Ag+對ROS水平?jīng)]有影響.其中，0.01，0.05 μg·mL-1Ag+處理AL細(xì)胞24 h后，AL細(xì)胞的RNS相對熒光強(qiáng)度增加了22%，9%(圖2B).

2.4 FA與nAg的協(xié)同作用對細(xì)胞毒性和RNS/ROS產(chǎn)生的影響及與nAg的比較

筆者研究發(fā)現(xiàn)，nAg與10 μg·mL-1FA的共處理，可以使nAg的毒性降低，顯著恢復(fù)細(xì)胞的活力，表2顯示，5 μg·mL-1nAg與10 μg·mL-1FA共處理AL細(xì)胞24 h，其細(xì)胞活力恢復(fù)得最多，可以恢復(fù)到61%.10 μg·mL-1FA 能夠顯著降低胞內(nèi)RNS水平，有清除胞內(nèi)自由基的作用.與對照組相比，1，5 μg·mL-1nAg與10 μg·mL-1FA處理AL細(xì)胞24 h后，各劑量nAg暴露組AL細(xì)胞的RNS相對熒光強(qiáng)度僅增加了18%,51%，比nAg誘導(dǎo)的胞內(nèi)RNS水平相比明顯降低(表2).當(dāng)加入FA后，在FA的協(xié)同作用下，nAg對AL細(xì)胞的ROS影響顯著降低.其中，與對照組相比，0.1，0.5，1，5 μg·mL-1nAg分別與10 μg·mL-1FA共處理AL細(xì)胞24 h后，各劑量nAg暴露組AL細(xì)胞的ROS相對熒光強(qiáng)度變化不大(表2).

表2 nAg和FA(10 μg·mL)與nAg的協(xié)同作用對AL細(xì)胞活力、胞內(nèi)RNS水平、胞內(nèi)ROS水平的影響

注：a指AL細(xì)胞暴露nAg時(shí)的對照為空白對照，暴露FA+nAg時(shí)的對照為10 μg·mL-1FA對照；b指相同濃度的nAg時(shí)，當(dāng)加入10 μg·mL-1FA共處理后，F(xiàn)A+nAg和nAg對AL細(xì)胞活力、胞內(nèi)RNS水平或胞內(nèi)ROS水平的影響變化的百分比.

3 討 論

文中的ALamar Blue實(shí)驗(yàn)顯示，不同劑量的nAg對AL細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制作用且呈劑量依賴效應(yīng).nAg溶液中釋放的相應(yīng)的Ag+對AL細(xì)胞的增殖抑制作用在低濃度時(shí)(小于1 μg·mL-1)與nAg相當(dāng)；而在高濃度時(shí)，nAg溶液中釋放的Ag+對細(xì)胞的增殖抑制作用遠(yuǎn)小于nAg.因此，在低劑量(小于1 μg·mL-1)時(shí)，nAg對細(xì)胞的增殖抑制作用主要來自于nAg釋放的Ag+；在高劑量(5 μg·mL-1)時(shí)，主要是nAg本身以及其釋放的Ag+共同對AL細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制作用.有研究報(bào)道，PVP 包被nAg暴露于人單核細(xì)胞系THP-1中，并以硝酸銀作對照，發(fā)現(xiàn)nAg和Ag+都能誘導(dǎo)細(xì)胞損傷[16]，這與筆者實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致.

為了探討其機(jī)制，筆者進(jìn)一步研究了不同濃度nAg和Ag+對AL細(xì)胞活性自由基RNS/ROS產(chǎn)生的影響.通過分析發(fā)現(xiàn)，nAg導(dǎo)致的胞內(nèi)RNS的升高主要來源于其釋放的Ag+；而對ROS分析發(fā)現(xiàn)，低劑量情況下nAg誘導(dǎo)的胞內(nèi)ROS的升高主要來源于其釋放的Ag+，而高劑量情況下，nAg導(dǎo)致的胞內(nèi)ROS的升高主要來源于nAg本身.因此，推測在低濃度情況下，nAg對AL細(xì)胞活力的抑制主要來自于nAg釋放的Ag+，而Ag+誘導(dǎo)了胞內(nèi)RNS的產(chǎn)生，這在抑制細(xì)胞活力時(shí)產(chǎn)生了一定作用；在高濃度情況下，nAg對AL細(xì)胞活力的抑制主要來自于Ag+誘導(dǎo)的RNS和nAg本身誘導(dǎo)的ROS二者共同的作用.5 μg·mL-1nAg的AL細(xì)胞較高增殖的抑制作用，可能是nAg在高暴露時(shí)主要是通過氧化應(yīng)激反應(yīng)，特別是ROS的升高的機(jī)制使AL細(xì)胞產(chǎn)生較大損傷，細(xì)胞活力降低；另一方面，高劑量nAg釋放的Ag+以及低劑量的nAg的暴露下，ROS的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激反應(yīng)比高劑量的nAg低，可能是由于Ag+及低劑量的nAg還可能通過其他機(jī)制如干擾細(xì)胞內(nèi)生物分子的功能及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，參與更廣泛的生物學(xué)過程從而使對細(xì)胞增殖抑制作用減弱.已有的研究也發(fā)現(xiàn)[17-18]，納米銀和細(xì)胞接觸后，通過多種途徑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生ROS，誘發(fā)氧化毒性，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡，nAg與其釋放的Ag+共同發(fā)揮毒性作用，但是存在的致毒機(jī)制可能不同，納米銀高劑量和低劑量暴露引起的生物毒性效應(yīng)不同且相應(yīng)的致毒機(jī)制也不完全相同.

筆者探討了nAg和環(huán)境因子FA與nAg的協(xié)同作用下AL細(xì)胞活力的變化、RNS/ROS的變化及兩者之間的關(guān)系.首先發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A與nAg協(xié)同作用時(shí)，可以在一定程度上降低nAg對細(xì)胞增殖的抑制作用.FA與nAg的協(xié)同作用對AL細(xì)胞活力的毒性影響小于nAg、Ag+對AL細(xì)胞活力的毒性影響.由于FA具有參與吸附、絡(luò)合作用的官能團(tuán)，金屬離子可以和官能團(tuán)發(fā)生多種反應(yīng)[19-20].因此，推測FA能夠吸附、絡(luò)合nAg及Ag+，使nAg和Ag+的濃度降低，從而降低AL細(xì)胞胞內(nèi)RNS和ROS的產(chǎn)生.因?yàn)楦焕锼?FA)是自然界有機(jī)物降解的基本產(chǎn)物，代表天然的一大部分有機(jī)物(NOM)并且是自然水中主要有機(jī)成分[21].另一方面，2015年，Gunsolus等[22]研究也發(fā)現(xiàn)，這些有機(jī)物與nAg具有高親和性，當(dāng)有機(jī)物富含硫/氮化合物時(shí)，會(huì)很大程度地增加nAg的穩(wěn)定性，大量降低nAg釋放Ag+的量并能很大程度地降低nAg的殺菌能力.因此，有關(guān)環(huán)境因子富里酸(FA)與nAg的協(xié)同作用的研究具有重要意義.

綜上所述，nAg、Ag+對AL細(xì)胞有增殖抑制的毒性作用，而FA能夠顯著降低nAg對細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng).這可能是由于FA吸附、絡(luò)合nAg及Ag+，在一定程度上消除氮自由基和氧自由基的形成，引起氮自由基和氧自由基的降低，從而降低了nAg的細(xì)胞毒性.天然腐殖質(zhì)在水體中普遍存在,nAg又是水體中的污染物，水環(huán)境中nAg和富里酸相互作用所引起的細(xì)胞毒性發(fā)生變化，此結(jié)論對于人工納米材料環(huán)境安全性的評價(jià)理論和數(shù)據(jù)分析提供了一定的參考價(jià)值，對于深入理解人工納米材料的環(huán)境過程、環(huán)境安全性評估具有一定的作用.

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(責(zé)任編輯 于 敏)

Effect of silver nanoparticles and FA on the proliferation and RNS/ROS production of ALcells

WANG Ziru1,2,XU Shengmin2,WU Lijun1,2*

(1.School of Environmental Science and Optoelectronic Technology,University of Science and Technology of China,Hefei 230026,China;2.Key Laboratory of Environmental Toxicology and Pollution Control Technology of AnhuiProvince,Hefei Institutes of Physical Science,Chinese Academy of Sciences,Hefei 230031,China)

Using ALamar Blue assay and ROS/RNS fluorescent probe,we studied the cytotoxicity of silver nanoparticles (0.1-5 μg·mL-1nAg),silver ion (0.01-0.5 μg·mL-1Ag+) and nAg associated with fulvic acid (10 μg·mL-1FA) of Human-hamster hybrid ALcells in vitro.The results showed that silver ions released from nAg solution had much more effect on cell viability than nAg at low concentrations,and the inhibition was mainly through the induction of RNS by silver ions.However,at high concentrations nAg had much more effect on cell viability,and this inhibition was mainly due to the induction of RNS by silver ions and ROS by silver nanoparticles.The results also showed that FA could significantly recover the cellular viability decreased by silver nanoparticles and silver ion,as well as the induction of RNS/ROS.

silver nanoparticles;fulvic acid;RNS/ROS;proliferation inhibition

10.3969/j.issn.1000-2162.2016.06.014

2016-04-29

國家重大科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014CB932002)

王子茹(1988-)，女，安徽宿州人，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)碩士研究生； *吳李君(通信作者)，中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail:ljw@ipp.ac.cn.

R994.6

A

1000-2162(2016)06-0080-07